南藥猴耳環(huán)作為抗生素佐劑的研究進(jìn)展*

劉翀，王永剛，李沛波，彭維，蘇薇薇

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275）

縱觀人類疾病的發(fā)展史，感染性疾病占據(jù)了人類流行病的很大一部分［1］。1675 年，列文·虎克（Leeuwenhoek）［2］首次對(duì)細(xì)菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究，此后，細(xì)菌被確定為傳染性疾病的傳染源之一。青霉素的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著抗生素時(shí)代的開始［3］，感染性疾病開始得到了有效治療。然而，抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥問題的出現(xiàn)。1961 年，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)菌耐藥時(shí)代的到來［4］。新抗生素的開發(fā)和應(yīng)用不可避免帶來細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［5-6］，細(xì)菌耐藥情況日益嚴(yán)重，逐漸引起廣泛的關(guān)注。

抗生素佐劑是指自身抗菌作用較弱，但聯(lián)用抗生素能增強(qiáng)抗生素抑菌作用的物質(zhì)［7-9］?？股刈魟┠苡行Ы档涂股剡x擇壓力，是解決細(xì)菌耐藥的新手段。本團(tuán)隊(duì)致力于中藥現(xiàn)代化研究，從多種中藥中篩選出一種具有顯著抗生素佐劑作用特點(diǎn)的傳統(tǒng)中藥猴耳環(huán)。本文從細(xì)菌抗生素耐藥現(xiàn)狀分析、抗生素佐劑的研究進(jìn)展以及猴耳環(huán)作為抗生素佐劑的研究進(jìn)展三個(gè)方面，對(duì)抗生素佐劑解決細(xì)菌耐藥問題及猴耳環(huán)作為佐劑抗耐藥菌國(guó)內(nèi)外最新研究狀況進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌抗生素耐藥現(xiàn)狀分析

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-re?sistant staphylococcus aureus， MRSA）的出現(xiàn)為細(xì)菌防治敲響了警鐘［10］，此后產(chǎn)ESBLs 的腸科桿菌［11］、萬(wàn)古霉素中介細(xì)菌［12］等多種細(xì)菌在短時(shí)間內(nèi)相繼被發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌抗生素耐藥問題引起了廣泛的關(guān)注。

根據(jù)中國(guó)CHINET 公布的2018 年的數(shù)據(jù)顯示［13］，全國(guó)范圍內(nèi)臨床分離的金黃色葡萄球菌中MRSA、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥率均達(dá)到20%以上。世界范圍內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的抗生素耐藥率達(dá)到30%以上，其中亞洲地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗生素耐藥率更是高達(dá)70%［14］?？梢姡股啬退幥闆r已日趨嚴(yán)重，抗生素面臨著更大的選擇壓力。除了臨床治療中細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，正常的生產(chǎn)和生活中也存在嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題。在動(dòng)物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，亞劑量抗生素被濫用于現(xiàn)代密集型養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015 年我國(guó)用于養(yǎng)殖業(yè)的抗生素達(dá)到了9 萬(wàn)7 千多t［15］，養(yǎng)殖場(chǎng)中長(zhǎng)期使用亞抑菌劑量的抗生素作為提高產(chǎn)量的手段，導(dǎo)致了細(xì)菌抗生素耐藥問題的加劇。

新抗生素的開發(fā)被認(rèn)為是解決細(xì)菌抗生素耐藥性問題的主要途徑。但是，回顧抗生素發(fā)展歷程，細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)快于新抗生素開發(fā)的速度。相比于一種新抗生素從被發(fā)現(xiàn)到正式應(yīng)用所需的十?dāng)?shù)年甚至數(shù)十年時(shí)間，細(xì)菌對(duì)這種新抗生素耐藥的出現(xiàn)僅需短短幾年時(shí)間［16］。此外，新抗生素開發(fā)還需投入巨大的研發(fā)成本。近年來，新抗生素的數(shù)量總體仍然呈下降趨勢(shì)，在1987 年至2017 年之間，沒有一種新種類的抗生素問世［17］。在新抗生素開發(fā)極度缺乏的情況下，有效利用現(xiàn)有的藥物重新恢復(fù)臨床使用的抗生素的敏感性，降低抗生素的選擇壓力，成為解決細(xì)菌耐藥問題的新思路?？股刈魟┑难邪l(fā)能有效彌補(bǔ)新抗生素開發(fā)難度極大這一短板，有望解決細(xì)菌抗生素耐藥日益嚴(yán)重的問題［18］。

2 抗生素佐劑研究進(jìn)展

抗生素佐劑又被稱為“耐藥性爆破者”或“抗生素增效劑”［19-22］?？股刈魟┡c抗生素聯(lián)合用藥時(shí)能降低現(xiàn)有抗生素的選擇壓力。當(dāng)前，抗生素佐劑的研究主要集中于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑及細(xì)菌外排泵抑制劑等方面［23-26］。

當(dāng)前，關(guān)于化學(xué)藥物作為抗生素佐劑的研究報(bào)道較多。然而，化學(xué)藥物作為抗生素佐劑研究仍有許多問題亟待解決。首先，化學(xué)藥物結(jié)構(gòu)單一，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)菌的單一耐藥性，但是，細(xì)菌耐藥菌株一般表現(xiàn)為多重耐藥性，解決耐藥菌株的單一耐藥性并不能有效解決細(xì)菌抗生素耐藥問題；其次，化藥抗生素佐劑作為單一結(jié)構(gòu)化合物，持續(xù)處理也有誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。

中藥具有多靶點(diǎn)、多成分共同作用的特點(diǎn)，能有效彌補(bǔ)化學(xué)藥物抗生素佐劑的缺點(diǎn)和不足，本研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)多種傳統(tǒng)中藥作為抗生素佐劑潛力綜合評(píng)價(jià)，篩選出一種具有顯著抗生素佐劑特點(diǎn)的嶺南傳統(tǒng)中藥——猴耳環(huán)，它具有長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用歷史，有望作為抗生素佐劑以應(yīng)對(duì)日趨嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題。

3 猴耳環(huán)作為抗生素佐劑研究進(jìn)展

猴耳環(huán)是一種傳統(tǒng)的嶺南中藥，具有清熱解毒、涼血消腫、止瀉等功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃體炎、急性胃腸炎。猴耳環(huán)屬植物具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎［27］、抗過敏［28］以及抑制血管生成和抗氧化等多種生物活性［29］。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)猴耳環(huán)抗耐藥菌作用進(jìn)行了深入研究，系統(tǒng)、全面地考察了猴耳環(huán)作為抗生素佐劑抗耐藥菌的作用效果，研究結(jié)果表明猴耳環(huán)提取物有作為抗生素佐劑臨床應(yīng)用的潛力。故結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)研究進(jìn)展及其他研究報(bào)道，對(duì)猴耳環(huán)作為抗生素佐劑研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

3.1 猴耳環(huán)化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了從猴耳環(huán)植物中分離鑒定出的大量化合物［30-31］，包括兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯［32］、表沒食子兒茶素沒食子酸脂［33］及羽扇豆醇等［34-35］。本研究團(tuán)隊(duì)通過高分辨UFLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，通過對(duì)照品驗(yàn)證和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從猴耳環(huán)及其提取物中鑒定出數(shù)十種化合物，主要包括黃酮類化合物和有機(jī)酸類化合物，為闡明猴耳環(huán)提取物的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供參考。研究結(jié)果表明，猴耳環(huán)中含有多種已被報(bào)道具有顯著的抗菌活性和抗生素增效作用的化合物，如，Qin 等［36］的研究發(fā)現(xiàn)兒茶素和表兒茶素沒食子酸能顯著降低苯唑西林對(duì)MRSA 的最低抑菌濃度；Hu 等［37］研究發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯單用對(duì)MRSA的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC） 為100 μg/mL，與氨芐西林和舒巴坦聯(lián)合抗MRSA 時(shí)，氨芐西林和舒巴坦對(duì)MRSA的MIC90由8 μg/mL降到4 μg/mL，起到聯(lián)合增效作用。綜上所述，猴耳環(huán)有作為抗生素佐劑的潛力。

3.2 猴耳環(huán)抗耐藥菌作用及其機(jī)制研究

Kumar 等［38］研究了猴耳環(huán)提取物對(duì)多種敏感細(xì)菌和真菌的抑菌活性，其中包括5種革蘭氏陽(yáng)性菌、7 種革蘭氏陰性菌及8 種真菌。本團(tuán)隊(duì)的研究著重考察猴耳環(huán)提取物對(duì)耐藥菌的抑菌作用，研究結(jié)果表明猴耳環(huán)對(duì)臨床常見的耐藥大腸桿菌、耐藥肺炎克雷伯菌、MRSA、多重耐藥的銅綠假單胞菌和多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌均有一定的抑菌能力［39］，猴耳環(huán)提取物對(duì)MRSA 抑菌效果最強(qiáng)，對(duì)100 株臨床分離 的MRSA 菌株MIC90為200 μg/mL，與其他中藥相比具有顯著的抑菌活性。除在體外研究中證明猴耳環(huán)提取物有抑菌作用外，本研究團(tuán)隊(duì)還通過動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)考察了猴耳環(huán)提取物對(duì)耐藥菌引起的感染性疾病治療效果，從感染部位載菌量、炎性因子等方面綜合研究了猴耳環(huán)提取物對(duì)感染性疾病的治療效果，研究結(jié)果表明，猴耳環(huán)提取物對(duì)MRSA誘導(dǎo)的小鼠肺炎有顯著的治療效果。上述研究結(jié)果提示猴耳環(huán)對(duì)臨床常見的敏感菌以及耐藥菌具有廣譜的抑菌活性并對(duì)耐藥菌引起的疾病有顯著的治療效果。

盡管猴耳環(huán)單用的抑菌活性弱于抗生素，但是，本研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明猴耳環(huán)聯(lián)用抗生素對(duì)抗生素有顯著的增效作用。研究結(jié)果表明，猴耳環(huán)提取物對(duì)左氧氟沙星等抗生素抗產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌的抑菌活性有顯著的增效作用，既能增強(qiáng)產(chǎn)酶耐藥大腸桿菌對(duì)左氧氟沙星的敏感性［40］，又能增強(qiáng)亞胺培南、多粘菌素B、頭孢他啶、左氧氟沙星等多種不同類型抗生素對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌的抑菌活性，還能顯著增強(qiáng)紅霉素、左氧氟沙星和頭孢曲松鈉抗MRSA 的抑菌活性［41］，也能增強(qiáng)亞胺培南、頭孢哌酮、左氧氟沙星等多種不同類型抗生素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌活性［42］。上述研究結(jié)果表明猴耳環(huán)及其提取物能顯著增強(qiáng)多種抗生素對(duì)臨床常見耐藥菌的抑菌活性，使多種抗生素的最低抑菌濃度下降50%以上，有效增強(qiáng)了抗生素藥效，減少抗生素的用量。

目前，對(duì)抗生素佐劑的研究集中于佐劑對(duì)抗生素抑菌活性的增效作用，很少考察抗生素佐劑對(duì)細(xì)菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)猴耳環(huán)提取物作為抗生素佐劑的潛力，本研究團(tuán)隊(duì)通過藥物體外持續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)，考察猴耳環(huán)和多種抗生素持續(xù)處理對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響。研究結(jié)果表明，低濃度抗生素連續(xù)處理7～14 d 會(huì)導(dǎo)致敏感金黃色葡萄球菌和耐藥金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥性增強(qiáng)；而猴耳環(huán)提取物聯(lián)用抗生素持續(xù)給藥能有效抑制低濃度抗生素誘導(dǎo)的敏感金黃色葡萄球耐藥性的增強(qiáng)，還能顯著降低耐藥金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素的耐藥性［43］?？股氐闹委熯^程是一個(gè)持續(xù)的過程，細(xì)菌耐藥性也在抗生素持續(xù)用藥的過程中逐漸產(chǎn)生，開發(fā)降低抗生素誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥的藥物具有重要意義。猴耳環(huán)提取物聯(lián)用抗生素持續(xù)給藥時(shí)，能有效抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，并且能逆轉(zhuǎn)耐藥菌對(duì)多種抗生素的耐藥性。

盡管現(xiàn)有研究報(bào)道了許多中藥對(duì)耐藥菌的抑菌作用［44-46］，但是對(duì)中藥抗耐藥菌作用機(jī)制研究很少，成為制約中藥抗耐藥菌研發(fā)的關(guān)鍵原因之一。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)猴耳環(huán)抗耐藥菌的作用機(jī)制開展了研究。使用MRSA 臨床分離菌株為模式菌株，利用透射電子顯微鏡觀察和Western blot 技術(shù)，研究猴耳環(huán)提取物對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響，并且深入研究猴耳環(huán)提取物對(duì)青霉素結(jié)合蛋白2a （penicil?lin binding protein 2a， PBP2a）蛋白通路的影響，研究結(jié)果表明，猴耳環(huán)提取物能抑制MRSA 的PBP2a蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性；本研究還通過溴化乙錠底物積蓄模型和PCR 技術(shù)，研究了猴耳環(huán)提取物對(duì)細(xì)菌抗生素特異性外排泵功能影響，結(jié)果表明，猴耳環(huán)提取物能影響norA 外排泵供能體系，抑制藥物細(xì)菌外排泵供能，減少藥物外排，增強(qiáng)抗生素抑菌活性，逆轉(zhuǎn)MRSA 細(xì)菌的多重耐藥性［47］。上述結(jié)果提示，猴耳環(huán)提取物能通過多種逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制有效解決細(xì)菌對(duì)抗生素的多重耐藥。

綜上所述，猴耳環(huán)及其提取物有顯著的抗生素增效作用，與化學(xué)藥物抗生素佐劑相比，猴耳環(huán)具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，猴耳環(huán)提取物對(duì)多種不同類型的抗生素有增效作用，能增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類和喹諾酮類等多種抗生素的抗耐藥菌活性；其次，抗生素或單一結(jié)構(gòu)的化學(xué)藥物的持續(xù)用藥能誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，猴耳環(huán)提取物的持續(xù)用藥并不會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，還能抑制和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性；最后，猴耳環(huán)提取物能通過多種逆轉(zhuǎn)耐藥的方式共同作用，有效降低了細(xì)菌多重耐藥性。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

目前抗生素佐劑研發(fā)和臨床應(yīng)用尚處于發(fā)軔階段，僅有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑應(yīng)用于臨床抗耐藥菌感染的治療，其他種類抗生素佐劑均處于臨床甚至實(shí)驗(yàn)室的研究階段。

中藥作為抗生素佐劑具有抗生素增效范圍廣及不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥的諸多優(yōu)勢(shì)，逐漸引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注，為解決細(xì)菌耐藥問題提供了新思路。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)講究整體觀，強(qiáng)調(diào)人與自然相互協(xié)調(diào)，重視調(diào)整外界與機(jī)體雙方的聯(lián)系，從而針對(duì)疾病發(fā)展的不同進(jìn)程采用不同的治療手段［48］。感染性疾病是致病微生物與機(jī)體相互作用的過程，其中也包括造成機(jī)體免疫功能的失調(diào)和導(dǎo)致臟器病理組織的損傷。在感染性疾病的康復(fù)期，人體臟器損傷仍然存在，但抗生素在這個(gè)階段對(duì)這些損傷沒有明顯的修復(fù)效果，故中藥在感染性疾病的康復(fù)期調(diào)理中更加能顯示出它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。猴耳環(huán)及其提取物具有多成分、多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，除能直接起增效抑菌作用之外，還能夠從整體上提高機(jī)體免疫狀態(tài)、減輕疾病對(duì)機(jī)體的損害，在抗感染疾病的治療過程中，不容易使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥并且避免菌群失調(diào)等情況［49-50］，從而起到標(biāo)本兼治的作用。因此，將猴耳環(huán)及其提取物開發(fā)成抗生素佐劑具有廣闊的前景。

盡管多項(xiàng)研究表明中藥有良好的作為抗生素佐劑的潛力，我們不能忽視中藥在該領(lǐng)域研究存在的不足。由于中藥成分復(fù)雜，現(xiàn)有的報(bào)道多側(cè)重于混合物給藥的藥效研究，至于為何選擇混合物作為研究載體并沒有進(jìn)行充分的實(shí)驗(yàn)論證而且缺乏足夠的數(shù)據(jù)支撐。此外現(xiàn)有的研究對(duì)中藥抑制耐藥菌的作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制研究很少。同時(shí)，雖然很多體外實(shí)驗(yàn)證明多種中藥對(duì)耐藥菌有顯著的抑菌活性，但是體外實(shí)驗(yàn)并不能完全代替整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，需要體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)支持。本研究團(tuán)隊(duì)利用體外模型和整體動(dòng)物模型全面評(píng)價(jià)了猴耳環(huán)抗耐藥菌感染的藥效，并且對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。但是，由于猴耳環(huán)提取物成分復(fù)雜，各成分與作用機(jī)制的相關(guān)性暫未明確，有待深入研究。