揭秘人類先天無痛癥的病理基礎(chǔ)—電壓門控鈉通道Nav 1.7在人類痛覺中的功能作用

1.研究背景

編碼電壓門控鈉通道 (VGSC) NaV1.7的SCN9A的雙等位基因突變失活，會(huì)導(dǎo)致人類先天無痛癥(congenital insensitivity to pain, CIP) 的臨床表型。CIP病人對(duì)有害刺激不會(huì)感知到疼痛，無論是機(jī)械的、熱的還是化學(xué)物質(zhì)的刺激模態(tài)。相反地，NaV1.7功能獲得型的突變已被證明會(huì)導(dǎo)致諸如人類遺傳性紅斑肢痛癥 (inherited erythromelalgia) 和陣發(fā)性極度疼痛癥 (paroxysmal extreme pain disorder) 等孟德爾遺傳疾病。最近發(fā)現(xiàn)NaV1.7功能獲得型突變也與更為常見的如小纖維神經(jīng)病變和痛性糖尿病神經(jīng)病變等獲得性疼痛病有密切聯(lián)系。NaV1.7在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的傷害感受器神經(jīng)元和交感神經(jīng)元上高度富集表達(dá)，也在大腦皮層下的結(jié)構(gòu)中表達(dá)，包括丘腦、內(nèi)側(cè)杏仁核、下丘腦和嗅上皮投射到嗅球的軸突等。有趣的是，嗅覺缺失是NaV1.7的雙等位基因功能喪失型突變的唯一其他臨床特征。這些發(fā)現(xiàn)激起了人們對(duì)靶向調(diào)控NaV1.7來開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥的強(qiáng)烈興趣。

目前，研究人員已經(jīng)啟動(dòng)了多個(gè)靶向調(diào)控NaV1.7的藥物開發(fā)計(jì)劃，包括小分子阻滯劑和生物學(xué)方法。對(duì)于藥物開發(fā)來說，選擇性靶向NaV1.7通道是必需的。但是，由于不同VGSC亞型的高度同源性，所以選擇性靶向NaV1.7通道變得非常有挑戰(zhàn)性。目前，VGSC的非特異性阻斷劑（如一些抗驚厥藥物）常用作鎮(zhèn)痛藥。然而，無選擇地靶向多個(gè)VGSC通常會(huì)在心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中導(dǎo)致明顯的劑量限制性的不良反應(yīng)。目前，缺乏對(duì)CIP的基礎(chǔ)病理機(jī)制的了解是鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵障礙。人們尚未明確CIP病理發(fā)生的確切部位，而這對(duì)于確定新型NaV1.7阻斷劑是否需要穿過血腦屏障具有重要意義。人們也不清楚阻斷NaV1.7對(duì)感覺神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能的發(fā)育是否存在影響，從而造成即使采用高效的急性藥理學(xué)阻斷的方法也無法復(fù)制CIP的臨床表型的原因。

在嚙齒類動(dòng)物中，NaV1.7表達(dá)在初級(jí)感覺神經(jīng)元的外周末端、軸突、胞體和中樞末端。目前，人們已經(jīng)制作出全身性敲除或在部分感覺神經(jīng)元中條件性敲除NaV1.7的突變小鼠模型。在行為學(xué)測(cè)試中，這些小鼠對(duì)有害熱刺激、機(jī)械刺激和化學(xué)刺激產(chǎn)生的退縮反射行為有所降低（盡管在某些情況下并不完全缺失）。有趣的是，看起來并非所有的疼痛行為（如熱痛覺過敏）的減輕都是外周感覺神經(jīng)元自主介導(dǎo)的，其也有可能涉及與交感神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用。在感覺神經(jīng)元中條件性敲除NaV1.7的小鼠也表現(xiàn)出神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛降低的行為學(xué)表型。此外，在全身性敲除NaV1.7的小鼠中，傷害感受器對(duì)皮膚的神經(jīng)支配也是正常的。

研究人員已經(jīng)對(duì)上述這種的行為表型提出許多并不互斥的機(jī)制來加以解釋。在外周傷害感受器末端，NaV1.7的通道動(dòng)力學(xué)特性使其作為閾值通道，能夠行使對(duì)微小信號(hào)進(jìn)行放大的職能，并提示NaV1.7在動(dòng)作電位發(fā)生中扮演關(guān)鍵角色。NaV1.7對(duì)動(dòng)作電位沿軸突的傳導(dǎo)也可能是必要的。此外，在感覺神經(jīng)元的中樞末端，NaV1.7也可能以一種類似于嗅覺系統(tǒng)的方式來調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。最后，NaV1.7可能與其他信號(hào)系統(tǒng)也有密切聯(lián)系，例如內(nèi)源性阿片系統(tǒng)。內(nèi)源性阿片類物質(zhì)在NaV1.7功能缺失的條件下表達(dá)上調(diào)，并反過來抑制背根神經(jīng)節(jié) (DRG)神經(jīng)元胞體末端的興奮性。

目前，人們?nèi)匀恍枰獙?duì)CIP病人的軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙更好地進(jìn)行研究和表征。在嚙齒類動(dòng)物DRG神經(jīng)元中，緩慢的膜去極化會(huì)觸發(fā)由NaV1.7激活所驅(qū)動(dòng)的興奮性斜坡電流，這是由于通道的慢閉合狀態(tài)失活所產(chǎn)生的。研究者認(rèn)為這些電流對(duì)微小的閾下去極化刺激進(jìn)行放大起重要作用，從而增加神經(jīng)元爆發(fā)動(dòng)作電位的可能性。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，健康捐獻(xiàn)者遺體的人源DRG細(xì)胞缺乏低閾值的興奮性斜坡電流。研究者對(duì)人源NaV1.7的藥理學(xué)工具藥的通道選擇性提出了質(zhì)疑，但無法獲得NaV1.7缺失的神經(jīng)元來最終明確這一點(diǎn)。他們提出，人源DRG神經(jīng)元中NaV1.7的表達(dá)可能相對(duì)缺乏。進(jìn)而提出盡管NaV1.7對(duì)嚙齒類動(dòng)物的河豚毒素 (TTX) 敏感鈉電流有重要貢獻(xiàn)，但在人類中的情況卻可能并非如此。但是，另一項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaV1.7的mRNA是人源DRG組織中主要表達(dá)VGSC的基因之一，這與上述結(jié)果相悖。

最近，人們已經(jīng)發(fā)展了用于研究人類傷害感受系統(tǒng)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)技術(shù)。本文作者采用了一種多模式技術(shù)方法，包括感覺分析、顯微神經(jīng)造影術(shù)、功能性腦成像、利用人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (iPSC) 模型并與基因組編輯相結(jié)合的方法等，來詳細(xì)描述NaV1.7在人類傷害性感受系統(tǒng)中的功能作用。

2.研究結(jié)果

（1）CIP病人的感覺特征分析：本文作者招募了3名CIP病人來對(duì)其感覺神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。所有受試者SCN9A基因均已被確認(rèn)含有雜合突變，并預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的功能喪失。3名受試者均報(bào)告了自己從童年開始遭受的多次無痛性受傷，包括無痛性骨折。在臨床檢查中，研究者發(fā)現(xiàn)了3名受試者的嗅覺缺失，并感覺不到針刺痛的感覺，因此符合典型的SCN9A基因突變相關(guān)的CIP臨床表現(xiàn)。定量感覺測(cè)試(QST) 發(fā)現(xiàn)，受試者對(duì)于有害的溫度刺激和機(jī)械刺激都沒有感覺到疼痛，也證實(shí)他們對(duì)疼痛不敏感。與德國神經(jīng)疼痛協(xié)會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)參考值相比，受試者手和腳的冷暖檢測(cè)閾值降低，熱感覺閾值也受損，表明熱感覺遲鈍，但機(jī)械覺和振動(dòng)覺的檢測(cè)閾值正常。因此，QST數(shù)據(jù)顯示受試者的大纖維功能基本正常，而小纖維功能受損。

在局部施加致痛劑或致癢劑可激活皮膚中化學(xué)敏感性C纖維并誘導(dǎo)神經(jīng)肽的釋放，引起神經(jīng)源性的發(fā)紅反應(yīng) (Flare) 并導(dǎo)致疼痛或癢覺。在CIP病人的前臂和手掌表面施用組胺和芥末油可引起發(fā)紅反應(yīng)。但是，受試者沒有報(bào)告自己有疼痛或瘙癢的感覺。而健康對(duì)照組報(bào)告施加芥末油時(shí)均出現(xiàn)強(qiáng)烈的“刺痛”和“灼痛”感。在用離子電滲法施加組胺之前就使用局部麻醉劑，組胺引起的發(fā)紅反應(yīng)消失，表明該反應(yīng)是由神經(jīng)活動(dòng)所介導(dǎo)。結(jié)果表明，至少CIP病人尚存在一些對(duì)有害刺激有反應(yīng)的皮膚神經(jīng)纖維，可以在此過程中產(chǎn)生小范圍的動(dòng)作電位。

除了一名受試者外，其他受試者下肢的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)參數(shù)均在標(biāo)準(zhǔn)參考范圍內(nèi)。這名受試者的腓腸感覺神經(jīng)的動(dòng)作電位的振幅較小。由于該受試者下肢先前曾遭受多處傷害，因此進(jìn)行神經(jīng)纖維記錄變得非常困難，而動(dòng)作電位振幅的降低可能是由于過去的創(chuàng)傷所致。因此除了這名受試者，功能性神經(jīng)生理學(xué)評(píng)估未發(fā)現(xiàn)CIP病人大纖維功能的任何異常。參照年齡和性別匹配的標(biāo)準(zhǔn)參考數(shù)據(jù)，本研究所有受試者小腿的表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度 (IENFD) 的測(cè)量值低于第一四分位的5%。但是，在所有受試者的皮膚中的確觀察到了更深的真皮神經(jīng)纖維的分布。因此，IENFD的測(cè)量結(jié)果提供了CIP病人發(fā)生小纖維病變的證據(jù)。此外，還觀察到所有受試者的大腿近端表皮內(nèi)神經(jīng)纖維的缺失或明顯減少。

（2）CIP病人SCN9A基因突變對(duì)NaV1.7通道功能的影響：本文作者將新發(fā)現(xiàn)的NaV1.7的突變體在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，并使用全細(xì)胞膜片鉗記錄來評(píng)估其對(duì)NaV1.7通道生物物理學(xué)特征的影響。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的全細(xì)胞電壓鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有的突變都大大降低了NaV1.7電流。FS1773的突變導(dǎo)致NaV1.7通道電流密度產(chǎn)生8倍的降低。R896W、R830X和G1725R的突變導(dǎo)致電流密度降低到可忽略不計(jì)，提示這些突變導(dǎo)致其嚴(yán)重的功能喪失。由此可知，與對(duì)照相比，所有CIP病人的NaV1.7突變都會(huì)導(dǎo)致NaV1.7通道的電導(dǎo)顯著降低，這與通道功能幾乎完全喪失的觀察是一致的。

（3）顯微神經(jīng)造影術(shù)顯示CIP病人C纖維型傷害性感受器缺失：本文作者記錄并分析了來自3個(gè)受試者的共38根C纖維（來自1號(hào)CIP病人的4個(gè)神經(jīng)內(nèi)位點(diǎn)的14根纖維，來自2號(hào)CIP病人的3個(gè)神經(jīng)內(nèi)位點(diǎn)的7根纖維和來自3號(hào)CIP病人的6個(gè)神經(jīng)內(nèi)位點(diǎn)的17根纖維）。這些記錄都未能鑒定出與C-傷害性感受器神經(jīng)元性質(zhì)一致的纖維類型。不同神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速率的活動(dòng)依賴的衰減(ADS)現(xiàn)象出現(xiàn)的不同頻率為：I型（代表C型感受器）(0%)，II型（代表熱感受器）(26.3%)，III型（代表低閾值C機(jī)械感受器）(13.2%)和IV型（交感性傳出纖維）(60.5%)。用2 Hz刺激期間，所有神經(jīng)內(nèi)位點(diǎn)均顯示具有“平臺(tái)”單位的ADS現(xiàn)象。由于缺乏I型纖維，這種感覺傳入纖維類型的頻率與健康人的正常參考數(shù)據(jù)存在顯著差異。因此，代表了C-傷害性感受器神經(jīng)元存在的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速率的ADS現(xiàn)象，在CIP病人是明顯缺乏的。記錄的三種C纖維類型傳導(dǎo)速率的ADS現(xiàn)象與先前記錄的ADS數(shù)據(jù)沒有顯著差異。

（4）辣椒素誘發(fā)的腦區(qū)激活水平在CIP病人顯著降低：盡管CIP病人具有明顯的臨床表型，但先前的研究未能發(fā)現(xiàn)CIP病人對(duì)急性傷害性機(jī)械刺激產(chǎn)生的腦活動(dòng)與健康對(duì)照組的差異。但是，該研究中用于比較的方法學(xué)受到了質(zhì)疑，這使得該研究結(jié)論的正確性變得撲朔迷離。

在一名愿意進(jìn)行功能性腦成像的2號(hào)CIP病人上，本文作者使用動(dòng)脈自旋標(biāo)記成像法研究其對(duì)辣椒素誘發(fā)急性疼痛的大腦反應(yīng)。這種方法排除了機(jī)械刺激的干擾，從而有效避免了先前存在的數(shù)據(jù)分析和整合的問題。用1%的辣椒素軟膏處理健康受試者(HC)的皮膚引發(fā)疼痛反應(yīng)，而在CIP病人未能引起類似的反應(yīng)。CIP病人在測(cè)試的任何實(shí)驗(yàn)條件下都沒有報(bào)告任何疼痛和不適感。這與HC組的結(jié)果正相反，辣椒素刺激和熱刺激在HC組產(chǎn)生疼痛體驗(yàn)。在HC組，初級(jí)和次級(jí)軀體感覺皮層、背外側(cè)前額葉皮層、島葉（前、中、后）、前扣帶回、殼核、伏隔核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和小腦中都觀察到腦血流量 (CBF) 顯著增加。而在CIP病人，大腦對(duì)“熱+辣椒素”的反應(yīng)與“休息”狀態(tài)的唯一區(qū)別是在初級(jí)軀體感覺皮層、背側(cè)前扣帶回和后扣帶回中觀察到CBF的增加。為了確認(rèn)CIP組與HC組辣椒素誘發(fā)的熱痛狀態(tài)下觀察到的腦血流量變化與獨(dú)特的知覺體驗(yàn)有關(guān)，本文作者將神經(jīng)病學(xué)痛特征(NPS) 引入并應(yīng)用于這些數(shù)據(jù)分析。NPS是加權(quán)的多變量腦激活圖譜分析，與實(shí)驗(yàn)性疼痛的程度密切相關(guān)，故可以用于成像數(shù)據(jù)分析以預(yù)測(cè)掃描期間可能經(jīng)歷的疼痛嚴(yán)重程度。對(duì)于每個(gè)受試者，NPS的結(jié)果是通過將NPS的點(diǎn)積 (dot product) 與“熱+辣椒素＞靜止”狀態(tài)的對(duì)比圖像相乘而得出的。對(duì)于CIP病人而言，NPS的結(jié)果是根據(jù)“熱量+辣椒素＞靜止”狀態(tài)的六個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值生成的。對(duì)于HC組而言，NPS是根據(jù)12位受試者的一次掃描的平均值得出。與CIP組相比，在HC中觀察到的NPS值的波動(dòng)明顯更大。實(shí)際上，辣椒素引起的急性熱痛敏產(chǎn)生的腦活動(dòng)NPS值在CIP病人沒有重疊，而在HC組的有重疊。

（5）NaV1.7在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中富集表達(dá)，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的神經(jīng)元部位：人iPSCs定向分化為傷害性感受器神經(jīng)元可以作為功能模擬的平臺(tái)在體外研究CIP發(fā)病機(jī)理，并且對(duì)NaV1.7在人傷害感受器的生理功能提供重要發(fā)現(xiàn)。本文作者使用了先前描述的定向分化方案，培養(yǎng)生成了表達(dá)Brn3a（感覺神經(jīng)元標(biāo)記物）的高純度神經(jīng)元。分化成熟的iPSC傷害感受器神經(jīng)元與人初級(jí)感覺神經(jīng)元在分子水平上具有相似性，體現(xiàn)在其能夠?qū)τ泻Υ碳ぷ龀龊侠矸磻?yīng)，并具有成熟神經(jīng)元的電生理學(xué)特性。本文作者進(jìn)一步通過RNA測(cè)序證實(shí)了iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的分子特性。主成分分析表明，iPSC傷害性感受器神經(jīng)元與先前發(fā)表的研究結(jié)果以及hDRG組織的數(shù)據(jù)具有良好的聚類關(guān)系。與其他組織相比，iPSC傷害性感受器神經(jīng)元具有高度相似的DRG神經(jīng)元的分子特征（由hDRG組織數(shù)據(jù)中的富集基因組成）。本文作者也發(fā)現(xiàn)SCN9A的表達(dá)水平很高且與hDRG組織數(shù)據(jù)相似。然后，試圖檢查NaV1.7蛋白在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中的亞細(xì)胞分布情況。鑒于靶向人源NaV1.7通道的市售抗體質(zhì)量不佳，而阻礙了研究者對(duì)NaV1.7通道準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位。因此，本文作者決定使用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)來標(biāo)記內(nèi)源性NaV1.7，將高度抗原性的抗原決定簇標(biāo)簽血凝素(HA)框內(nèi)敲入一個(gè)SCN9A等位基因C末端，用來標(biāo)記所有的NaV1.7轉(zhuǎn)錄本的功能性編碼產(chǎn)物。

本文作者檢查了iPSC分化后NaV1.7表達(dá)的時(shí)程變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元分化成熟過程中，NaV1.7蛋白的表達(dá)和定位存在顯著差異。NaV1.7在培養(yǎng)的iPSC細(xì)胞中并不表達(dá)，但在成熟的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中高度富集表達(dá)。在體外培養(yǎng)25天的未成熟的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中觀察到NaV1.7的表達(dá)水平很低，且NaV1.7蛋白質(zhì)表達(dá)在胞體并集中在核周半環(huán)結(jié)構(gòu)（即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。與之相比，在體外培養(yǎng)60天后成熟的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中，觀察到NaV1.7顯著富集表達(dá)在細(xì)胞膜表面和整個(gè)軸突。先前報(bào)道NaV1.7可定位在嚙齒動(dòng)物DRG神經(jīng)元的軸突末端。與此一致的是，染色結(jié)果顯示iPSC傷害性感受器神經(jīng)元末端富集表達(dá)NaV1.7。先前發(fā)現(xiàn)與大鼠施萬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，iPSC傷害性感受器神經(jīng)元可以在體外有效地被髓鞘化。在揭示了無髓鞘的人傷害感受器神經(jīng)元中NaV1.7豐富表達(dá)后，接下來研究了在有髓鞘的共培養(yǎng)體系中NaV1.7的亞細(xì)胞定位情況。觀察到NaV1.7表達(dá)定位于有髓鞘軸突中的90%以上的郎飛結(jié)中（該結(jié)節(jié)由MBP蛋白的表達(dá)來區(qū)分和界定）。在培養(yǎng)體系中存在的未成熟的郎飛結(jié)，NaV1.7通道分布集中但明顯拉長，這與郎飛結(jié)旁組織富集VGSC到郎飛結(jié)的作用一致。在體內(nèi)，C纖維與非髓鞘形成的施萬細(xì)胞結(jié)合形成Remak纖維束。因此，還研究了在未誘導(dǎo)髓鞘形成的共培養(yǎng)體系中，施萬細(xì)胞對(duì)NaV1.7定位的影響。NaV1.7定位在與非髓鞘形成的施萬細(xì)胞相平行的軸突上。這與沒有施萬細(xì)胞存在的情況下相類似。這些結(jié)果表明，NaV1.7高表達(dá)在iPSC傷害感受器神經(jīng)元中，并被適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)運(yùn)至極化的神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。

（6）NaV1.7調(diào)控iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的興奮性：為了探索NaV1.7參與傷害性感受器神經(jīng)元的生理功能，本文作者從健康人和CIP病人中獲得了iPSC傷害性感受器神經(jīng)元。來源于1號(hào)CIP病人的2個(gè)克隆 (cCIP1.1和cCIP1.2) 和2號(hào)CIP病人產(chǎn)生的1個(gè)克隆 (cCIP2)，來源于健康人的3個(gè)克隆 (HC1、HC2和HC3) 用作對(duì)照。人類和嚙齒動(dòng)物的傷害性感受器神經(jīng)元在動(dòng)作電位的下降相表現(xiàn)出“彎曲”現(xiàn)象。因此，為了選擇性記錄成熟的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元，只記錄了表現(xiàn)出該特征的神經(jīng)元的動(dòng)作電位。在靜息狀態(tài)時(shí)，健康人和CIP病人的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的生物物理特性（包括膜電位）沒有顯著差異。在評(píng)估放電性質(zhì)時(shí)，CIP病人來源的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的興奮性低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，CIP病人來源的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元需要更大的電流刺激才能產(chǎn)生一個(gè)動(dòng)作電位，并且持續(xù)(500 ms)閾上去極化刺激所產(chǎn)生的動(dòng)作電位數(shù)目更少些。為了確認(rèn)所觀察到的神經(jīng)元興奮性降低是由于NaV1.7功能的喪失所致，使用CRISPR- Cas9糾正了CIP1.2克隆的一個(gè)SCN9A的等位基因，將c2488c ＞ t的突變糾正為野生型基因序列。與CIP1.2克隆相比，糾正后的克隆細(xì)胞顯示出基強(qiáng)度變小，并達(dá)到與健康對(duì)照組類似的情況。而基因糾正并不能逆轉(zhuǎn)持續(xù)閾上去極化刺激所產(chǎn)生的動(dòng)作電位減少的現(xiàn)象。這些結(jié)果與CIP病人隱性遺傳的性質(zhì)一致，但也表明SCN9A的兩個(gè)功能性拷貝是神經(jīng)元維持持續(xù)重復(fù)性放電所必需的。

為了研究不依賴于CIP病人之間遺傳背景的NaV1.7的功能作用，本文作者將純合的SCN9A移碼突變(N842X) 引入到健康對(duì)照組的iPSC (HC1)細(xì)胞，產(chǎn)生了NaV1.7敲除的品系 (NaV1.7 KO) 。這個(gè)新的突變?cè)谕ǖ赖慕Y(jié)構(gòu)域II過早地產(chǎn)生了終止密碼子，使SCN9AmRNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生無義突變而導(dǎo)致降解。NaV1.7 KO的iPSC傷害感受器神經(jīng)元復(fù)制了在CIP組中觀察到的興奮性改變的表型，包括基強(qiáng)度的增加和閾上刺激誘發(fā)重復(fù)放電頻率的降低。最近有報(bào)告提出，NaV1.7功能喪失而產(chǎn)生CIP的表型至少部分是由于內(nèi)源性阿片類藥物（特別是前腦啡肽PENK）的上調(diào)所導(dǎo)致。在該研究中發(fā)現(xiàn)，納洛酮（一種阿片類藥物拮抗劑）可以反轉(zhuǎn)一名CIP病人無痛的臨床表現(xiàn)。本文作者測(cè)試了納洛酮能否使NaV1.7 KO品系的神經(jīng)元低興奮性實(shí)現(xiàn)正?；?，發(fā)現(xiàn)納洛酮不影響NaV1.7 KO神經(jīng)元的興奮性的參數(shù)，從而表明阿片樣物質(zhì)的上調(diào)并不參與調(diào)節(jié)NaV1.7 KO神經(jīng)元低興奮性的表型。與此一致的是，qPCR分析發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組或NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中未檢測(cè)到PENK的mRNA。RNA測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的iPSC傷害感受器也未檢測(cè)到PENK的mRNA的表達(dá)。全細(xì)胞電壓鉗記錄結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NaV1.7 KO的神經(jīng)元的電壓門控鈉電流的峰值降低了23.89%，這一發(fā)現(xiàn)與小鼠中NaV1.7對(duì)小直徑傷害性感受器神經(jīng)元中的電壓門控鈉電流的貢獻(xiàn)相一致。傷害性感受器神經(jīng)元的外周末端受到刺激很可能會(huì)產(chǎn)生感受器電位，導(dǎo)致膜電位緩慢地去極化。NaV1.7通道展示了緩慢的關(guān)閉狀態(tài)失活特征，這使通道能夠打開繼而響應(yīng)斜坡去極化并且啟動(dòng)動(dòng)作電位的生成。為了探討NaV1.7在神經(jīng)元響應(yīng)緩慢的去極化刺激中所起作用，以漸增梯度注入閾上斜坡電流，以模擬感受器電位。NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元對(duì)斜坡電流去極化刺激（特別是對(duì)較慢刺激）的反應(yīng)明顯較遲鈍。CIP病人來源的iPSC傷害感受器神經(jīng)元與對(duì)照組相比反應(yīng)也較慢。這些結(jié)果證實(shí)了NaV1.7在iPSC傷害感受器神經(jīng)元調(diào)節(jié)興奮性狀態(tài)中的作用。先前報(bào)道NaV1.7功能獲得性突變與體外感覺神經(jīng)元的神經(jīng)突生長的改變有關(guān)。鑒于在CIP病人中發(fā)現(xiàn)皮膚IENFD降低的現(xiàn)象，所以試圖驗(yàn)證缺乏NaV1.7的iPSC傷害感性受器神經(jīng)元是否存在神經(jīng)突生長缺陷的問題。成熟的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元在其培養(yǎng)階段會(huì)發(fā)育產(chǎn)生大量的神經(jīng)突起。本文作者量化了這些神經(jīng)突起所覆蓋的面積，發(fā)現(xiàn)NaV1.7敲除后iPSC傷害性感受器神經(jīng)元與對(duì)照組之間沒有顯著差異。與嚙齒動(dòng)物DRG相似的是，當(dāng)iPSC傷害性感受器神經(jīng)元被機(jī)械打散時(shí)，會(huì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)再生出神經(jīng)突起。與對(duì)照組相比，缺乏功能性NaV1.7的傷害感受器 (CIP和NaV1.7 KO) 神經(jīng)元打散12 h后，產(chǎn)生的神經(jīng)突起的投射覆蓋的面積與對(duì)照組類似。在神經(jīng)突起發(fā)育完全的神經(jīng)元中，各組之間的神經(jīng)突起平均長度也沒有差異。這些結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)條件下，NaV1.7功能的喪失不會(huì)對(duì)神經(jīng)元內(nèi)在的神經(jīng)突起的生長產(chǎn)生影響。

（7）NaV1.7 KO的iPSC細(xì)胞可作為止痛藥物篩選的平臺(tái)：鑒于SCN9A功能喪失型基因突變與CIP病人之間的遺傳聯(lián)系，研發(fā)NaV1.7的特異性抑制劑已成為制藥公司尋求生產(chǎn)新型鎮(zhèn)痛藥的主要目標(biāo)之一。本文作者認(rèn)為，NaV1.7 KO的iPSC細(xì)胞可以作為一個(gè)篩選NaV1.7特異性抑制劑的平臺(tái)。BII074是一種狀態(tài)依賴性的鈉通道阻斷劑，認(rèn)為其可能對(duì)NaV1.7具有亞型選擇性。最近研究證明，BII074在臨床上是安全的且對(duì)三叉神經(jīng)痛病人有一定療效。BII074（在與臨床相關(guān)的濃度范圍內(nèi)）劑量依賴性地增加了神經(jīng)元基強(qiáng)度，并降低了對(duì)對(duì)照組iPSC傷害感受器的慢斜坡去極化刺激的反應(yīng)，這與其NaV1.7的阻斷作用相一致。濃度為2～10 μM的BII074（在BII074治療的病人血漿中的濃度范圍）對(duì)NaV1.7 KO神經(jīng)元的基強(qiáng)度沒有影響。但是，在BII074的濃度適當(dāng)增加（25 μM）的情況下BII074對(duì)NaV1.7的選擇性消失，表明BII074在該濃度下可調(diào)節(jié)其它非NaV1.7通道，從而影響神經(jīng)元的興奮性。在體外實(shí)驗(yàn)中，BII074優(yōu)先抑制高頻刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元放電，這種情況可能發(fā)生在陣發(fā)性疼痛發(fā)作期間（例如在三叉神經(jīng)痛病人中經(jīng)常被報(bào)道）。本文作者在以20 Hz注入150%基強(qiáng)度的電流階躍，并檢測(cè)了去極化激發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力。鑒于NaV1.7從失活中恢復(fù)得很緩慢，因此其不太可能在該頻率刺激誘發(fā)動(dòng)作電位中發(fā)揮作用。BII074劑量依賴性地阻斷了對(duì)照組以及NaV1.7 KO神經(jīng)元的高頻放電。該結(jié)果表明，在NaV1.7缺乏的情況下，BII074依然能抑制神經(jīng)元的放電。這提示在此濃度下，BII074還“脫靶”作用于其他靶標(biāo)。

PF-05089771是一種芳基磺酰胺類的NaV1.7的強(qiáng)效抑制劑，并正在進(jìn)行糖尿病性神經(jīng)痛和遺傳性紅斑肢痛病的臨床試驗(yàn)。在體外使用PF-05089771的濃度為接受治療的病人中測(cè)得的血漿中游離的PF-05089771的濃度。PF-05089771增加了對(duì)照組傷害性感受器神經(jīng)元的基強(qiáng)度，而對(duì)NaV1.7 KO傷害性感受器神經(jīng)元的基強(qiáng)度沒有影響。PF-05089771在任何測(cè)試劑量下均不影響兩組神經(jīng)元的高頻放電。該結(jié)果表明，PF-05089771在功能水平上對(duì)iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的興奮性的作用依賴于NaV1.7。

3.討論

本文作者發(fā)現(xiàn)，CIP病人的無痛表型不僅由于傷害性感受器神經(jīng)元的興奮性低下，而且由于這些傳入感覺纖維發(fā)生了重要的結(jié)構(gòu)變化。在細(xì)胞學(xué)水平上，使用人iPSC來源的傷害感受器神經(jīng)元對(duì)CIP進(jìn)行了機(jī)制研究。結(jié)果顯示，NaV1.7定位于傷害感受器神經(jīng)元的特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性中至關(guān)重要。證明了iPSC來源的傷害感受器神經(jīng)元平臺(tái)還有助于明確靶向NaV1.7的鎮(zhèn)痛化合物的選擇性問題。

本研究納入的CIP受試病人都是SCN9A突變的復(fù)合雜合子類型，均能導(dǎo)致NaV1.7電流的顯著降低。R896W、R830X和G1725R的突變可導(dǎo)致NaV1.7通道幾乎完全喪失功能，而位于通道C端的FS1773突變可導(dǎo)致NaV1.7電流密度降低8倍之多。先前研究的大多數(shù)CIP病人中， NaV1.7突變導(dǎo)致通道完全喪失功能。但是，最近另一篇論文也報(bào)道了許多與CIP相關(guān)的SCN9A的突變，還殘存一些鈉電流（盡管電流大幅降低）。FS1773等位基因與R830X配對(duì)作為復(fù)合雜合子，未觀察到電流。因此，在CIP病人體內(nèi)NaV1.7突變體幾乎不可能產(chǎn)生電流。

所有受試者的臨床表現(xiàn)均與雙等位基因SCN9A突變繼發(fā)的CIP表型相一致。他們?cè)谝簧卸紱]有疼痛體驗(yàn)，在定量感覺測(cè)試和給予致痛物質(zhì)也是一樣，并且他們的嗅覺缺失。受試者的感覺缺陷不僅限于疼痛感知，CIP受試者對(duì)溫暖或是對(duì)涼爽也不敏感，提示他們的熱感覺受損。這些感覺模態(tài)由C和Aδ纖維所介導(dǎo)。先前報(bào)道給CIP病人施加組胺后依然會(huì)有發(fā)紅反應(yīng)，本文也重復(fù)了這一發(fā)現(xiàn)。然而，以前沒有注意到的是，盡管神經(jīng)源性的紅腫反應(yīng)在CIP病人得以保留，但這種刺激并沒有引起CIP受試者產(chǎn)生癢的感覺。這可能反映了這樣一個(gè)事實(shí)，即致痛劑和致癢劑做出反應(yīng)的主要傳入感覺纖維有很大的重疊，其中大部分表達(dá)NaV1.7。在瘙癢行為的臨床前模型中，用抗體來阻斷NaV1.7功能的動(dòng)物對(duì)瘙癢的反應(yīng)較少。最近的一份報(bào)道介紹了在成年后NaV1.7功能缺失，導(dǎo)致其對(duì)組胺和氯喹刺激引起的瘙癢行為消失。而大直徑纖維介導(dǎo)的感覺模態(tài)（例如振動(dòng)和輕觸覺）的檢測(cè)在CIP病人則是正常的。

本文作者進(jìn)行了許多電生理學(xué)測(cè)試來研究NaV1.7突變對(duì)體內(nèi)感覺神經(jīng)功能的影響。VGSC突變以及與VGSC結(jié)合的藥物和毒素可改變?nèi)松窠?jīng)元的興奮性參數(shù)。因此，進(jìn)行了感覺神經(jīng)興奮性測(cè)試，但未發(fā)現(xiàn)CIP病人有任何明顯變化。造成這種情況的可能原因是感覺神經(jīng)動(dòng)作電位（用作閾值跟蹤的測(cè)量指標(biāo)）主要由大直徑有髓鞘神經(jīng)所介導(dǎo)。但在嚙齒動(dòng)物中，據(jù)報(bào)道只有15%的中等直徑和大直徑有髓鞘DRG神經(jīng)元是NaV1.7免疫陽性。此外，這些神經(jīng)元還表達(dá)其他TTX敏感的VGSC（如NaV1.1和NaV1.6）。這一發(fā)現(xiàn)表明，在NaV1.7阻斷劑的臨床試驗(yàn)中，神經(jīng)興奮性參數(shù)不太可能成為有用的生物標(biāo)志物。因此，進(jìn)行了顯微神經(jīng)造影術(shù)，可以直接測(cè)試小直徑的感覺和交感神經(jīng)纖維、C纖維和Aδ纖維的活動(dòng)。

關(guān)于腓淺神經(jīng)的顯微神經(jīng)造影術(shù)的發(fā)現(xiàn)令人震驚。本文作者使用先前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，即自然激活和傳導(dǎo)速度的ADS現(xiàn)象，可以記錄和鑒定具有C和Aδ低閾值熱感受器特性的小直徑纖維以及交感傳出神經(jīng)。但是，在CIP病人沒有記錄到任何具有傷害性感受器神經(jīng)元特征的C纖維類型。在健康受試者中，使用相同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定的傷害性感受器神經(jīng)元的C纖維比例約占腓淺神經(jīng)所有C纖維的60%。重要的是，將電刺激施加在腓淺神經(jīng)的神經(jīng)支配區(qū)域作為搜索策略，因此排除了使用自然刺激產(chǎn)生的假設(shè)的“搜索偏見”。顯微神經(jīng)造影術(shù)未檢測(cè)到C型傷害性感受器神經(jīng)元的另一種可能的解釋是：實(shí)際存在的C纖維由于NaV1.7突變而無法被激活，故無法通過微神經(jīng)成像技術(shù)檢測(cè)到。該解釋與本研究在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的低興奮性的發(fā)現(xiàn)相一致。另一種可能的解釋是CIP病人在解剖學(xué)上缺乏C型傷害性感受器神經(jīng)元，這是在皮膚活檢實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為外周小纖維結(jié)構(gòu)在SCN9A突變引起的CIP病人中是正常的。先前的SCN9A突變病人的神經(jīng)活檢結(jié)果正常。研究者認(rèn)為這可以將SCN9A突變引起的CIP與由其他原因引起的CIP（如神經(jīng)生長因子NGF突變）區(qū)分開：NGF突變會(huì)導(dǎo)致傷害性感受器神經(jīng)元的發(fā)育嚴(yán)重退變。令本文作者驚訝的是，在所有3個(gè)SCN9A突變引起的CIP病人中，遠(yuǎn)側(cè)腿的表皮神經(jīng)支配明顯減少。這些CIP病人的IENFD遠(yuǎn)低于年齡和性別匹配的健康人的正常參數(shù)。先前2個(gè)病例報(bào)告中也顯示出了受試者在身體遠(yuǎn)端部位的IENFD減少。

IENFD減少的一種可能解釋是由于CIP病人先前身體受傷所致。因此，本文作者還從大腿部位進(jìn)行了皮膚活檢。身體近端大腿的神經(jīng)支配密度高于遠(yuǎn)端腿。在CIP病人中幾乎沒有觀察到表皮神經(jīng)纖維。但仍然可以觀察到真皮神經(jīng)纖維，結(jié)果提示，在人類中NaV1.7是傷害性感受器神經(jīng)元軸突遠(yuǎn)端末梢維持長期結(jié)構(gòu)完整性所必需的。最近的案例報(bào)告描述了在一位SCN9A突變導(dǎo)致CIP的年幼病人（2歲女孩）體內(nèi)，其IENFD已經(jīng)大幅降低。CIP病人IENFD的喪失可能是由于NaV1.7功能喪失導(dǎo)致神經(jīng)元在生命早期的死亡或者胚胎發(fā)生過程中正常C纖維型傷害性感受器神經(jīng)元的發(fā)育異常。本文的體外研究未能觀察到缺乏NaV1.7的iPSC傷害感受器神經(jīng)元神經(jīng)突起生長存在缺陷。然而，對(duì)內(nèi)源性傷害性感覺傳入纖維對(duì)表皮的支配需要復(fù)雜的環(huán)境和化學(xué)線索，且其軸突需要長距離投射。鑒于本文作者的培養(yǎng)系統(tǒng)中無法完全建立此類模型，因此，在這種情況下，不能排除NaV1.7缺失在上述過程中發(fā)揮作用。NaV1.7對(duì)IENFD減少的貢獻(xiàn)可能是由于神經(jīng)元的低興奮性或是該通道的非典型作用。

在人類中觀察到的結(jié)果與在NaV1.7基因缺陷小鼠中的結(jié)果不一致：在NaV1.7基因缺陷小鼠中，表皮的神經(jīng)支配是正常的。在人類（而非小鼠）中IENF缺失的原因一直還未找到。對(duì)此可能的解釋是，在這兩個(gè)物種之間，神經(jīng)活動(dòng)依賴的C纖維末梢結(jié)構(gòu)的維持機(jī)制可能會(huì)有所不同，特別是考慮到人類需要維持更長的軸突。

盡管CIP病人完全無痛，并且實(shí)際上其表皮幾乎完全失去神經(jīng)支配，但CIP病人依然存在正常的發(fā)紅反應(yīng)。發(fā)紅反應(yīng)是由于皮膚C纖維激活后導(dǎo)致軸突反射介導(dǎo)的神經(jīng)肽釋放到皮膚的毛細(xì)動(dòng)脈上所介導(dǎo)。如果所有的C纖維都已經(jīng)退化，那么將不會(huì)出現(xiàn)發(fā)紅反應(yīng)。CIP病人的發(fā)紅反應(yīng)依然得以保存的事實(shí)表明，至少在真皮內(nèi)缺乏NaV1.7的C纖維末端仍然可以維持短程動(dòng)作電位的傳播（且足以誘導(dǎo)神經(jīng)肽釋放），即使無法繼續(xù)向神經(jīng)干傳導(dǎo)信號(hào)。

這些在體實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)預(yù)示了在對(duì)CIP病人施加有害刺激后，從周圍傷害性感受器神經(jīng)元輸入到脊髓以及隨后到高級(jí)腦中樞的信號(hào)將顯著減少。在一個(gè)受試者中，本文作者使用動(dòng)脈旋轉(zhuǎn)標(biāo)記進(jìn)行了fMRI以驗(yàn)證這一假設(shè)。使用先前的方法，將致痛源（辣椒素和熱刺激）施加到腿部。這一操作在CIP病人中并未引起任何疼痛，但對(duì)于對(duì)照組受試者來說卻非常疼痛。研究者還在CIP受試者中的初級(jí)體感皮層、背前扣帶回和后扣帶回中觀察到CBF的升高。但是，對(duì)照組CBF在皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中更廣泛且顯著的增加，包括初級(jí)和次級(jí)的體感皮質(zhì)、背側(cè)前額葉皮層、島突、前扣帶回、殼狀核、伏隔核、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和小腦。NPS是一種基于功能性磁共振成像的測(cè)量方法，這一方法已被證明可以用來預(yù)測(cè)疼痛強(qiáng)度。使用NPS測(cè)的響應(yīng)值顯示，CIP病人的NPS反應(yīng)和辣椒素引起的急性熱痛覺過敏而產(chǎn)生的腦活動(dòng)之間沒有重疊。相比之下，對(duì)照組中強(qiáng)烈的NPS反應(yīng)反映出這些受試者的NPS和與疼痛相關(guān)的大腦活動(dòng)明顯重疊，這與人們強(qiáng)烈的疼痛體驗(yàn)密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)都是通過腦部掃描期間收集的疼痛報(bào)告所得到的。先前的一項(xiàng)研究將CIP病人與健康對(duì)照組進(jìn)行比較時(shí)，未發(fā)現(xiàn)在使用Neurosynth軟件識(shí)別的先定義的興趣優(yōu)先級(jí)區(qū)域內(nèi)血氧水平依賴性功能磁共振腦功能成像 (BOLD) 反應(yīng)的差異。然而，他們的方法遭到了來自方法學(xué)和有關(guān)數(shù)據(jù)整合的質(zhì)疑，這使得出的結(jié)論產(chǎn)生局限性。上述研究與本文作者的研究之間存在許多關(guān)鍵性差異，這些差異限制了將兩組研究結(jié)果直接相比較，包括腦成像方法、疼痛研究方式和所采用的分析流程的比較。至關(guān)重要的是，本文作者使用了局部應(yīng)用辣椒素來誘發(fā)疼痛。眾所周知，辣椒素通過選擇性激活傷害性感受器神經(jīng)元在對(duì)照組中會(huì)引起中度至重度疼痛，并且不會(huì)因低閾值機(jī)械性感受器的共同激活而產(chǎn)生干擾。本文作者得出結(jié)論，CIP病人中缺乏傷害性感受器神經(jīng)元驅(qū)動(dòng)的疼痛，并且與健康對(duì)照組有不同的腦激活方式。因此，該結(jié)果支持了作者的外周皮膚實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

為了更好地理解NaV1.7突變?nèi)绾斡绊懜杏X神經(jīng)元的興奮性問題，本文作者使用了iPSC傷害性感受器神經(jīng)元與基因編輯相結(jié)合的方法。首先研究了在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中NaV1.7的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位。NaV1.7沿著全長的軸突在細(xì)胞膜上大量表達(dá)，并在軸突末端結(jié)構(gòu)中富集表達(dá)。與先前嚙齒動(dòng)物中報(bào)道一致，NaV1.7也適當(dāng)?shù)囟ㄎ挥谟兴枨瘦S突郎飛結(jié)中。

與嚙齒動(dòng)物中NaV1.7 KO 的DRG研究結(jié)果一致的是，本文作者觀察到了來源于CIP病人的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的確是處于低興奮性狀態(tài)，表現(xiàn)在激活電流閾值的增加和閾上刺激誘發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放的降低。這些表型在NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中得以復(fù)制，并在來源于CIP病人的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中得以復(fù)制。在來源于CIP病人的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中，SCN9A的一個(gè)等位基因被基因組編輯糾正為野生型序列。有趣的是，在基因組編輯糾正的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中，放電閾值已完全恢復(fù)正常，而對(duì)閾上刺激誘發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)放卻沒有影響。結(jié)果表明SCN9A的兩個(gè)功能拷貝對(duì)人類傷害感受器興奮性的設(shè)定可能是必需的。

本文作者利用NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元可以進(jìn)一步研究通道活性與傷害性感受器神經(jīng)元功能之間的聯(lián)系。最近有報(bào)道表明，NaV1.7對(duì)人類感覺神經(jīng)元中全鈉電流的貢獻(xiàn)可能非常有限。與此觀點(diǎn)相反的是，本文作者發(fā)現(xiàn)NaV1.7通道在iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中提供了全鈉電流峰值的約24%。

先前研究者未能在人DRG體外記錄到TTX敏感的低閾值斜坡電流，并且使用選擇性毒素和阻斷劑評(píng)估NaV1.7對(duì)TTX敏感的全鈉電流的貢獻(xiàn)時(shí)，產(chǎn)生的結(jié)果并不一致。Pro-Tx II無法抑制TTX-S電流，而PF-05089771則會(huì)完全抑制該電流。本文作者推測(cè)，在更天然環(huán)境中研究鈉通道（而不是在異源表達(dá)系統(tǒng)時(shí)），Pro-Tx II會(huì)失去效力或者PF-05089771會(huì)失去選擇性，而這兩種鈉通道抑制劑在先前的研究中均顯示有效且是特異的。結(jié)果表明，至少就功能結(jié)果（即放電特性）而言，PF-05089771對(duì)NaV1.7具有通道選擇性。該結(jié)論補(bǔ)充了本文作者得到的缺乏NaV1.7功能的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元低興奮性的發(fā)現(xiàn)。本文作者得出結(jié)論，NaV1.7通道對(duì)神經(jīng)元的興奮性的確有重要貢獻(xiàn)。鑒于NaV1.7在轉(zhuǎn)錄水平上是人類DRG中表達(dá)最豐富的VGSC通道，如果說該通道在感覺神經(jīng)元中沒有發(fā)揮重要的生理學(xué)作用，那才是令人驚訝的！健康捐獻(xiàn)者來源的DRG的分離和培養(yǎng)以及本文作者的iPSC分化策略，提供了研究人類感覺神經(jīng)元生物學(xué)的兩種不同方法。iPSC定向分化成傷害性感受器神經(jīng)元具備體內(nèi)傷害感受器神經(jīng)元的許多轉(zhuǎn)錄和功能特征，但可能并不能囊括DRG感覺神經(jīng)元的整個(gè)全貌。如今盡管人體來源的DRG越來越普及，但是對(duì)非常罕見的疾?。ɡ鏑IP）的研究仍是一個(gè)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。iPSC的基因修飾可以對(duì)基因功能進(jìn)行精細(xì)的編輯，從而消除了對(duì)藥理學(xué)研究來說固有的化合物選擇性方面的問題。

本文作者發(fā)現(xiàn)缺乏NaV1.7（無論是來自CIP還是NaV1.7 KO品系）的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元仍能夠在細(xì)胞體上產(chǎn)生動(dòng)作電位，盡管需要更大的電流刺激。這一發(fā)現(xiàn)與計(jì)算機(jī)仿真建模和動(dòng)態(tài)膜片鉗記錄結(jié)果相一致，后者描述了NaV1.7的電導(dǎo)與激發(fā)單個(gè)動(dòng)作電位的閾值以及閾上去極化刺激而激發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放之間呈線性關(guān)系。在完全不存在NaV1.7的情況下，傷害性感受器神經(jīng)元仍能夠在細(xì)胞體上產(chǎn)生動(dòng)作電位。這些研究結(jié)果與本文作者的發(fā)現(xiàn)相一致。

NaV1.7的通道動(dòng)力學(xué)特性使其可以將小的去極化電流放大，并調(diào)節(jié)神經(jīng)末端動(dòng)作電位的生成。本文作者試圖通過逐漸使膜電位去極化的分級(jí)閾上刺激，來更好地在體外模擬神經(jīng)末梢的感受器電位。NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的反應(yīng)能力明顯低于對(duì)照iPSC傷害性感受器神經(jīng)元，特別是對(duì)較慢的去極化刺激的反應(yīng)更是如此。NaV1.7在傷害感受器的初始生成和動(dòng)作電位傳導(dǎo)中起必要作用，這與本文作者在CIP病人的顯微神經(jīng)造影術(shù)的發(fā)現(xiàn)相一致。臨床前數(shù)據(jù)顯示，NaV1.7可能會(huì)調(diào)節(jié)傷害感受器神經(jīng)元中樞末端的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。鑒于周圍神經(jīng)內(nèi)缺乏功能性傷害性感受器，因此傷害感受傳遞的缺陷與傷害性感受器神經(jīng)元的中樞末端相距較遠(yuǎn)。故本文作者認(rèn)為傷害感受器神經(jīng)元中樞末端的缺陷不太可能對(duì)CIP病人的無痛表型做出主要貢獻(xiàn)。

本文作者還利用了NaV1.7 KO細(xì)胞來進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)估。盡管內(nèi)源性阿片類藥物在功能性NaV1.7喪失的情況下被上調(diào)，并參與了CIP病人無痛表型的發(fā)生，但沒有看到NaV1.7 KO的 iPSC傷害感性受器神經(jīng)元中PENK mRNA的上調(diào)，或在對(duì)照神經(jīng)元中的表達(dá)。支持這一發(fā)現(xiàn)的是，本文作者觀察到的NaV1.7 KO的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元中明顯的低興奮性不依賴于內(nèi)源性阿片類信號(hào)。在體外培養(yǎng)的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并不能排除在沒有NaV1.7的情況下，中樞阿片機(jī)制對(duì)CIP病人無痛表型的貢獻(xiàn)。本文作者利用NaV1.7 KO品系，來測(cè)試在臨床開發(fā)中的NaV1.7選擇性小分子的特異性問題。PF-05089771是一種芳基磺酰胺類的NaV1.7選擇性阻斷劑，針對(duì)原發(fā)性紅斑肢痛癥和糖尿病性神經(jīng)痛正在進(jìn)行II期試驗(yàn)。用PF-05089771處理對(duì)照的iPSC傷害性感受器神經(jīng)元可降低其興奮性，但對(duì)NaV1.7 KO神經(jīng)元并無影響，表示該藥物對(duì)NaV1.7的選擇性很好。BII074已成功進(jìn)行三叉神經(jīng)痛的II期臨床試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)濃度的BII074 不依賴于NaV1.7的效應(yīng)隨劑量增加而急劇增加。特別是BII074對(duì)傷害感性受器神經(jīng)元的使用依賴性的阻斷效應(yīng)似乎在很大程度上不依賴于NaV1.7。這可能與三叉神經(jīng)痛（陣發(fā)性疼痛）的關(guān)聯(lián)特別密切。盡管該藥物在II期臨床試驗(yàn)中耐受性良好，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，由于存在脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，不要試圖增加BII074的劑量來增強(qiáng)治療效果。

綜上所述，本文作者對(duì)由SCN9A突變引起的CIP臨床表型進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估，并研究了SCN9A突變對(duì)細(xì)胞模型和軀體感覺系統(tǒng)的影響。NaV1.7功能喪失而引起的感覺障礙不僅與疼痛有關(guān)，并且CIP病人表現(xiàn)出溫度辨別和瘙癢方面的缺陷。NaV1.7在人iPSC傷害性感受器神經(jīng)元上表達(dá)并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面、軸突和末端，并且在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性（尤其是在響應(yīng)緩慢去極化刺激時(shí)）中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些細(xì)胞模型中測(cè)試的NaV1.7阻斷劑能夠?qū)⑷薸PSC傷害性感受器神經(jīng)元的興奮性改變?yōu)轭愃朴贜aV1.7 KO的水平。但需要提醒的是，在某些情況下，有些藥物對(duì)NaV1.7缺乏選擇性。最后，在具有雙等位基因SCN9A突變的人中，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)傷害性感受器神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能均有嚴(yán)重缺陷。這可能源于NaV1.7功能的長期喪失。提示對(duì)人類來說，NaV1.7的急性藥理學(xué)抑制作用可能無法完全復(fù)制CIP病人的無痛表型。