云南自然發(fā)酵火腿中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵特性研究

趙改名，李珊珊，崔文明，祝超智*，焦陽陽，李佳麒，銀峰，韓明山

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002) 2(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼，028000)

傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品具有高鹽、低水分的特點(diǎn)，儲存期長，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價(jià)值高[1]。它屬于在自然條件下，經(jīng)微生物或酶的作用，發(fā)生一系列生物化學(xué)及物理變化而形成的肉制品[2-3]。目前，我國發(fā)酵肉制品發(fā)展較慢，主要原因是缺少自主產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵劑，產(chǎn)品品種單一，加工過程難以控制，產(chǎn)品質(zhì)量難以穩(wěn)定等。通過篩選適合于肉制品發(fā)酵的優(yōu)良菌株并制備發(fā)酵劑，可以使一些產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的人工控制，并且開發(fā)更多樣的發(fā)酵肉制品，為發(fā)酵肉制品的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出的微生物，與產(chǎn)品品質(zhì)有密切的關(guān)系[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可降低產(chǎn)品pH值，賦予產(chǎn)品特殊的發(fā)酵風(fēng)味，改善組織質(zhì)構(gòu)，促進(jìn)色澤與風(fēng)味的形成[6-7]。同時(shí)，某些乳酸菌能產(chǎn)細(xì)菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長繁殖[8-10]，甚至還有某些乳酸菌具有降低產(chǎn)品中生物胺[11-13]、降低膽固醇[14]、抗氧化[15]等作用。但并非所有乳酸菌都適合作為肉制品發(fā)酵菌株，不同種甚至同一種的不同菌株間特性的差異都會使產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生極大的差別[16-17]。云南火腿是我國重要的傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)味肉制品，不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味與口感，而且具有悠久的歷史與深厚的文化底蘊(yùn)。本研究擬從云南傳統(tǒng)發(fā)酵火腿中分離篩選出符合發(fā)酵肉制品標(biāo)準(zhǔn)且產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐鹽性和耐亞硝酸鹽性好的乳酸菌菌株，為云南火腿的工業(yè)化生產(chǎn)及肉制品發(fā)酵劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：云南火腿(農(nóng)家自制)

試劑：MRS瓊脂、MRS肉湯，北京路橋技術(shù)股份有限公司；瓊脂、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物，北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，北京天根試劑；CaCO3、NaCl、NaNO2、葡萄糖、MnSO4、MgSO2、乙酸鈉、檸檬酸鈉、MnO2、KOH等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD無菌操作臺，美國Airtech公司；TGradient梯度PCR儀，德國Biometra公司；EC3-310凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；DYY-12電泳儀，北京市六一儀器廠；DHP-9272低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡，日本尼康公司；UV-2600紫外分光光度儀，日本島津(Shimadzu)公司；Easy MIX拍擊式均質(zhì)儀，梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；VORTEX-2 GENIE渦旋震蕩器，美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

參考《GB 4789.35—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，稱取樣品25 g，剪碎，加入225 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，并用無菌生理鹽水依次做10倍稀釋，選擇3個(gè)適宜稀釋度，分別取200 μL稀釋液涂布于MRS+3% CaCO3(質(zhì)量分?jǐn)?shù))培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑選有明顯溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態(tài)的菌落，反復(fù)劃線純化。對純化好的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗(yàn)，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、且不形成芽孢的菌株作為初篩菌株。

1.3.2 菌株復(fù)篩試驗(yàn)

產(chǎn)酸能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，測定pH。

發(fā)酵性能測定[18-19]：葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生檢測試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、過氧化氫產(chǎn)生檢測試驗(yàn)。

NaCl和NaNO2耐受性測定：參考張曉東[20]的方法進(jìn)行測定。

生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定：參考潘曉倩等[21]的方法進(jìn)行測定。

不同溫度條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600。

不同pH條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的pH。

1.3.3 生理生化鑒定

采用生化鑒定試劑盒進(jìn)行糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，并以所得DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(30 μL)：buffer 3 μL，dNTP 2 μL，模板1 μL，引物27F 3 μL，引物1492R3 μL，酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)至終體積30 μL；PCR擴(kuò)增條件：第1階段：95 ℃預(yù)變性5 min；第2階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；第3階段：72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，送北京六合華大基因科技有限公司(武漢分公司)測序，應(yīng)用BLAST程序，將測序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重比較法，顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。生長曲線及產(chǎn)酸曲線的結(jié)果使用Origin Pro 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和初步篩選結(jié)果

從云南火腿中通過MRS+3% CaCO3的培養(yǎng)基篩選乳酸菌，多次純化后，挑選有明顯溶鈣圈且具有典型乳酸菌菌落特征，革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株。共得到20株乳酸菌，并分別編號為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20。

2.2 菌株的產(chǎn)酸能力

乳酸菌菌株的產(chǎn)酸性能是決定加工發(fā)酵肉制品成功與否及安全性的重要因素[22]。由圖1可知，所有菌株在24 h pH均達(dá)到4.0以下。選取產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的9株菌，即24 h pH≤3.85的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 菌株的發(fā)酵性能

菌株的發(fā)酵特性決定其是否能作為肉制品發(fā)酵菌株。篩選的菌株若具有產(chǎn)H2S、產(chǎn)H2O2、精氨酸產(chǎn)氨、葡萄糖產(chǎn)氣等特性會嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤等，使產(chǎn)品品質(zhì)降低[23]。由表1可知，上述9株菌均不具有以上特性，符合篩選要求。菌株若有適當(dāng)?shù)牡鞍追纸饽芰稍黾赢a(chǎn)品的風(fēng)味，但以上菌株均不具有蛋白分解能力，這與RAQUEL等[24]的研究一致。并且有研究表明[25-27]，在發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生風(fēng)味的主要是微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，并非乳酸菌。乳酸菌菌株可與微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌或風(fēng)味蛋白酶復(fù)配使用，從而使產(chǎn)品產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。菌株的脂肪分解能力容易使產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，從而縮短產(chǎn)品的貨架期，所以菌株不應(yīng)具有脂肪分解能力。綜上所述，上述9株菌的發(fā)酵特性均符合要求，可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。

注：“-”表示反應(yīng)呈陰性；“+”表示反應(yīng)呈陽性

2.4 菌株對NaCl的耐受性

發(fā)酵肉制品中食鹽的添加量一般為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%～3%，在一些特殊的產(chǎn)品如色拉米香腸的加工中，食鹽添加量更高。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，水分含量的降低，食鹽含量也會相對提高，所以要求篩選的菌株有較好的NaCl耐受性。由圖2可知，不同菌株對NaCl的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)；陳衛(wèi)等[28]也表明，即使是相同的屬不同的種，甚至不同亞種的乳酸菌，耐鹽能力也會有所不同。當(dāng)NaCl添加量達(dá)到6%時(shí)，菌株生長受到不同程度的抑制。其中H8的耐受性最好(2.69→2.08)，H4的耐鹽性最差(2.50→1.52)。這可能是因?yàn)楦啕}濃度會引起高滲透壓，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)水分外流，使細(xì)胞胞質(zhì)分離，從而引起細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長，甚至死亡[29-30]。

2.5 菌株對NaNO2的耐受性

發(fā)酵肉制品中添加亞硝酸鹽有促進(jìn)發(fā)色、增加風(fēng)味、抑制微生物的作用，尤其可以有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌[31]。但過量的亞硝酸鹽會對人體造成潛在的危害，國標(biāo)中對亞硝酸鹽在食品中的添加量有明確的規(guī)定。該試驗(yàn)添加的亞硝酸鈉的最大量為150 mg/kg，由圖3可知，不同菌株對NaNO2的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)。但當(dāng)NaNO2添加量為150 mg/kg時(shí),OD值均在2.0以上，整體表現(xiàn)出較好的NaNO2耐受性，這說明當(dāng)遇到NaNO2脅迫時(shí)，菌株自身有較好的調(diào)節(jié)能力。這可能與菌株的相容性調(diào)控系統(tǒng)、熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)、糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)以及胞內(nèi)離子平衡等有關(guān)[32]。

綜合考慮上述所有指標(biāo)，選擇符合發(fā)酵肉制品標(biāo)準(zhǔn)要求且產(chǎn)酸較好，NaCl和NaNO2耐受性最好的菌株即H8為目標(biāo)菌株，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.6 菌株在不同溫度條件下的生長能力

發(fā)酵肉制品的發(fā)酵溫度一般為15～40 ℃[33]。由圖4可知，不同溫度條件下菌株的生長能力存在顯著性差異(P<0.05)，在10 ℃條件下生長受到抑制，20～40 ℃均能較好的生長，且在30 ℃條件下生長最好，而在李建等[34]的研究中，其優(yōu)勢菌株在40 ℃條件下生長最好，這種差異可能是由菌株的不同引起的。

2.7 菌株在不同pH條件下的生長能力

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵肉制品的pH不斷降低，所以要求菌株對酸有一定程度的耐受性。由圖5可知，菌株在不同pH值條件下的生長存在顯著性差異(P<0.05)。菌株在pH 4.0時(shí)仍能較好的生長，適合作為肉制品發(fā)酵劑潛在菌株。

2.8 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

如圖6所示，0～2 h內(nèi)為延滯期，時(shí)間較短，在此期間內(nèi)，生長速度和產(chǎn)酸速度較慢。2～7 h內(nèi)為對數(shù)生長期，此階段OD600由0.19增加至2.25。此外，該菌株的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，其中主要在對數(shù)生長期產(chǎn)酸較多。菌株生長速度和產(chǎn)酸速度快有助于在肉制品中的快速定植、生長及產(chǎn)酸，從而抑制其他腐敗微生物的生長，保證產(chǎn)品的質(zhì)量[35]。

2.9 菌株鑒定

2.9.1 形態(tài)及生理生化鑒定

菌株H8呈乳白色圓形菌落，直徑1～2 cm，表面光滑凸起；鏡檢結(jié)果如圖7所示，為革蘭氏陽性球菌，無鞭毛、無芽孢。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，根據(jù)形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將H8菌株鑒定為片球菌屬細(xì)菌。

注：“-”表示反應(yīng)呈陰性；“+”表示反應(yīng)呈陽性。

2.9.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)16S rDNA測序，得到長度為1 246 bp的H8菌株16S rDNA序列。用BLAST進(jìn)行序列同源性比對，并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖8。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，H8菌株與戊糖片球菌親緣關(guān)系最近，這與形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致，由此可以進(jìn)一步將H8菌株歸屬于戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以云南火腿為原料，初步篩選得到20株革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性、符合乳酸菌基本特征且具有明顯溶鈣圈的菌株。通過研究菌株的產(chǎn)酸能力、發(fā)酵特性及對NaCl和NaNO2的耐受性，得到1株性能較好的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。該菌株在不同pH和不同溫度條件下的生長能力均符合發(fā)酵肉制品菌株的基本要求，且該菌株生長速度和產(chǎn)酸速度較快，生長延滯期短，可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。