創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)脂肪組織石蠟切片制作過程中常見問題分析

陳文婧，郝興霞，張東澤

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010021）

脂肪組織可以分成白色脂肪組織和棕色脂肪組織。人們通常所說的脂肪組織是指白色脂肪組織，新鮮時(shí)呈黃色，該脂肪細(xì)胞為圓形或卵圓形，細(xì)胞內(nèi)含大的脂肪滴，主要分布于皮下組織、網(wǎng)膜和腸系膜等部位。

脂肪組織早期被人們認(rèn)為是儲(chǔ)存能量的器官?，F(xiàn)如今，人類生活水平不斷提高，由脂肪引起的一系列疾病也隨之高發(fā)，人們逐漸意識(shí)到脂肪細(xì)胞的分化對(duì)脂肪細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化具有重大影響[1]。脂肪組織通過產(chǎn)生游離脂肪酸和炎性因子引起胰島素抵抗、脂代謝異常、內(nèi)皮功能障礙、血栓及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2]。在臨床的病理診斷中，有很多富含脂肪組織（如乳腺組織）的病理切片，而切片質(zhì)量的好壞直接影響了醫(yī)生診斷的準(zhǔn)確性。脂肪組織結(jié)構(gòu)特殊，其常規(guī)石蠟切片大多結(jié)構(gòu)不完整，組織破損甚至脫落，給鏡下觀察帶來很多不便，直接影響了學(xué)生的學(xué)習(xí)和病理的診斷。因此脂肪組織被列為不易應(yīng)用術(shù)中快速活檢的范圍[3]。基于此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)石蠟切片的常見問題，從取材、固定、脫水、透明、烤片、染色等步驟分析切片制作過程中的注意事項(xiàng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲醛溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇、二甲苯溶液，分析純級(jí)別（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、Solarbio蘇木精染液G1140500ml、Solarbio伊紅染液G1100500ml、切片石蠟500 g（北京首醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)科技有限公司）、10004160中性樹膠100g（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

KEDEEKD-BMⅢ電腦生物組織包埋機(jī)（南京依貝儀器設(shè)備有限公司）；LeicaRM2235切片機(jī)、LeicaHi1220烤片機(jī)、LeicaHi1210撈片機(jī)均為Leica公司生產(chǎn)。

MoticB1SERIES顯微鏡，Motic公司生產(chǎn)

1.2 脂肪切片制作步驟

1.2.1 取材和固定

采用乙醚麻醉法處死大鼠，十字法解剖，取腹腔皮下和腸系膜處脂肪組織。放入10%的甲醛溶液中固定12h后，將組織修成1m3的小塊，繼續(xù)固定24h。

1.2.2 脫水、透明、浸蠟和包埋

固定后的脂肪組織放入包埋盒中用流水沖洗12h以上，取出放入梯度乙醇溶液中脫水（70%乙醇3h、80%乙醇3h、90%乙醇過夜、95%乙醇Ⅰ1.5h、95%乙醇Ⅱ1.5h、100%乙醇Ⅰ1.5h、100%乙醇Ⅱ1.5h）；脫水后脂肪組織放入二甲苯溶液中透明；透明后的脂肪組織放入包埋機(jī)中浸蠟包埋，蠟Ⅰ30min，蠟Ⅱ30min，蠟Ⅲ30min。

1.2.3 切片和染色

取包埋好的蠟塊連續(xù)切片，切片厚度6μm。用免洗載玻片撈片、烤片后，進(jìn)行HE染色。

2 常見問題分析

2.1 取材浪費(fèi)

處死大鼠取脂肪組織制作脂肪組織切片時(shí)，如果不有效利用大鼠的其他組織器官，會(huì)造成對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)。因此取材時(shí)應(yīng)盡量在其他老師、學(xué)生做實(shí)驗(yàn)的同時(shí)取用組織，或者在學(xué)生上大鼠解剖課程時(shí)取材，從而避免浪費(fèi)。

2.2 固定不徹底

由于脂肪組織內(nèi)含有大量的脂肪滴，密度較小，一般漂浮于固定液的上層，從而導(dǎo)致脂肪組織無法被徹底固定（如圖1）。本實(shí)驗(yàn)采用10%的甲醛溶液對(duì)組織進(jìn)行固定，組織在固定液中始終處于漂浮狀態(tài)，因此在試驗(yàn)中要盡可能地延長固定時(shí)間，以免因脂肪組織固定不徹底而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

圖1 脂肪組織在福爾馬林固定液中漂浮

2.3 脫水時(shí)間的選擇和分配

基于脂肪組織的特殊結(jié)構(gòu)，應(yīng)適當(dāng)延長組織的脫水時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)室沒有購置組織脫水機(jī)的情況下，需要人工完成脫水過程，因此要合理設(shè)置脫水時(shí)間。既要保證脂肪組織在脫水劑中過夜，又要保證實(shí)驗(yàn)在合理的時(shí)間范圍內(nèi)完成，這是本實(shí)驗(yàn)中需要解決的一個(gè)重要問題。

2.4 透明時(shí)間的選擇

脂肪組織和其他組織不同，如果透明時(shí)間不夠，二甲苯不能完全進(jìn)入脂肪細(xì)胞中，會(huì)影響組織的浸蠟，使得包埋后的組織會(huì)慢慢滲出脂肪滴，無法進(jìn)行切片。

2.5 烤片溫度的選擇

脂肪組織在預(yù)熱時(shí)容易融化，因此選擇合適的烤片溫度尤為重要。溫度過高，組織因融化無法貼合于載玻片上；溫度過低，石蠟不易融化，會(huì)在組織處產(chǎn)生很多小氣泡，破壞組織結(jié)構(gòu)，影響切片的質(zhì)量。

2.6 染色后著色淺

如圖2所示，脂肪細(xì)胞含大量脂肪滴，細(xì)胞核被擠在一側(cè)，切片染色結(jié)果經(jīng)常是大面積粉染結(jié)構(gòu)，而蘇木精染色細(xì)胞核著色較淺，不易觀察，影響切片質(zhì)量。為了得到染色效果較好的切片，應(yīng)該適當(dāng)延長組織在蘇木精染液中的染色時(shí)間。

圖2 HE染色后的脂肪組織，細(xì)胞核著色較淺

3 結(jié)論

石蠟切片是目前動(dòng)物組織細(xì)胞制片的主要方法之一。與冰凍切片相比，采用石蠟切片方法除對(duì)抗原敏感性有影響外，在細(xì)胞形態(tài)清晰度、陽性反應(yīng)物斑塊顯色及降低假陽性誤斷率等方面均占有優(yōu)勢(shì)[4]。在制作脂肪組織石蠟切片實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)做到節(jié)約動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料，選擇合適的脫水、透明、烤片、染色時(shí)間，從而提高切片質(zhì)量，為今后的教學(xué)和臨床工作提供方便。