GC-MS/MS 法測(cè)定桂丁香中β-谷甾醇含量

支榮榮，周會(huì)芹，鄭 灝

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鹽城 224055

桂丁香為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥帶宿萼的未成熟果實(shí)，別名肉桂子、桂丁等，入藥始見于《百草鏡》，《綱目拾遺》引其曰：桂丁“形如吳茱萸，出廣西交趾，乃肉桂子也”，所述與今相符。主產(chǎn)廣西、廣東、福建。具有溫里散寒、止痛、止呃的功效[1]。桂丁香含揮發(fā)油，油中含桂皮醛（Cinnamaldehyde）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、香豆精（coumarin）、膽堿（choline）等[2]。

桂丁香為江蘇省地方中藥材，收載于《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》（2002 年版）。本次“標(biāo)準(zhǔn)”修訂提出了增加組織顯微鑒定、薄層色譜鑒別和HPLC 法測(cè)定桂皮醛含量的改進(jìn)草案。桂丁香中的β-谷甾醇具有抗炎、止咳、抗?jié)?、保護(hù)胃黏膜、抗癌、抗氧化和降低膽固醇及降血糖的藥理作用[3-5]。胡曙晨等[6]建立了β-谷甾醇的薄層色譜鑒別方法，目前還沒有報(bào)道桂丁香中β-谷甾醇的含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步提高質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)以β-谷甾醇含量為指標(biāo)，建立其含量測(cè)定方法。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent7890D 型氣相色譜儀，7000D 三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器；BP211D、BT224S 電子天平（德國(guó)Sartorius）。

1.2 藥品與試劑

桂丁香樣品8 批，購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)及鹽城市中藥飲片有限公司，經(jīng)原江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院狄恒建主任中藥師鑒定確認(rèn)。

β-谷甾醇對(duì)照品（純度98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；其余試劑為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：320 ℃，檢測(cè)器溫度：345 ℃，程序升溫（起始溫度160 ℃，以20 ℃·min-1升至290 ℃，保持15 min）；分流比：8∶1，進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件[7，8]EI 源；電子轟擊能量70 eV；離子源溫度300 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)譜接口溫度280℃；溶劑延遲時(shí)間6min；碰撞氣（氮?dú)猓┝魉?.5mL·min-1；猝滅氣（氦氣）流速2.25 mL·min-1；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），對(duì)β-谷甾醇進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描〔質(zhì)荷比（m/z）50～500〕，選擇響應(yīng)較強(qiáng)的質(zhì)荷比（m/z）為329.0 的碎片作為母離子，再對(duì)該母離子進(jìn)行子離子掃描〔質(zhì)荷比（m/z）50～329〕，確定定性離子對(duì)（m/z）329.0/95.2 和定量離子對(duì)329.0/189.2。

質(zhì)譜掃描圖見圖1～2，對(duì)照品溶液及供試品溶液質(zhì)譜圖見圖3～4。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取β-谷甾醇對(duì)照品9.94 mg，置50 mL 量瓶中，加二氯甲烷溶解、稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照品貯備液（0.198 8 mg·mL-1）。精密量取貯備液1 mL 置10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，混勻，作為對(duì)照品溶液（19.88 μg·mL-1）。

圖1 β-谷甾醇一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

圖2 母離子掃描質(zhì)譜圖

圖3 β-谷甾醇對(duì)照品質(zhì)譜圖

圖4 桂丁香供試品質(zhì)譜圖

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過3 號(hào)篩）2.5 g，精密稱定，加入二氯甲烷適量，回流至提取液近無色（約3 h），收集提取液，回收溶劑至干，固體物加二氯甲烷適量溶解，定容至10 mL 量瓶中，精密量取5 mL，加在中性氧化鋁柱上，用二氯甲烷50 mL洗脫，收集洗脫液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性范圍考察

分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 mL，置10 mL 量瓶中，加二氯甲烷至刻度，混勻。精密吸取上述溶液1 μL，注入氣相色譜儀，測(cè)得峰面積。以β-谷甾醇濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性回歸方程：Y=1.2842×104X-9.5718×104，（r=0.999 5）。

結(jié)果表明，β-谷甾醇在4.97～49.7 ng 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（19.88 μg·mL-1），按“2.1”儀器條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，平均峰面積（n=6）為25 743，RSD 為1.2%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試溶液，按“2.1”儀器條件測(cè)定，分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，平均峰面積（n=6）為22 806，RSD 為1.1%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”儀器條件測(cè)定，β-谷甾醇的平均含量（n=6）為0.077%，RSD 為1.6%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（含量0.077%，以干燥品計(jì)）1.25 g，共6 份，分別精密加入對(duì)照品貯備液（0.198 8 mg·mL-1）5 mL（含β-谷甾醇0.994 0 mg），按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”儀器條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 樣品測(cè)定

取8 個(gè)不同批次桂丁香樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”儀器條件測(cè)定，以干燥品計(jì)算，各批次含量分別為0.038%、0.050%、0.077%、0.078%、0.087%、0.062%、0.081%、0.071%。

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇

β-谷甾醇無紫外最大吸收，蒸發(fā)光散射法、火焰離子化氣相色譜法（FID）的靈敏度較低，因此，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）測(cè)定β-谷甾醇含量，以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集信號(hào)，具有專屬性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。

3.2 色譜條件的確定

在使用GC-MS/MS 測(cè)定β-谷甾醇之前，首先采用FID 檢測(cè)器對(duì)β-谷甾醇進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)β-谷甾醇的峰形及分離度有較大影響。嘗試采用270℃柱溫[7，8]時(shí)β-谷甾醇峰形較好，但是有一雜質(zhì)峰與待測(cè)成分分離度不能達(dá)到要求，當(dāng)溫度提高到290 ℃時(shí)，該雜質(zhì)與待測(cè)成分完全分離（安捷倫HP-5 毛細(xì)管柱可以耐受最高350 ℃）。

進(jìn)樣口溫度按照《中國(guó)藥典》要求高于柱溫30～50 ℃，因此選擇了320 ℃，檢測(cè)器溫度一般高于進(jìn)樣口溫度，選擇了345 ℃，程序升溫（起始溫度160 ℃，以20 ℃·min-1升至290 ℃，保持15 min），以此可先分離出雜質(zhì)碎片。分流比的選擇考察了2∶1、4∶1、8∶1、10∶1、20∶1；分流比過大，響應(yīng)值低，分流比過小，有拖尾現(xiàn)象，因此選擇8∶1。

3.3 供試品溶液的制備

因供試品雜質(zhì)較多，β-谷甾醇的響應(yīng)值較低，采用二氯甲烷索氏提取，提取液濃縮至10 mL 的方法，減少稀釋倍數(shù)，提高待測(cè)成分的濃度，用FID 檢測(cè)器，致β-谷甾醇響應(yīng)值有所提高，可達(dá)到定量限要求。供試品濃度太大，雜質(zhì)太多，對(duì)色譜柱與檢測(cè)器的耐受性有影響，因此選擇了靈敏度更高的GCMS/MS 進(jìn)行測(cè)定。對(duì)供試品作了進(jìn)一步稀釋，并增加了柱層析的步驟，有效減少了雜質(zhì)的影響。