米酸湯在發(fā)酵過程中品質(zhì)變化及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

王容，趙良忠*，李明 ,4，孫孟京 ，謝春平 ，鄧雅欣 ，歐紅艷

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽,422000) 2(豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地，湖南 邵陽,422000) 3(湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南 邵陽,422000) 4(廣州佳明食品科技有限公司，廣東 廣州,510000)

貴州地域天氣溫潤，腹瀉、痢疾等疾病比較常見。食酸成為貴州人民特有的飲食習(xí)慣，其中以酸湯最為著名，故有“三天不吃酸，走路打串串”之說[1-2]。米酸湯味道清香爽口，沁人肺腑。除富含多種維生素和各類微量元素外，還富含氨基酸、有機(jī)酸等。

貴州的米酸湯一直采用自然發(fā)酵，周期長、產(chǎn)酸低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[3-5]。當(dāng)前大部分研究仍停留在對(duì)酸湯中的微生物進(jìn)行分離鑒定、酸湯發(fā)酵工藝優(yōu)化、營養(yǎng)特征物質(zhì)以及一些風(fēng)味物質(zhì)分析，忽略了對(duì)酸湯動(dòng)力學(xué)的研究[5-7]。雖然現(xiàn)在已有學(xué)者以苗族地區(qū)農(nóng)家自釀的酸湯為原料，對(duì)其中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，研究其生物學(xué)特性，建立了單一菌種的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型[8]，但對(duì)米酸湯混合乳酸菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、玉米乳桿菌(L.zeae)、植物乳桿菌(L.plantarum)為混合菌種發(fā)酵米酸湯，研究其在發(fā)酵過程中品質(zhì)的變化和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從豆清液中分離出3株產(chǎn)酸高的Lactobacillusrhamnosus、L.zeae、L.plantarum,由豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室提供；大米、糯米,市售；液化酶(酶活4 000 u/g)、糖化酶(酶活120 000 u/g),廣東溢多利生物科技股份有限公司提供；乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸,均為色譜純,北京索萊寶科技有限公司提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，江蘇通凈有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)，島津公司；GI54DWS型全自動(dòng)滅菌鍋、le204e型電子天平，長沙艾迪生物科技有限公司；DH-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋、VELOCITY18R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，澳大利亞達(dá)卡米公司；U-3 000高效液相色譜，天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；CR-400色彩色差計(jì)，廣東七彩儀器設(shè)備有限公司；NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)、電子鼻和電子舌，上海瑞玢科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米酸湯發(fā)酵(圖1)

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

(1)浸泡：稱取m(面粉)∶m(大米)∶m(糯米)=2∶1∶1共100 g，凈水洗滌1～2次，在室溫25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸泡約6 h。

(2)糊化：加900 g去離子水進(jìn)行磨漿，再將磨好的米漿加熱到100 ℃并保溫5 min。

(3)液化：在溫度降為85 ℃時(shí)，調(diào)pH值到6.5，添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的液化酶，液化25 min。

(4)糖化：在溫度降為55 ℃時(shí)，調(diào)pH值到4.0時(shí)，添加0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的糖化酶，糖化1 h。

(5)滅菌：105 ℃、8 min進(jìn)行滅菌。

(6)接種：把從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活化、擴(kuò)培、馴化的混合菌，按接種量為5%(V/V)接種于待發(fā)酵液中。

(7)發(fā)酵：搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度36 ℃，每隔6 h取樣測(cè)其有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、黏度、色差、pH值、感官評(píng)分、菌體含量、乳酸含量、殘?zhí)菨舛鹊闹笜?biāo)變化。

1.2.2 總酸含量測(cè)

參照國標(biāo)《GBT 12456—2008食品中總酸的測(cè)定》[9]。

1.2.3 菌體含量測(cè)定方法

用移液槍吸取10 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用去離子水洗滌3次后，于105 ℃烘干至恒重，稱菌體質(zhì)量[10-11]。

1.2.4 殘?zhí)橇繙y(cè)定

按照3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[12]。

1.2.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

參照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[13]的凱氏定氮法。

1.2.6 有機(jī)酸測(cè)定[14]

取米酸湯10 mL，經(jīng)過濾后在10 000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣供分析用。液相色譜條件：色譜柱為CAPECELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長210 nm，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(pH=

2.65 0.01 mol/L KH2PO4溶液)=5∶95；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

分別準(zhǔn)確稱取草酸10 mg、蘋果酸10 mg、檸檬酸10 mg、乳酸10 mg。用重蒸水溶解并分別定容到4個(gè)10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)酸原液，密封置于4 ℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸標(biāo)樣。采集數(shù)據(jù)，根據(jù)峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系建立線性回歸方程，見表2和圖2。

1.2.7 色差值

用移液槍準(zhǔn)確移取混勻的米酸湯2 mL，以蒸溜水為對(duì)照，測(cè)定米酸湯的L*(亮度)、a*(紅綠度，正值為紅色,負(fù)值為綠色)、b*值(黃藍(lán)度，正值為黃色，負(fù)值為藍(lán)色)，然后按照公式(1)求出ΔE值，ΔE越大表示樣品顏色差異越大。

(1)

1.2.8 黏度測(cè)定

量取20 mL米酸湯，采用NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)試。

1.2.9 感官評(píng)定

由10名有經(jīng)驗(yàn)的食品專業(yè)評(píng)員組成評(píng)定小組，分別對(duì)米酸湯的色澤、內(nèi)部形態(tài)、滋味和香氣進(jìn)行評(píng)定，采用百分制，具體的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

1.2.10 米酸湯發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型建立

1.2.10.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)方程

在菌體生長動(dòng)力學(xué)模型中，最為常用的是Monod和Logistic模型[15-16]，Monod主要用來描述密度較低和生長較慢的菌體，但混合乳酸菌生長較快，到發(fā)酵后期菌體濃度很大，采用Monod方程不合適，所以采用描述生長曲線為S形的Logistic模型。結(jié)合參考文獻(xiàn)[17-18]，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中不同階段的混合乳酸菌采用如下方程：模擬菌體生長變化，Logistic 方程[19]；模擬乳酸生成，Luedeking-piret 方程[20]；模擬總糖的消耗，Luedeking-piret 方程[21]。

Logistic方程求積分式見公式(2)：

(2)

式中：CX,菌體生物量,g/L；t,時(shí)間；k,微生物的最大比生長速率；Cm,菌體最大生物量,g/L；C0,菌體的初始生物量,g/L。

1.2.10.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)方程

本實(shí)驗(yàn)采用Luedeking-piret方程[22-23]。通用模型方程如公式(3)：

(3)

式中：P,產(chǎn)酸量,g/L；P0,初始乳酸量,g/L；t，時(shí)間，h；n1，與菌體量有關(guān)的合成系數(shù)[g/(g細(xì)胞·h)]；n2，與菌體生長有關(guān)的合成系數(shù)(g/g 細(xì)胞)。

1.2.10.3 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程

本實(shí)驗(yàn)中由于混合乳酸菌的生長和產(chǎn)物生成是部分偶聯(lián)型，則采用Luedeking-piret方程[24-26]。

(4)

式中：S,底物質(zhì)量濃度,g/L；S0,初始底物質(zhì)量濃度,g/L；t,時(shí)間,h；r2,底物用于菌體生長的得率系數(shù),g/g；r1,微生物的維持常數(shù)，h-1。

1.2.11 電子鼻及電子舌測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)

電子鼻測(cè)定:將電子鼻傳感器預(yù)熱0.5 h以上，使其達(dá)到工作溫度，稱取5 mL樣品于玻璃進(jìn)樣瓶中，加蓋密封待檢。待進(jìn)樣瓶中的樣品達(dá)到液-氣兩相平衡后，對(duì)所需檢測(cè)的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，設(shè)置采樣時(shí)間為120 s，氣體流量為0.3 L/min，等待時(shí)間為10 s，清洗時(shí)間為120 s，每個(gè)樣品重復(fù)4次。

電子舌測(cè)定:將電子鼻傳感器預(yù)熱0.5 h以上，使其達(dá)到工作溫度，對(duì)電子舌傳感器進(jìn)行完全地清洗，以免影響試驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)的采集，清洗溶液為去離子水。清洗完成后，設(shè)定測(cè)定時(shí)所需要的相應(yīng)參數(shù)，量取15 mL待測(cè)樣品倒入電子舌專用燒杯中，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。采樣時(shí)間180 s，采樣速度為1次/s，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，且每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)與相關(guān)性分析，應(yīng)用Origin 9進(jìn)行擬合求解。

2 結(jié)果與分析

2.1 米酸湯在發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化結(jié)果分析

如表4所示，在米酸湯隨著發(fā)酵時(shí)間變化過程中所檢測(cè)的4種有機(jī)酸中，乳酸含量最高，在發(fā)酵后期達(dá)到了10.360 g/L，酒石酸和蘋果酸含量次之，在發(fā)酵后期分別達(dá)到了0.191、0.194 g/L。檸檬酸有檢測(cè)出，但在發(fā)酵后期含量極少，基本沒有。乳酸在0～24 h內(nèi)隨發(fā)酵時(shí)間增長緩慢，在24～102 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，102 h后隨發(fā)酵時(shí)間基本保持不變。酒石酸的生成曲線基本與乳酸一致，檸檬酸在0～60 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，在60～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢(shì)，在96 h之后檸檬酸含量基本為0。蘋果酸在18 h之前含量基本為0，在18～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在96 h之后基本保持不變，略有下降趨勢(shì)。圖3為120 h時(shí)米酸湯中有機(jī)酸色譜圖。

注：結(jié)果為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。下同。

2.2 米酸湯在發(fā)酵過程中感官評(píng)分、蛋白質(zhì)、黏度、色差值和pH值變化結(jié)果分析

如表5所示，在米酸湯發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)、黏度、pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化都呈下降的趨勢(shì)，色差值和感官評(píng)分都呈上升的趨勢(shì)。蛋白質(zhì)在0～12 h隨發(fā)酵時(shí)間下降比較緩慢，在12～96 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在102 h之后，蛋白質(zhì)基本在0.81 g/100 g左右保持不變。黏度在0～12 h隨發(fā)酵時(shí)間下降緩慢，在12～102 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在108 h之后，黏度基本在2.7 mPa·s左右，變化非常小。pH值在0～24 h隨發(fā)酵時(shí)間呈直線下降，在24 h之后隨發(fā)酵時(shí)間下降緩慢，在發(fā)酵后期基本保持不變。感官評(píng)分在0～102 h隨發(fā)酵時(shí)間直線上升，在102 h到達(dá)最高,為(90.38±0.16)分，之后便保持不變。

2.3 米酸湯在發(fā)酵過程中品質(zhì)相關(guān)性分析

根據(jù)表6進(jìn)行的米酸湯品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析表明：感官評(píng)分與乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.983、0.914、0.796)，即酸度越高，米酸湯感官評(píng)分越高；與色差值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.979)，即色差值越大，米酸感官評(píng)分越高，可能原因是微生物產(chǎn)生的酶將蛋白質(zhì)降解成氨基酸,糖類降解成單糖,兩者發(fā)生了Mailard反應(yīng)，產(chǎn)生了類黑精等物質(zhì)，使顏色發(fā)生變化，影響米酸湯的色澤，從而影響感官評(píng)分；感官評(píng)分與蛋白質(zhì)、黏度和pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.983、-0.987、-0.741)。黏度與蛋白質(zhì)、pH值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r為 0.989、0.689)；黏度與感官評(píng)分、色差值、乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r為-0.987、-0.953、-0.993、-0.898、-0.713)；一方面可能是混合菌在發(fā)酵過程中，未被水解的直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例發(fā)生改變,降解了淀粉中的支鏈淀粉，另一方面可能是蛋白質(zhì)大分子在混合乳酸菌的作用下水解成小分子的肽、氨基酸殘基等小分子物質(zhì)，使黏度下降，從而影響米酸湯的內(nèi)部形態(tài)和口感。綜上所述，米酸湯在發(fā)酵過程中品質(zhì)指標(biāo)間有著非常復(fù)雜的聯(lián)系。

注：**在P<0.01上差異極顯著。

2.4 米酸湯發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

混合乳酸菌在米酸湯中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示。

混合乳酸菌發(fā)酵周期為120 h，混合乳酸菌的生產(chǎn)過程隨發(fā)酵變化可分為4個(gè)階段。0～8 h為延滯期，菌體增長速度緩慢，總酸合成速度比較低，殘?zhí)堑南乃俣纫脖容^低；8～48 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，碳源充足，菌體快速生長，呈直線上升，殘?zhí)窍囊布涌?，總酸含量持續(xù)增多；48～108 h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體繁衍后代的速度逐漸下降，相對(duì)菌體死亡數(shù)開始漸漸增加，此時(shí)菌體繁衍子代的數(shù)量與死亡數(shù)漸漸達(dá)到平衡，米酸湯的pH值低，抑制了菌體生長，殘?zhí)窍幕静蛔?，乳酸合成速度降低，總酸含量基本保持不變?08 h之后菌體含量呈下降模式，進(jìn)入衰亡期。

2.5 模型擬合求解與檢驗(yàn)

2.5.1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)擬合求解

利用Origin 9對(duì)方程(2式)進(jìn)行線性擬合，得到的方程為：y=0.175 6x-3.685，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 6。由此可得k=0.175 6，Cm=0.122 4。

利用Origin 9將菌體生長穩(wěn)定期乳酸含量與時(shí)間進(jìn)行線性擬合，得到方程式為：P=0.097 2t+1.192 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5，由此可得n1=0.019 4。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，n1=0.019 4，P0=0.62，代入方程(3式)并過(0，0)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到方程為y=0.535 9x+0.028 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，由此可得n2=0.535 9。

利用Origin 9取菌體生長穩(wěn)定時(shí)期，將基質(zhì)殘?zhí)菨舛萐與時(shí)間t進(jìn)行線性擬合得到：S=-0.044 9t+12.318，相關(guān)系數(shù)R2=0.881 4，得到r1=0.009。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，r1=0.009，S0=19.15，代入方程(4式)并過(0，0)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到方程為y=1.665 8x+0.416 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，由此可得r2=0.166 5(表7)。

將各參數(shù)及初始條件值代入模型(2)式、(3)式、(4)式得：

菌體生長動(dòng)力學(xué)模型：

乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型：

殘?zhí)窍膭?dòng)力學(xué)模型：

S=50.03-1.485×

2.5.2 模型驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的真實(shí)性，用Origin 9得到混合乳酸菌發(fā)酵過程的擬合曲線，如圖5所示。從圖5中可以看出3個(gè)模型的模型值與實(shí)驗(yàn)值擬合曲線比較理想。模型的相關(guān)性均在0.01水平(雙側(cè))顯著相關(guān)，菌體生長動(dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.998**；乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.999**；殘?zhí)窍膭?dòng)力學(xué)模型Pearson相關(guān)性0.992**。較好地反應(yīng)了實(shí)際的發(fā)酵過程，表明了模型對(duì)米酸湯發(fā)酵過程具有一定的指導(dǎo)意義。

2.6 米酸湯成分測(cè)定

混合菌發(fā)酵米酸湯(本研究混合菌發(fā)酵米酸湯發(fā)酵4 d時(shí)的樣品)、自然發(fā)酵米酸湯(不加入混合菌自然發(fā)酵的樣品)、貴州米酸湯產(chǎn)品(市場(chǎng)上購買的貴州米酸湯產(chǎn)品)各組分含量見表8?；旌习l(fā)酵米酸湯總酸低于貴州米酸湯產(chǎn)品，其有機(jī)酸(乳酸、酒石酸)、還原糖均高于自然發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品。與自然發(fā)酵米酸湯對(duì)比，混合發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、乳酸含量均有提高，乳酸占總酸的比例分別是95.98%、71.08%、28.86%，可見，混合發(fā)酵米酸湯中有機(jī)酸含量最多，都是通過發(fā)酵生成的有機(jī)酸，而貴州米酸湯產(chǎn)品中有機(jī)酸(以乳酸計(jì))只占總酸的28.86%，推測(cè)可能是后期發(fā)酵完調(diào)配了一些無機(jī)酸。

注：a,b,c代表不同水平之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.7 風(fēng)味結(jié)果分析

2.7.1 電子鼻

圖6為3種米酸湯的主成分分析(principal component analysis，PCA)，由圖6可知，第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為98.6%，第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為1.1%，二者之和達(dá)到99.7%,大于95%，因此可認(rèn)為此主成分二維圖能很好地表示出被測(cè)樣品的整體信息且成分間干擾小。其區(qū)分度(discrimination index，DI)達(dá)91.8%，一般情況下認(rèn)為DI值大于80%區(qū)分效果較好，DI值越大表示樣品間的距離越遠(yuǎn)，區(qū)分的效果越理想。由此可見，3種不同的米酸湯揮發(fā)性風(fēng)味成分有明顯區(qū)別。

2.7.2 電子舌

圖7表示3種米酸湯的PCA，由圖7可知，PC1的貢獻(xiàn)率為33.84%，PC2的貢獻(xiàn)率為18.51%，二者之和達(dá)到63.56%,小于95%，因此可認(rèn)為此主成分二維圖不能很好地表示出被測(cè)樣品的整體信息且成分間干擾大。其DI達(dá)90.27%，由此可見，3種不同的米酸湯的風(fēng)味成分有明顯區(qū)別。

3 結(jié)論

通過比較研究米酸湯在發(fā)酵過程中感官評(píng)分、蛋白質(zhì)、色差值、pH值和有機(jī)酸可知，米酸湯品質(zhì)指標(biāo)間有著非常復(fù)雜的相關(guān)性。

在米酸湯發(fā)酵過程當(dāng)中，描繪了混合乳酸菌株菌發(fā)酵的菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)曲線；并通過Origin 9非線性擬合得出菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型；通過比較菌體生長、乳酸合成和總糖消耗模型的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值，結(jié)果表明以上模型能夠較好地反映發(fā)酵情況，對(duì)后續(xù)的放大試驗(yàn)有一定的指導(dǎo)意義。

通過比較混合菌發(fā)酵米酸湯、自然發(fā)酵米酸湯和貴州米酸湯產(chǎn)品的組分發(fā)現(xiàn)，混合菌發(fā)酵米酸湯的乳酸、酒石酸、總酸、蛋白質(zhì)、還原糖均高于自然發(fā)酵米酸湯，總酸低于貴州米酸湯產(chǎn)品，但(乳酸∶總酸)高于貴州米酸湯產(chǎn)品。電子鼻、電子舌可有效區(qū)分不同米酸湯產(chǎn)品的風(fēng)味特征，作為米酸湯風(fēng)味分析的一種手段。