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    檸檬馬鞭草精油結(jié)合亞麻籽膠對大菱鲆肌原纖維蛋白生化特性及構(gòu)象的影響

    2020-01-07 03:27:10劉鋒謝晶
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:馬鞭草大菱鲆肌原纖維

    劉鋒,謝晶

    (上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)

    大菱鲆(Scophthalmusmaximus)屬于鰈形目鲆科,在我國被稱作“多寶魚”,作為我國北方主要的海水養(yǎng)殖魚類,年產(chǎn)量達(dá)8.5萬t,銷售價值超過40億元人民幣[1]。大菱鲆因其高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)為消費(fèi)者喜愛[2]。目前,大菱鲆以活魚銷售為主,隨著生鮮電商的迅猛發(fā)展,冰鮮大菱鲆已成為未來銷售流通的重要途徑之一。然而,由于受到微生物繁殖和體內(nèi)酶活性的影響,大菱鲆在貯藏期間易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化和降解,導(dǎo)致魚肉品質(zhì)劣變,產(chǎn)品貨架期縮短。

    近年來,涂膜作為一種新型安全的保鮮方法得到了外界廣泛的關(guān)注。其中,復(fù)合涂膜技術(shù)發(fā)展迅速,具有加強(qiáng)涂膜抑菌和抗氧化等方面的性能,是一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全的保鮮方法[3]。亞麻籽膠(flaxseed gum,F(xiàn)SG)因具有良好的成膜性、功能特性和營養(yǎng)價值而成為一種具有廣泛前景的成膜材料[4]。YOUSUF等[5]將亞麻籽膠與檸檬草精油結(jié)合處理即食石榴,結(jié)果表明,相比于對照組,用亞麻籽膠-檸檬草精油復(fù)合涂膜處理顯著抑制了微生物的生長,并且更好地保持了石榴的色澤和水分。檸檬馬鞭草精油(verbena oil)是一種由檸檬馬鞭草萃取而制得的植物精油,主要成分為檸檬醛、苧烯和芳姜黃烯,具有很強(qiáng)的抗氧化和抗菌能力[6-7]。ISHKEH等[7]用檸檬馬鞭草精油處理樹莓果實(shí),發(fā)現(xiàn)用檸檬馬鞭草精油處理的樹莓果實(shí)具有較高的抗氧化能力、酚類和花青素含量,抑制了真菌的生長,延長了果實(shí)的貨架期。因此,將亞麻籽膠與檸檬馬鞭草精油復(fù)合使用涂膜就能夠既具備良好的成膜性,又具有強(qiáng)抑菌和抑制蛋白氧化的效果,延長產(chǎn)品貨架期。

    本研究利用不同濃度的檸檬馬鞭草精油結(jié)合亞麻籽膠制作復(fù)合涂膜液處理冰溫貯藏下的大菱鲆魚片,研究冰溫貯藏期間大菱鲆肌原纖維蛋白生化特性及結(jié)構(gòu)的變化,以期篩選出一種有效的檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜的配方,為今后的大菱鲆保鮮提供一種全新的方法。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

    三羥甲基氨基甲烷(Tris)、馬來酸、KCl、三氯乙酸、尿素、SDS、EDTA、DTNB、CaCl2、戊二醛、甘油、無水乙醇、KBr、二甲胂酸鈉、四氧化鋨、環(huán)氧樹脂、乙酸雙氧鈾、檸檬酸鉛,生工生物工程(上海)股份有限公司;Bradford法蛋白測試盒、超微量Ca2+-ATP酶測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;檸檬馬鞭草精油,廣州粵渝精油公司;亞麻籽膠(食品級),河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

    H1850R型高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;XEBJ-1000超聲波均質(zhì)機(jī),濟(jì)寧諧成超聲波設(shè)備有限公司;DJ1C-60增力電動攪拌器,青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司;FEI Tecnai G2 SpiritBiotwin透射電子顯微鏡,美國Thermo Scientific公司;Hitachi L-8800全自動氨基酸分析儀,天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;Hitachi F-7100熒光分光光度計(jì),上海斯邁歐分析儀器有限公司;BOC Edwards Lyofast真空冷凍干燥機(jī),北京天利聯(lián)合科技有限公司;BioTek多功能酶標(biāo)儀,上海京工實(shí)業(yè)有限公司;BPS-100CB恒溫恒濕箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜的制備及魚樣的處理

    將亞麻籽膠粉末以0.6%的質(zhì)量濃度溶解在蒸餾水中[5],使用磁力攪拌器以3 000 r/min勻速攪拌3 h,加入甘油(25%,w/v)進(jìn)行適當(dāng)乳化,待溶液冷卻后,將檸檬馬鞭草精油分別以0、0.128%、0.64%和1.28%的質(zhì)量濃度滲入到FSG溶液中繼續(xù)以3 000 r/min勻速攪拌0.5 h,最后在超聲波均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)0.5 h,制得檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜液。

    鮮活大菱鲆于2019年6月購于上海市蘆潮港水產(chǎn)品批發(fā)市場,體態(tài)均勻、健康,每條大菱鲆的平均體重為(700±50)g,平均體長為(30±2)cm?;铘~宰殺后,去除魚鰓和內(nèi)臟,清洗干凈后把魚體切分成質(zhì)量大小均一的魚塊。

    分別對魚塊進(jìn)行浸泡,浸泡時間為3 min。未涂膜處理的魚塊作為對照組CK,僅用FSG溶液涂覆的樣品為實(shí)驗(yàn)組C1,用滲入0.128%、0.64%和1.28%質(zhì)量濃度檸檬馬鞭草精油的FSG溶液涂覆的樣品為實(shí)驗(yàn)組C2,C3和C4。魚樣瀝干后隨機(jī)分裝在聚乙烯袋中,-1 ℃下貯藏,每隔5 d取一次樣。

    1.2.2 肌原纖維蛋白的制備與含量測定

    參考LV等[8]的方法提取肌原纖維蛋白溶液(myofibril protein,MP)。稱取2 g剁碎的魚肉于50 mL離心管中,加入20 mL緩沖液A(20 mmol/L Tris-maleate,pH 7.0,0.05 mol/L KCl),4 ℃下勻漿,勻漿液以10 000 r/min離心15 min,收集沉淀。沉淀加入20 mL緩沖液B(20 mmol/L Tris-maleate,pH 7.0,0.6 mol/L KCl),勻漿后于4 ℃下浸提1 h,10 000 r/min離心15 min,上清液即肌原纖維蛋白溶液。根據(jù)Bradford試劑盒法測定蛋白濃度。

    人本主義治療模式與行為主義治療模式存在顯著的差異,這種差異也暗示了人在社會上的地位水平具有明顯的轉(zhuǎn)變。該種治療模式突出了人的價值,具有“以人為本”的治療特征,認(rèn)為人與動物或機(jī)器是具有明顯差異的,人具有自己的主觀世界,并堅(jiān)信,人可以通過自己的能力駕馭周圍所發(fā)生的事情。認(rèn)為人具有自我選擇的權(quán)利,強(qiáng)調(diào)人的尊嚴(yán)。這種治療模式具有人性化特征,具有積極樂觀的態(tài)度,與精神分析治療模式及行為治療模式有明顯的差異。

    1.2.3 總巰基含量的測定

    參照BENJAKUL等[9]的方法測定。

    1.2.4 Ca2+-ATPase活性的測定

    根據(jù)魯耀彬等[10]的方法測定。

    1.2.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

    根據(jù)LI等[11]的方法,將MP干粉樣品與KBr充分混合并研磨,然后用Thermo FT-IR光譜儀在25 ℃下掃描整個條帶,將每個樣品的紅外光譜圖設(shè)置為32次掃描的疊加,儀器分辨率為4 cm-1,每個樣品以空氣為背景進(jìn)行掃描。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次測量。用Omnic 9.2.106光譜軟件處理FT-IR原始數(shù)據(jù),用Peckfit v4.12光譜分析擬合軟件對譜峰進(jìn)行擬合。

    1.2.6 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

    根據(jù)SUN等[12]的方法,稍作修改。使用F-7100熒光分光光度計(jì)測量蛋白質(zhì)溶液的固有熒光發(fā)射光譜,發(fā)射波長為295 nm,狹縫寬度為5 nm,發(fā)射光譜范圍為310~400 nm,掃描速度為1 200 nm/min。記錄熒光發(fā)射光譜的最大熒光波長。

    1.2.7 游離氨基酸含量的測定

    參照YU等[13]的方法進(jìn)行。使用Hitachi L-8800全自動氨基酸分析儀分析。

    1.2.8 透射電子顯微鏡觀察

    參照CHEN等[14]的方法,稍作修改。將各樣品沿著平行于肌原纖維的方向切成5 mm×3 mm×2 mm的方形小塊,用預(yù)冷的2.5%體積濃度戊二醛固定并置于0.1 mol/L磷酸緩沖液中(pH 7.4),然后將樣品在pH 7.4的二甲胂酸鈉緩沖液中洗滌,四氧化鋨固定2 h。然后,樣品分別經(jīng)30%、50%和70%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇梯度脫水,在環(huán)氧丙烷中交換后包埋在Spurr樹脂中,使用超薄切片機(jī)平行切割纖維。超薄切片(70 nm)用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,最后使用FEI Tecnai G2 SpiritBiotwin透射電子顯微鏡拍照觀察。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    以上每個指標(biāo)做3次平行實(shí)驗(yàn),采用Origin 8.5繪圖,并利用SPSS Statistics 24軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示存在顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總巰基含量的變化

    巰基是蛋白質(zhì)中最主要的官能團(tuán)之一,其含量變化是評價肌肉蛋白質(zhì)氧化的有效指標(biāo)[15]。如圖1所示,隨著貯藏時間的增加,所有組樣品的巰基含量均不斷下降,這是因?yàn)橘A藏期間巰基發(fā)生氧化形成二硫鍵[16]。CK組的巰基含量在整個貯藏期間下降迅速,貯藏至15 d時,CK組的巰基含量下降了38.74%,而C1、C2、C3和C4組的巰基含量分別下降了32.31%、16.70%、22.25%和23.68%,結(jié)果表明,涂有檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜樣品的巰基含量要顯著高于其他組(P<0.05),這可能是因?yàn)閺?fù)合涂膜里的檸檬馬鞭草精油具有較強(qiáng)抗氧化能力,抑制了巰基的氧化,從而保護(hù)蛋白質(zhì)免于變性。另外,C2組的巰基含量在貯藏結(jié)束時顯著高于C3和C4組(P<0.05),這可能是因?yàn)檩^高濃度的檸檬馬鞭草精油的促氧化作用引起的[17]。NIETO等[18]發(fā)現(xiàn),與較低質(zhì)量濃度(0.05%)相比,向豬肉餅中添加更高質(zhì)量濃度(0.4%)的牛至精油會導(dǎo)致更高的蛋白質(zhì)氧化。因此,以上結(jié)果表明添加0.128%(質(zhì)量濃度)檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜能更有效地抑制肌肉蛋白質(zhì)的氧化。

    2.2 Ca2+-ATPase活性的變化

    Ca2+-ATPase活性是用來評價肌球蛋白完整性的指標(biāo),蛋白質(zhì)的變性會導(dǎo)致酶活力發(fā)生改變[19]。圖2顯示了不同處理組的大菱鲆的Ca2+-ATPase活性在整個貯藏期間的變化,可以得出,隨著貯藏時間的增加,所有組的Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢,這可能是由于肌球蛋白的球狀頭部上的巰基發(fā)生氧化和肌球蛋白的聚集引起的[20]。其中,相比于其他處理組的樣品,對照組樣品的Ca2+-ATPase活性急劇下降,貯藏至15 d時,其Ca2+-ATPase活性從0.148降低至0.1 μmol Pi/(mg protein·min),顯著低于用亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品(P<0.05)。貯藏30 d后,C2組樣品的Ca2+-ATPase活性顯著高于其他處理組的樣品(P<0.05),這可能是因?yàn)檫@種復(fù)合涂膜能更有效地抑制肌球蛋白中的巰基發(fā)生氧化,該結(jié)果與總巰基含量的變化保持一致。

    YU等[13]將不同濃度的丁香精油與殼聚糖涂膜結(jié)合處理草魚,發(fā)現(xiàn)添加較高濃度精油的涂膜能更好地減弱氧化損傷,更好地保持魚片的完整性。然而,本實(shí)驗(yàn)得到較低濃度的檸檬馬鞭草精油保護(hù)蛋白效果更佳,可能是因?yàn)楦邼舛鹊臋幟蜀R鞭草精油會引起促氧化作用。MARIO[21]等用迷迭香精油處理法蘭克福香腸時也發(fā)現(xiàn)迷迭香精油在低濃度時抗氧化效果更好。

    2.3 大菱鲆肌原纖維蛋白的紅外光譜和二級結(jié)構(gòu)

    圖4顯示了不同方式處理的大菱鲆肌原纖維的二級結(jié)構(gòu)的定量分析。新鮮魚樣包含37.62%的β-折疊、25.27%的無規(guī)則卷曲、16.85%的α-螺旋和20.26%的β-轉(zhuǎn)角。隨著貯藏時間的增加,α-螺旋的比例出現(xiàn)下降,β-折疊的比例上升,表明低溫下α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變[26]。其中,α-螺旋的減少可能與冰藏期間螺旋結(jié)構(gòu)的部分解折疊有關(guān),包括維持二級結(jié)構(gòu)的氫鍵被破壞[27]。在貯藏結(jié)束時,用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品相比于空氣組的樣品,有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋和β-折疊)的總比例顯著增加(P<0.05),表明這種復(fù)合涂膜在冰藏期間能夠很好地穩(wěn)定大菱鲆的肌原纖維結(jié)構(gòu)。并且,相比于僅用亞麻籽膠處理的樣品,復(fù)合涂膜處理能夠更好地促進(jìn)肌原纖維蛋白的穩(wěn)定化,這很可能是因?yàn)闄幟蜀R鞭草精油具有的強(qiáng)抗氧化性,保護(hù)蛋白被降解。ZHAO[28]等用魚明膠結(jié)合葡萄籽提取物處理羅非魚魚片,結(jié)果表明這種復(fù)合涂膜處理有助于羅非魚在貯藏期間維持更有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu),促進(jìn)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

    2.4 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

    蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光是指蛋白質(zhì)分子內(nèi)的熒光基團(tuán)暴露在紫外線時發(fā)出熒光的現(xiàn)象。熒光強(qiáng)度的降低通常是因?yàn)榘l(fā)色團(tuán)在溶劑中或在蛋白質(zhì)自身中與猝滅劑發(fā)生相互作用,蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光轉(zhuǎn)移到表面,從而發(fā)生熒光猝滅[29]。因此,蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的變化可以反映其構(gòu)象的變化[30]。色氨酸作為一種芳香族氨基酸,存在于蛋白質(zhì)內(nèi)核中,可以發(fā)出可通過熒光光譜法測定的熒光,它們的出現(xiàn)表明蛋白質(zhì)展開的程度[31]。冰溫貯藏期間經(jīng)不同處理方式處理的大菱鲆肌原纖維蛋白的熒光光譜如圖5所示。結(jié)果表明,第0天的新鮮魚樣在波長為336 nm處顯示出最高的熒光強(qiáng)度。對照組中大菱鲆肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在整個貯藏期間急劇下降,可能是因?yàn)榇罅怫以谫A藏過程氧化嚴(yán)重,肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開,色氨酸殘基等熒光物質(zhì)暴露在極性環(huán)境中,其內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低[32]。然而,用亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在貯藏前期下降較慢,尤其是C2組的下降速率要顯著低于其他組(P<0.05),表明添加質(zhì)量濃度為0.128%檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜可以保護(hù)蛋白質(zhì)在冰溫貯藏期間免于變性和結(jié)構(gòu)的變化,提高大菱鲆的品質(zhì)。并且,貯藏結(jié)束時C3和C4組的熒光強(qiáng)度顯著低于C2組(P<0.05),這是因?yàn)檩^高濃度的檸檬馬鞭草精油引起的促氧化作用加快了內(nèi)源熒光物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。SHI[31]等用迷迭香提取物作為上釉材料處理泥蝦,結(jié)果表明,與迷迭香釉蝦相比,未上釉蝦的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在整個貯藏期間急劇下降,表明上釉處理保護(hù)蛋白質(zhì)在冷凍貯藏期間免于結(jié)構(gòu)的變化。

    2.5 游離氨基酸含量的變化

    游離氨基酸與魚片貯藏期間風(fēng)味的形成密切相關(guān),一些游離氨基酸更是有害生物胺的前體[33],如組氨酸在組氨去羧酶的作用下轉(zhuǎn)變成組胺。蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致了游離氨基酸的形成[34],因此游離氨基酸的含量變化可以反映蛋白質(zhì)的降解程度。不同處理方式的大菱鲆冰溫貯藏0、15和30 d后游離氨基酸含量如表1所示。在整個貯藏期間,所有組大菱鲆的游離氨基酸的總含量均不斷增加,表明隨著貯藏時間的增加,大菱鲆因受到自身酶和微生物的作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)被降解,其中CK組蛋白質(zhì)降解速度最快。而亞麻籽膠和檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜抑制了蛋白質(zhì)的降解,并且C2組抑制效果最好,這可能是因?yàn)闄幟蜀R鞭草精油具有的強(qiáng)抗氧化性抑制了蛋白質(zhì)的降解。另外,CK組中的谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和組氨酸的含量在整個貯藏期間均高于其他處理組,作為異味氨基酸,較多的組氨酸含量會導(dǎo)致CK組中的大菱鲆產(chǎn)生更多的苦味,口味下降。SUN等[35]研究富含CUR/βCD乳液的魚明膠涂層對4 ℃下貯藏的草魚魚片的保鮮效果,結(jié)果表明,魚明膠涂層處理抑制了草魚蛋白質(zhì)的降解,并且經(jīng)魚明膠涂層處理的魚片風(fēng)味更佳。

    注:同一貯藏時間不同組別之間不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

    2.6 肌原纖維蛋白的超微結(jié)構(gòu)觀察

    已有文獻(xiàn)[36]表明,肌原纖維的結(jié)構(gòu)變化是由幾種主要的肌原纖維蛋白(肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白等)降解而導(dǎo)致的。本研究主要觀察了第0天的新鮮樣品以及貯藏20 d后不同處理組樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)變化。如圖6-A所示,新鮮大菱鲆的肌原纖維結(jié)構(gòu)完整、肌節(jié)規(guī)則、肌絲條紋清晰,并且Z線、M線、A帶和I帶清晰可見。貯藏20 d后,對照組CK和僅用亞麻籽膠處理的C1組樣品的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化,如圖6-B和圖6-C。對照組的肌原纖維結(jié)構(gòu)降解嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為Z線、M線基本消失,A帶和I帶嚴(yán)重模糊,肌節(jié)發(fā)生崩解;C1組樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重,Z線和M線弱化,部分出現(xiàn)降解,A帶和I帶難以區(qū)分,肌節(jié)逐漸崩解;然而觀察圖6-D、圖6-E、圖6-F可以得出,用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理的樣品的肌原纖維結(jié)構(gòu)依然保持完整,Z線和M線出現(xiàn)輕微弱化,肌節(jié)部分紊亂,鄰近Z線的I帶減弱,這可能是由肌原纖維結(jié)合的鈣蛋白酶對肌肉纖維蛋白質(zhì)的水解作用造成的[37]。與對照組相比,用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理樣品在貯藏期間較好地保持了大菱鲆肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的完整性,表明這種復(fù)合涂膜很好地抑制了肌原纖維蛋白的降解,這可能是因?yàn)闄幟蜀R鞭草精油具有較強(qiáng)抗氧化性,能夠保護(hù)蛋白免于變性。

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的檸檬馬鞭草精油結(jié)合亞麻籽膠形成的復(fù)合涂膜對冰溫貯藏期間大菱鲆肌原纖維蛋白的影響。結(jié)果表明,與對照組相比,用檸檬馬鞭草精油-亞麻籽膠復(fù)合涂膜處理魚樣能有效抑制蛋白質(zhì)氧化,包括延緩總巰基含量的減少和更好地保持Ca2+-ATPase活性。同時,復(fù)合涂膜處理抑制了α-螺旋的減少和內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低,穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),以及較低的游離氨基酸含量表明復(fù)合涂膜有效地抑制了蛋白質(zhì)降解。此外,通過透射電子顯微鏡觀察可得,復(fù)合涂膜處理的樣品在貯藏后期依然保持較完整的肌原纖維結(jié)構(gòu)。其中,以添加質(zhì)量濃度為0.128%檸檬馬鞭草精油的復(fù)合涂膜保鮮效果最佳。另外,精油作為植物的次級代謝產(chǎn)物,對于人類消費(fèi)而言是安全的,因此,檸檬馬鞭草精油與亞麻籽膠結(jié)合是一種有效且具有應(yīng)用前景的保鮮大菱鲆的方法。

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