混凝土自修復(fù)菌Bacillus sp.芽孢生產(chǎn)和萌發(fā)條件的優(yōu)化

羅 順，劉 冰，張金龍，李秋偉，鄧 旭

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518055；2)深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通與環(huán)境學(xué)院，廣東深圳 518172

混凝土是被廣泛應(yīng)用的建筑材料，服役過程中由于自然環(huán)境和外界壓力的影響，表面和內(nèi)部容易出現(xiàn)裂縫，破壞建筑結(jié)構(gòu)，縮短建筑物的使用年限.1973年，BOQUET等[1]研究發(fā)現(xiàn)，眾多土壤微生物具有成礦能力，受此啟發(fā)，GOLLAPUDI等[2]利用細(xì)菌誘導(dǎo)碳酸鈣的方式對(duì)建筑材料滲漏現(xiàn)象進(jìn)行控制，開啟了混凝土的微生物自修復(fù)研究.在混凝土出現(xiàn)裂縫時(shí)，微生物通過呼吸代謝產(chǎn)生CO2，在堿性條件下形成CO32-，與環(huán)境中的Ca2+反應(yīng)生成CaCO3沉積在裂縫表面，從而填補(bǔ)裂縫[3].

混凝土內(nèi)部是高壓、缺氧、缺水的脅迫環(huán)境，水化過程中pH值甚至高達(dá)13，對(duì)微生物的生長極為不利.BUNDUR等[4]將巴氏芽孢八疊球菌(Sporosarcinapasteurii)的營養(yǎng)細(xì)胞混入混凝土中，7 d后細(xì)菌存活率為0.1%，若同時(shí)混入營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)菌存活率也僅為3%.為了提高細(xì)菌的存活率，研究者開始嘗試將細(xì)菌以芽孢的形式預(yù)埋入混凝土中.相比于營養(yǎng)細(xì)胞，芽孢的抗逆能力強(qiáng)，尤其是能抵抗水泥水化過程中的強(qiáng)堿性環(huán)境和剪切力，有利于在混凝土中存活.當(dāng)混凝土開裂時(shí)，外界氧氣和水分進(jìn)入，促使芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞，修復(fù)裂縫.目前用于混凝土裂縫自修復(fù)的細(xì)菌基本上都屬于芽孢菌屬，如科氏芽孢桿菌(Bacilluscohnii)、巴氏芽孢八疊球菌(S.pasteurii)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[5]和球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)等.NAIN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過28 d的修復(fù)，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)使混凝土試塊抗壓強(qiáng)度提高22.5%，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)使混凝土試塊抗拉強(qiáng)度提高25.3%.LORS等[6]研究了嗜堿芽孢桿菌(Bacilluspseudofirmus)對(duì)混凝土裂縫的修復(fù)效果，通過提供外源乳酸鈣能使裂縫寬度減小155 ～ 179 μm.由此可見，利用微生物修復(fù)混凝土裂縫具有很好的應(yīng)用前景.

要實(shí)現(xiàn)混凝土裂縫的微生物自修復(fù)，首先需要將足夠數(shù)量的芽孢預(yù)置入混凝土；當(dāng)裂縫出現(xiàn)時(shí)，芽孢還要萌發(fā)生長成營養(yǎng)細(xì)胞后才能誘導(dǎo)碳酸鈣的形成.芽孢的生產(chǎn)和萌發(fā)受多種環(huán)境因素如溫度、pH值、金屬離子以及營養(yǎng)條件的影響，目前這方面的研究主要集中在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，對(duì)于應(yīng)用于混凝土自修復(fù)的礦化微生物鮮有涉及.本研究擬系統(tǒng)考察影響混凝土自修復(fù)細(xì)菌芽孢產(chǎn)量及萌發(fā)的主要因素，從而探明提高芽孢產(chǎn)率和萌發(fā)效率的優(yōu)化途徑，為實(shí)現(xiàn)混凝土裂縫的微生物自修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

一株嗜堿芽孢桿菌Bacillussp.，命名為B8，由深圳市福田區(qū)紅樹林沉積土篩選獲得.

1.1.2 培養(yǎng)基

1)菌種活化培養(yǎng)基(1 L).其中，牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；碳酸鈉9.54 g；碳酸氫鈉0.84 g.

2)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L).其中，氯化鉀0.476 g；磷酸二氫鉀0.02 g；氯化鈣0.17 g；六水合氯化鎂0.2 g；一水合硫酸錳0.01 g；硝酸銨0.3 g；酵母粉1 g；60%L-乳酸鈉1.87 g(單獨(dú)滅菌)；碳酸鈉5.3 g或碳酸氫鈉4.2 g(單獨(dú)滅菌).

3)芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基(1 L).其中，肌苷2.682 g；氯化鈉11.688 g；3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸22.132 g.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化培養(yǎng)

從4 ℃冰箱中取出菌種，用接種環(huán)刮取菌苔接入到50 mL培養(yǎng)基中，置于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h，備用.

1.2.2 芽孢發(fā)酵培養(yǎng)

將活化菌懸液稀釋，按體積分?jǐn)?shù)1%接種到50 mL芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，檢測芽孢產(chǎn)量.

1.2.3 芽孢濃度檢測

芽孢產(chǎn)量用芽孢濃度表征，具體過程為：取2 μL 待檢芽孢懸浮液滴加在細(xì)菌計(jì)數(shù)板中心計(jì)數(shù)區(qū)，隨機(jī)選取n個(gè)小格采用“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則記錄芽孢數(shù)量，計(jì)算芽孢濃度，為

其中，S為芽孢濃度；N為芽孢總數(shù)；n為格子數(shù).

1.2.4 芽孢發(fā)酵的單因素優(yōu)化

1)接種量.將活化后的菌懸液稀釋成1×107、1×108、1×109和2×109mL-14個(gè)濃度，按1%的體積比接種到對(duì)應(yīng)的錐形瓶(250 mL)中，每瓶裝有50 mL芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后的芽孢初始濃度分別為1×105、1×106、1×107和2×107mL-1.

2)碳源.選取葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖和淀粉6種糖類和甲酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉、海藻酸鈉、D-葡萄糖酸鈉和L-乳酸鈉6種有機(jī)酸鹽作為碳源，質(zhì)量濃度為1 g/L，進(jìn)行碳源種類篩選；獲得優(yōu)勢碳源后，設(shè)置質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/L進(jìn)行碳源濃度優(yōu)化.

3)氮源.選取硝酸鈉、硝酸銨、尿素、牛肉膏、蛋白胨和酵母粉作為氮源，質(zhì)量濃度為1 g/L，進(jìn)行氮源種類篩選；獲得優(yōu)勢氮源后，設(shè)置質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/L進(jìn)行氮源濃度優(yōu)化.

4)金屬離子.Mg2+和Mn2+分別來源于六水合氯化鎂和一水合硫酸錳，其中，Mg2+質(zhì)量濃度為0.06、0.12、0.24、0.36和0.48 g/L，Mn2+質(zhì)量濃度為1.6、3.2、4.8、6.4和8.0 mg/L.

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以芽孢濃度為考察指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)接種量、淀粉、酵母粉、Mg2+和Mn2+的用量進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，如表1.

表1 B8芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6 制備芽孢懸浮液

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基生產(chǎn)芽孢，在4 ℃、7 000 r/min的條件下離心10 min，去掉上清液，用無菌水洗滌再離心，重復(fù)10次.用滅菌的去離子水配置芽孢懸浮液，濃度為4×109mL-1，保存在4 ℃冰箱中，備用.

1.2.7 芽孢萌發(fā)檢測

在490 nm波長下，隨著芽孢萌發(fā)率增加，光密度值逐漸下降.實(shí)驗(yàn)中，利用光密度值的變化，判斷芽孢萌發(fā)狀態(tài)，并在相差顯微鏡下利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板檢測未萌發(fā)芽孢數(shù)，計(jì)算芽孢萌發(fā)率.具體過程如下：將芽孢懸浮液(濃度4×109mL-1)置于60 ℃水浴10 min，取200 μL至10 mL離心管中，再取1.8 mL芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基至離心管中，搖勻后取200 μL至96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀每隔30 min測量1次D(490)；將裝有芽孢的離心管置于30 ℃、150 r/min的條件下震蕩培養(yǎng)，待萌發(fā)穩(wěn)定后檢測未萌發(fā)芽孢數(shù)(參照1.2.3)，計(jì)算芽孢萌發(fā)率，為

其中，G為芽孢萌發(fā)率；S為未萌發(fā)芽孢濃度；S0為初始芽孢濃度.

1.2.8 芽孢萌發(fā)條件優(yōu)化

1)萌發(fā)劑.分別選取L-丙氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和肌苷為萌發(fā)劑，質(zhì)量濃度均為3 g/L，進(jìn)行萌發(fā)劑種類篩選.獲得優(yōu)勢萌發(fā)劑后，設(shè)置濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和5.00 g/L進(jìn)行萌發(fā)劑濃度優(yōu)化.

2)pH值.將芽孢萌發(fā)體系的初始pH值分別調(diào)節(jié)為7、8、9、10、11、12和13，待萌發(fā)穩(wěn)定后計(jì)算芽孢萌發(fā)率.

3)金屬離子.芽孢的萌發(fā)也需要金屬離子的參與，菌株篩選自金屬離子種類多、含量高的濱海濕地，因此，以海水中金屬離子的含量為依據(jù)，探究了Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Mn2+5種主要金屬離子對(duì)芽孢萌發(fā)的影響.在芽孢萌發(fā)體系中分別加入Na+、K+、Mg2+、Ca2+和Mn2+，質(zhì)量濃度分別為10.500、0.400、0.030、0.600和0.011 g/L.其中，系列1只加金屬離子，不加萌發(fā)劑，系列2同時(shí)添加金屬離子和萌發(fā)劑，隨后探究對(duì)芽孢萌發(fā)具有影響作用的金屬離子的濃度效應(yīng).待芽孢萌發(fā)穩(wěn)定后，計(jì)算萌發(fā)率.

以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 芽孢生產(chǎn)條件優(yōu)化

2.1.1 接種量

接種量不同，芽孢產(chǎn)量有明顯差異.如圖1，接種量為1×107mL-1時(shí)，培養(yǎng)48 h后芽孢濃度為2.37×108mL-1，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，芽孢濃度基本保持穩(wěn)定.接種量為1×105mL-1和1×106mL-1時(shí)，最終芽孢濃度都在1×108mL-1以下；接種量為2×107mL-1時(shí)，48 h芽孢濃度超過3.5×108mL-1，但進(jìn)一步延長培養(yǎng)時(shí)間，部分芽孢萌發(fā)生長成營養(yǎng)細(xì)胞，芽孢濃度反而下降.接種量是芽孢產(chǎn)量的影響因素之一，嚴(yán)濤等[7]研究表明，接種量為4%時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌BC01(Bacilluscoagulans)產(chǎn)孢率可達(dá)65.1%，但繼續(xù)增大接種量則產(chǎn)孢率急劇下降.這可能是因?yàn)榻臃N量過大導(dǎo)致營養(yǎng)細(xì)胞生長過快，環(huán)境中有害代謝產(chǎn)物積累過多所致.

圖1 接種量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.2 碳源

如圖2顯示了不同碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響.其中，CK為對(duì)照組.由圖2可見，以淀粉為碳源產(chǎn)芽孢效果最好.隨著淀粉質(zhì)量濃度的增加，芽孢濃度呈先增后降趨勢.淀粉質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，芽孢濃度最高，為3.76×108mL-1.由此可見，高濃度的淀粉不利于芽孢生成.左肖肖等[8]研究也表明，可溶性淀粉是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)芽孢生產(chǎn)的最適碳源，添加量為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，芽孢濃度為6×106mL-1，之后再增加淀粉含量，芽孢產(chǎn)量反而下降，與本研究一致.這可能是因?yàn)榧尤敫邼舛鹊矸蹫榧?xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞的生長繁殖提供了充足的碳源，營養(yǎng)脅迫的限制減小，導(dǎo)致芽孢萌發(fā)，從而芽孢產(chǎn)量下降.此外，淀粉實(shí)惠易得，因此本實(shí)驗(yàn)選取淀粉作為B8芽孢生產(chǎn)的碳源.

圖2 不同碳源和淀粉濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.3 氮源

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以酵母粉為氮源芽孢產(chǎn)率高于其他種類氮源，且隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，芽孢濃度呈先增后降趨勢(圖3).酵母粉濃度為2 g/L時(shí)，芽孢濃度最大，為4.34×108mL-1.在芽孢生產(chǎn)工藝中，酵母粉是一種常見的氮源，如在側(cè)孢芽孢桿菌C5(B.laterosporusC5)生產(chǎn)過程中，以酵母膏為氮源效果最佳[9].馮鑫等[10]研究表明，以酵母浸粉為氮源，使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量提高了12.81倍.左肖肖[8]等對(duì)枯草芽孢桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，加入酵母膏的濃度為0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，芽孢量為6.1×107mL-1，濃度增加到1.2%時(shí)，芽孢量下降到1.7×106mL-1.由此可見，低濃度酵母粉有利于芽孢生產(chǎn).

2.1.4 金屬離子

Mg2+和Mn2+是影響芽孢生產(chǎn)的主要金屬離子，隨著離子濃度的增加，芽孢濃度呈先增后降的趨勢(圖4).Mg2+質(zhì)量濃度為0.24 g/L時(shí)，芽孢濃度最大，為2.94×108mL-1；Mn2+質(zhì)量濃度為4.8 mg/L時(shí)，芽孢濃度最大，為1.88×108mL-1.可見，Mg2+和Mn2+的濃度過低或過高都不利于芽孢形成.Mg2+和Mn2+是細(xì)菌生長和芽孢生成所需的微量元素，Mg2+能激活多種代謝酶，影響Na+和Ca2+等離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，Mn2+則是L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和超氧化物歧化酶等關(guān)鍵酶的輔助因子.然而，在芽孢生產(chǎn)過程中，不同菌種所需Mg2+和Mn2+的含量存在差異.董佩佩等[11]對(duì)一株凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，所需MgSO4的最優(yōu)質(zhì)量濃度為0.49 g/L.吳迎奔等[9]對(duì)側(cè)孢芽孢桿菌C5研究發(fā)現(xiàn)，添加0.2 g/L的 MnSO4有助于芽孢形成.馮鑫[10]等的結(jié)果表明，在酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.acidoterrestris)芽孢生產(chǎn)過程中，MgSO4質(zhì)量濃度低于0.34 g/L時(shí)，芽孢數(shù)和芽孢形成率皆隨MgSO4質(zhì)量濃度增加而增加，高于0.34 g/L時(shí)，芽孢數(shù)略有下降；加入0.24～0.48 g/L MnSO4能促進(jìn)芽孢生成，而質(zhì)量濃度高于0.48 g/L時(shí)，對(duì)芽孢生成有抑制作用，結(jié)果與本研究一致.

圖4 金屬離子對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

基于單因素實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)接種量、淀粉、酵母粉、Mg2+和Mn2+的用量進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，各因素對(duì)B8芽孢產(chǎn)量的影響大小為：酵母粉>接種量> Mn2+>淀粉> Mg2+，所得優(yōu)化組合為：A3B3C3D3E2，即接種量為1×107mL-1，淀粉質(zhì)量濃度為5 g/L，酵母質(zhì)量粉濃度為5 g/L，Mg2+質(zhì)量濃度為0.48 g/L，Mn2+質(zhì)量濃度為4.8 mg/L，在此優(yōu)化組合下，所得芽孢濃度為1.54×109mL-1，高于正交實(shí)驗(yàn)各個(gè)組合.方差分析結(jié)果表明，接種量對(duì)芽孢產(chǎn)量有顯著影響(P<0.05)，酵母粉質(zhì)量濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量有極顯著影響(P<0.01)，其他組分對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).因此，在芽孢生產(chǎn)過程中，要嚴(yán)格控制接種量和酵母粉的使用量.

2.2 芽孢萌發(fā)

2.2.1 萌發(fā)時(shí)間

如圖5所示，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，D(490)逐漸下降，芽孢萌發(fā)率逐漸增加，在4 h時(shí)萌發(fā)趨于穩(wěn)定，芽孢萌發(fā)率超過85%.通常芽孢萌發(fā)所需的時(shí)間較短，且不同菌種的芽孢之間存在差異.SHARMA等[12]研究發(fā)現(xiàn)，科氏芽孢桿菌(B.cohnii)芽孢在3 h時(shí)，萌發(fā)率可達(dá)98%，而嗜堿芽孢桿菌(B.pseudofirmus)芽孢在20 h時(shí)才開始萌發(fā)，經(jīng)過10 h才萌發(fā)完全.本實(shí)驗(yàn)所用的B8芽孢萌發(fā)比較迅速，3 ～ 4 h就能萌發(fā)完全.芽孢萌發(fā)時(shí)間與不同菌種芽孢內(nèi)膜所含的營養(yǎng)萌發(fā)受體量有關(guān)，萌發(fā)受體量多，芽孢萌發(fā)就快，萌發(fā)受體量少，芽孢萌發(fā)所需時(shí)間長，甚至能使芽孢進(jìn)入深休眠狀態(tài)[13].此外，芽孢萌發(fā)速率與所用萌發(fā)劑、無機(jī)鹽、環(huán)境pH值和熱處理等有關(guān).

圖5 芽孢萌發(fā)率和D(490)隨萌發(fā)時(shí)間的變化

2.2.2 萌發(fā)劑

芽孢萌發(fā)的萌發(fā)劑大多為氨基酸類，本研究對(duì)9種萌發(fā)劑進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)肌苷和L-丙氨酸能較好地促使芽孢萌發(fā)，其他幾種氨基酸促萌發(fā)效果較差(圖6).對(duì)肌苷質(zhì)量濃度作進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，在0～0.1 g/L隨著質(zhì)量濃度的增加，芽孢萌發(fā)率迅速升高；在0.1～2.0 g/L，芽孢萌發(fā)率增加變緩；肌苷濃度高于2.0 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率幾乎不再增加.可見，適宜的肌苷質(zhì)量濃度為2.0 g/L.不同菌種的芽孢所需萌發(fā)劑的種類和用量存在差異.如科氏芽孢桿菌DSM6307(B.cohniiDSM6307)芽孢的最適萌發(fā)劑為肌苷，最適濃度為15 mmol/L，濃度過高反而抑制芽孢萌發(fā)[14].GOUNINA-ALLOUANE等[15]發(fā)現(xiàn)，利用1～100 mmol/L的L-丙氨酸或0.01～10.00 mmol/L的肌苷能促使蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)迅速萌發(fā).除了糖類、氨基酸和嘌呤核苷等營養(yǎng)萌發(fā)因子，非營養(yǎng)萌發(fā)因子以及高壓、熱處理等物理因素也能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā).

圖6 不同萌發(fā)劑和肌苷濃度對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

2.2.3 pH值

環(huán)境條件是影響芽孢高效萌發(fā)的因素之一，如圖7，隨著pH值的增加，芽孢萌發(fā)率呈先增后降的趨勢.pH值為10時(shí)，芽孢萌發(fā)率最高，為86.25%；pH值為9和11時(shí)，萌發(fā)率分別為74.38%和65.63%，相對(duì)較高；pH值低于8或高于12時(shí)，芽孢萌發(fā)率急劇下降.因此，芽孢萌發(fā)適宜的pH值范圍為9～11.不同菌種的生長環(huán)境不同，導(dǎo)致其芽孢萌發(fā)所需的pH值也存在差異.VERCAMMEN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在800 MPa的高壓下、pH值為4的緩沖液能促使凝結(jié)芽孢桿菌LMG6326(B.coagulansLMG6326)芽孢萌發(fā).SETLOW等[17]研究表明，pH值為7.3～7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)芽孢開始萌發(fā).本實(shí)驗(yàn)所研究的菌株B8篩選于堿性環(huán)境，因此在堿性條件下更有利于該菌株芽孢的萌發(fā).

圖7 pH值對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

2.2.4 金屬離子

圖8顯示了不同金屬離子對(duì)芽孢萌發(fā)的影響.由圖8可見，不加肌苷的系列中，芽孢幾乎不萌發(fā)，可見芽孢萌發(fā)必須要有萌發(fā)劑的參與.但除肌苷外，一些金屬離子也會(huì)對(duì)萌發(fā)過程產(chǎn)生影響.在加入肌苷的系列中，Na+的存在使芽孢萌發(fā)率高達(dá)75.42%；加入K+、Mg2+和Mn2+芽孢萌發(fā)率分別為30%、34.67%和32%，與對(duì)照組的32.67%相近；而加入Ca2+芽孢萌發(fā)率僅為6%，芽孢幾乎不萌發(fā).可見Na+能促進(jìn)芽孢萌發(fā)，但Ca2+嚴(yán)重抑制芽孢萌發(fā)，而K+、Mg2+和Mn2+對(duì)芽孢萌發(fā)無明顯影響.進(jìn)一步考察肌苷存在時(shí)不同Na質(zhì)量濃度對(duì)芽孢萌發(fā)的促進(jìn)作用.如圖8，隨著Na+質(zhì)量濃度的增加，芽孢萌發(fā)率呈先增后減的趨勢.Na+質(zhì)量濃度在0～3 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率迅速升高；在3～24 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率緩慢下降；當(dāng)質(zhì)量濃度高于24 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率迅速下降.其中，Na+質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率最大，為89.17%；質(zhì)量濃度為0.6 g/L和24.0 g/L時(shí)，也具有較高的萌發(fā)率，分別為77.29%和73.75%.由此可見，B8芽孢對(duì)Na+質(zhì)量濃度的耐受范圍較寬，在0.6～24.0 g/L皆能保持較高的萌發(fā)率.

圖8 不同金屬離子對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

在混凝土內(nèi)部環(huán)境中，Ca2+的含量較高(如普通水泥中，CaO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)50%～55%)，這將對(duì)芽孢萌發(fā)造成嚴(yán)重抑制.芽孢如果不能萌發(fā)并生長為營養(yǎng)細(xì)胞，就無法誘導(dǎo)碳酸鈣的生成，從而大幅降低微生物自修復(fù)的效率，因此，必須采取措施解除Ca2+對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制作用.由圖8可知，Na+對(duì)芽孢萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，因此本研究利用Na+的促進(jìn)作用來抵消Ca2+的抑制作用.如圖9，在含有0.6 g/L的Ca2+體系中加入10.6 g/L的Na+，芽孢萌發(fā)率從對(duì)照組的6.00%左右上升到30.67%，而加入K+、Mg2+和Mn2+的芽孢萌發(fā)率分別為5.33%、4.00%和6.67%，與對(duì)照相近，對(duì)芽孢萌發(fā)無促進(jìn)作用.由此可見，Na+確實(shí)能在一定程度上解除Ca2+對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制.從文獻(xiàn)調(diào)研的情況來看，這是首次證實(shí)Na+具有消除Ca2+對(duì)芽孢萌發(fā)抑制的作用.

圖9 含Ca2+體系中，共存金屬離子對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

在確定Na+能有效解除抑制后，進(jìn)一步考察了不同質(zhì)量濃度Na+的抑制解除效果.如圖9，在含有0.6 g/L的Ca2+體系中，隨著Na+質(zhì)量濃度增加，芽孢萌發(fā)率呈先增后減的趨勢.當(dāng)Na+質(zhì)量濃度為24.0 g/L時(shí)，芽孢萌發(fā)率最高達(dá)到82.71%，基本恢復(fù)到無Ca2+抑制的水平，表明在此質(zhì)量濃度時(shí)，Ca2+對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制作用被完全解除.

芽孢萌發(fā)過程通常伴隨有H+和K+等一價(jià)陽離子從芽孢內(nèi)核釋放，這可能與芽孢內(nèi)膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān).SOUTHWORTH等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)芽孢中存在一種Na+和K+的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GerN，外界Na+內(nèi)流促使H+、K+釋放，促進(jìn)芽孢萌發(fā)，在其他種屬的細(xì)菌芽孢中也可能存在類似的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.SHARMA等[12]研究表明，嗜堿芽孢桿菌(B.pseudofirmus)芽孢萌發(fā)需要Na+存在，在萌發(fā)體系中加入0.10 mol/L NaCl，芽孢萌發(fā)率高達(dá)99%，加入0.05 mol/L NaCl，芽孢萌發(fā)率為82%，不添加NaCl，芽孢不萌發(fā).本實(shí)驗(yàn)中，Na+能促進(jìn)B8芽孢的萌發(fā)，也可能是芽孢內(nèi)膜上存在相關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過Na+內(nèi)流促使內(nèi)核中其他陽離子外排，伴隨著內(nèi)核吸水，促進(jìn)萌發(fā).

在芽孢形成過程中，內(nèi)核生成2,6-吡啶二羧酸(pyridine-2,6-dicarboxylic acid, PDA)，會(huì)吸收Ca2+，以1∶1結(jié)合生成螯合物Ca2+-PDA，而芽孢萌發(fā)伴隨著Ca2+-PDA的釋放，當(dāng)外界存在Ca2+時(shí)，會(huì)抑制Ca2+-PDA的釋放，進(jìn)而抑制萌發(fā)[13].本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)環(huán)境中存在Na+時(shí)，相關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道可能被開啟，使內(nèi)核中H+和K+等離子釋放的同時(shí)可能也導(dǎo)致了Ca2+-PDA釋放，引起內(nèi)核吸水，從而解除Ca2+的抑制作用，最終促使芽孢萌發(fā).

結(jié) 語

在B8芽孢生產(chǎn)過程中，接種量和酵母粉含量對(duì)芽孢產(chǎn)量有顯著影響，優(yōu)化后各組分為：接種量1×107mL-1、淀粉5 g/L、酵母粉5 g/L、Mg2+0.48 g/L和Mn2+4.8 mg/L，所得芽孢濃度為1.54×109mL-1，產(chǎn)量大幅度提高.堿性環(huán)境能保證B8芽孢高效萌發(fā)，肌苷能刺激芽孢快速萌發(fā)，Na+促進(jìn)芽孢萌發(fā)，Ca2+抑制萌發(fā)；高質(zhì)量濃度Na+能緩解Ca2+的抑制作用，促進(jìn)芽孢萌發(fā).