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    云南自然發(fā)酵火腿中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵特性研究

    2020-01-07 03:27:10趙改名李珊珊崔文明祝超智焦陽陽李佳麒銀峰韓明山
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸發(fā)酵劑耐受性

    趙改名,李珊珊,崔文明,祝超智*,焦陽陽,李佳麒,銀峰,韓明山

    1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州,450002) 2(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)股份有限公司,內(nèi)蒙古 通遼,028000)

    傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品具有高鹽、低水分的特點(diǎn),儲存期長,風(fēng)味獨(dú)特,營養(yǎng)價(jià)值高[1]。它屬于在自然條件下,經(jīng)微生物或酶的作用,發(fā)生一系列生物化學(xué)及物理變化而形成的肉制品[2-3]。目前,我國發(fā)酵肉制品發(fā)展較慢,主要原因是缺少自主產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵劑,產(chǎn)品品種單一,加工過程難以控制,產(chǎn)品質(zhì)量難以穩(wěn)定等。通過篩選適合于肉制品發(fā)酵的優(yōu)良菌株并制備發(fā)酵劑,可以使一些產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的人工控制,并且開發(fā)更多樣的發(fā)酵肉制品,為發(fā)酵肉制品的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出的微生物,與產(chǎn)品品質(zhì)有密切的關(guān)系[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌可降低產(chǎn)品pH值,賦予產(chǎn)品特殊的發(fā)酵風(fēng)味,改善組織質(zhì)構(gòu),促進(jìn)色澤與風(fēng)味的形成[6-7]。同時(shí),某些乳酸菌能產(chǎn)細(xì)菌素,抑制腐敗菌和致病菌生長繁殖[8-10],甚至還有某些乳酸菌具有降低產(chǎn)品中生物胺[11-13]、降低膽固醇[14]、抗氧化[15]等作用。但并非所有乳酸菌都適合作為肉制品發(fā)酵菌株,不同種甚至同一種的不同菌株間特性的差異都會使產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生極大的差別[16-17]。云南火腿是我國重要的傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)味肉制品,不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味與口感,而且具有悠久的歷史與深厚的文化底蘊(yùn)。本研究擬從云南傳統(tǒng)發(fā)酵火腿中分離篩選出符合發(fā)酵肉制品標(biāo)準(zhǔn)且產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐鹽性和耐亞硝酸鹽性好的乳酸菌菌株,為云南火腿的工業(yè)化生產(chǎn)及肉制品發(fā)酵劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    材料:云南火腿(農(nóng)家自制)

    試劑:MRS瓊脂、MRS肉湯,北京路橋技術(shù)股份有限公司;瓊脂、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物,北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒,北京天根試劑;CaCO3、NaCl、NaNO2、葡萄糖、MnSO4、MgSO2、乙酸鈉、檸檬酸鈉、MnO2、KOH等均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SW-CJ-2FD無菌操作臺,美國Airtech公司;TGradient梯度PCR儀,德國Biometra公司;EC3-310凝膠成像系統(tǒng),美國UVP公司;DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠;DHP-9272低溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡,日本尼康公司;UV-2600紫外分光光度儀,日本島津(Shimadzu)公司;Easy MIX拍擊式均質(zhì)儀,梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;VORTEX-2 GENIE渦旋震蕩器,美國Scientific Industries公司。

    1.3 方法

    1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

    參考《GB 4789.35—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》,稱取樣品25 g,剪碎,加入225 mL無菌生理鹽水,用均質(zhì)機(jī)均質(zhì),并用無菌生理鹽水依次做10倍稀釋,選擇3個(gè)適宜稀釋度,分別取200 μL稀釋液涂布于MRS+3% CaCO3(質(zhì)量分?jǐn)?shù))培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)24~48 h。挑選有明顯溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態(tài)的菌落,反復(fù)劃線純化。對純化好的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗(yàn),選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、且不形成芽孢的菌株作為初篩菌株。

    1.3.2 菌株復(fù)篩試驗(yàn)

    產(chǎn)酸能力測定:將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)24 h,測定pH。

    發(fā)酵性能測定[18-19]:葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生檢測試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、過氧化氫產(chǎn)生檢測試驗(yàn)。

    NaCl和NaNO2耐受性測定:參考張曉東[20]的方法進(jìn)行測定。

    生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定:參考潘曉倩等[21]的方法進(jìn)行測定。

    不同溫度條件下的生長能力測定:將活化3代的菌液接種于液體培養(yǎng)基中,分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h,測定菌液的OD600。

    不同pH條件下的生長能力測定:將活化3代的菌液分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,測定菌液的pH。

    1.3.3 生理生化鑒定

    采用生化鑒定試劑盒進(jìn)行糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn),參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進(jìn)行初步鑒定。

    1.3.4 16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定

    按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取,并以所得DNA 為模板,用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(30 μL):buffer 3 μL,dNTP 2 μL,模板1 μL,引物27F 3 μL,引物1492R3 μL,酶0.2 μL,ddH2O補(bǔ)至終體積30 μL;PCR擴(kuò)增條件:第1階段:95 ℃預(yù)變性5 min;第2階段:95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35 個(gè)循環(huán);第3階段:72 ℃延伸10 min。

    PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后,送北京六合華大基因科技有限公司(武漢分公司)測序,應(yīng)用BLAST程序,將測序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理與分析

    所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重比較法,顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。生長曲線及產(chǎn)酸曲線的結(jié)果使用Origin Pro 8.0進(jìn)行作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的分離和初步篩選結(jié)果

    從云南火腿中通過MRS+3% CaCO3的培養(yǎng)基篩選乳酸菌,多次純化后,挑選有明顯溶鈣圈且具有典型乳酸菌菌落特征,革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株。共得到20株乳酸菌,并分別編號為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20。

    2.2 菌株的產(chǎn)酸能力

    乳酸菌菌株的產(chǎn)酸性能是決定加工發(fā)酵肉制品成功與否及安全性的重要因素[22]。由圖1可知,所有菌株在24 h pH均達(dá)到4.0以下。選取產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的9株菌,即24 h pH≤3.85的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    2.3 菌株的發(fā)酵性能

    菌株的發(fā)酵特性決定其是否能作為肉制品發(fā)酵菌株。篩選的菌株若具有產(chǎn)H2S、產(chǎn)H2O2、精氨酸產(chǎn)氨、葡萄糖產(chǎn)氣等特性會嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤等,使產(chǎn)品品質(zhì)降低[23]。由表1可知,上述9株菌均不具有以上特性,符合篩選要求。菌株若有適當(dāng)?shù)牡鞍追纸饽芰稍黾赢a(chǎn)品的風(fēng)味,但以上菌株均不具有蛋白分解能力,這與RAQUEL等[24]的研究一致。并且有研究表明[25-27],在發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生風(fēng)味的主要是微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌,并非乳酸菌。乳酸菌菌株可與微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌或風(fēng)味蛋白酶復(fù)配使用,從而使產(chǎn)品產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。菌株的脂肪分解能力容易使產(chǎn)品腐敗變質(zhì),從而縮短產(chǎn)品的貨架期,所以菌株不應(yīng)具有脂肪分解能力。綜上所述,上述9株菌的發(fā)酵特性均符合要求,可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。

    注:“-”表示反應(yīng)呈陰性;“+”表示反應(yīng)呈陽性

    2.4 菌株對NaCl的耐受性

    發(fā)酵肉制品中食鹽的添加量一般為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%~3%,在一些特殊的產(chǎn)品如色拉米香腸的加工中,食鹽添加量更高。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,水分含量的降低,食鹽含量也會相對提高,所以要求篩選的菌株有較好的NaCl耐受性。由圖2可知,不同菌株對NaCl的耐受性存在顯著性差異(P<0.05);陳衛(wèi)等[28]也表明,即使是相同的屬不同的種,甚至不同亞種的乳酸菌,耐鹽能力也會有所不同。當(dāng)NaCl添加量達(dá)到6%時(shí),菌株生長受到不同程度的抑制。其中H8的耐受性最好(2.69→2.08),H4的耐鹽性最差(2.50→1.52)。這可能是因?yàn)楦啕}濃度會引起高滲透壓,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)水分外流,使細(xì)胞胞質(zhì)分離,從而引起細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞停止生長,甚至死亡[29-30]。

    2.5 菌株對NaNO2的耐受性

    發(fā)酵肉制品中添加亞硝酸鹽有促進(jìn)發(fā)色、增加風(fēng)味、抑制微生物的作用,尤其可以有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌[31]。但過量的亞硝酸鹽會對人體造成潛在的危害,國標(biāo)中對亞硝酸鹽在食品中的添加量有明確的規(guī)定。該試驗(yàn)添加的亞硝酸鈉的最大量為150 mg/kg,由圖3可知,不同菌株對NaNO2的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)。但當(dāng)NaNO2添加量為150 mg/kg時(shí),OD值均在2.0以上,整體表現(xiàn)出較好的NaNO2耐受性,這說明當(dāng)遇到NaNO2脅迫時(shí),菌株自身有較好的調(diào)節(jié)能力。這可能與菌株的相容性調(diào)控系統(tǒng)、熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)、糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)以及胞內(nèi)離子平衡等有關(guān)[32]。

    綜合考慮上述所有指標(biāo),選擇符合發(fā)酵肉制品標(biāo)準(zhǔn)要求且產(chǎn)酸較好,NaCl和NaNO2耐受性最好的菌株即H8為目標(biāo)菌株,進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    2.6 菌株在不同溫度條件下的生長能力

    發(fā)酵肉制品的發(fā)酵溫度一般為15~40 ℃[33]。由圖4可知,不同溫度條件下菌株的生長能力存在顯著性差異(P<0.05),在10 ℃條件下生長受到抑制,20~40 ℃均能較好的生長,且在30 ℃條件下生長最好,而在李建等[34]的研究中,其優(yōu)勢菌株在40 ℃條件下生長最好,這種差異可能是由菌株的不同引起的。

    2.7 菌株在不同pH條件下的生長能力

    隨著發(fā)酵的進(jìn)行,發(fā)酵肉制品的pH不斷降低,所以要求菌株對酸有一定程度的耐受性。由圖5可知,菌株在不同pH值條件下的生長存在顯著性差異(P<0.05)。菌株在pH 4.0時(shí)仍能較好的生長,適合作為肉制品發(fā)酵劑潛在菌株。

    2.8 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

    如圖6所示,0~2 h內(nèi)為延滯期,時(shí)間較短,在此期間內(nèi),生長速度和產(chǎn)酸速度較慢。2~7 h內(nèi)為對數(shù)生長期,此階段OD600由0.19增加至2.25。此外,該菌株的產(chǎn)酸能力較強(qiáng),其中主要在對數(shù)生長期產(chǎn)酸較多。菌株生長速度和產(chǎn)酸速度快有助于在肉制品中的快速定植、生長及產(chǎn)酸,從而抑制其他腐敗微生物的生長,保證產(chǎn)品的質(zhì)量[35]。

    2.9 菌株鑒定

    2.9.1 形態(tài)及生理生化鑒定

    菌株H8呈乳白色圓形菌落,直徑1~2 cm,表面光滑凸起;鏡檢結(jié)果如圖7所示,為革蘭氏陽性球菌,無鞭毛、無芽孢。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示,根據(jù)形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果,對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》,初步將H8菌株鑒定為片球菌屬細(xì)菌。

    注:“-”表示反應(yīng)呈陰性;“+”表示反應(yīng)呈陽性。

    2.9.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

    經(jīng)16S rDNA測序,得到長度為1 246 bp的H8菌株16S rDNA序列。用BLAST進(jìn)行序列同源性比對,并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖8。

    由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,H8菌株與戊糖片球菌親緣關(guān)系最近,這與形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致,由此可以進(jìn)一步將H8菌株歸屬于戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)以云南火腿為原料,初步篩選得到20株革蘭氏陽性,過氧化氫酶陰性、符合乳酸菌基本特征且具有明顯溶鈣圈的菌株。通過研究菌株的產(chǎn)酸能力、發(fā)酵特性及對NaCl和NaNO2的耐受性,得到1株性能較好的菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。該菌株在不同pH和不同溫度條件下的生長能力均符合發(fā)酵肉制品菌株的基本要求,且該菌株生長速度和產(chǎn)酸速度較快,生長延滯期短,可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株。

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