microRNAs在調(diào)控結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路中的作用機(jī)制

袁濤，文坤明

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是發(fā)病率及致死率均較高的惡性腫瘤，2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率在男性、女性惡性腫瘤中分別位列第3位和第2位，死亡率在男性、女性惡性腫瘤中分別位列第4位和第3位［1］。盡管手術(shù)方式、放化療技術(shù)的改進(jìn)使結(jié)直腸癌患者的生存率有所提高，但目前結(jié)直腸癌的總體生存率仍不滿意。最新數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌的5年總生存率僅為65%，而Ⅳ期患者5年生存率僅12%［2-3］。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中存在的一小部分特殊的細(xì)胞亞群，既具有自我更新、多向分化和無(wú)限增殖的能力，又表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，它是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥的根本原因［4］。近來(lái)研究表明微小核糖核酸（microRNAs）在維持結(jié)直腸癌CSCs的自我更新、耐藥等干細(xì)胞特性方面發(fā)揮著重要作用［5］。microRNAs作為今后靶向藥物作用位點(diǎn)以及新型腫瘤標(biāo)志物的潛質(zhì)得到了大量研究者的關(guān)注。本文就microRNAs在調(diào)控結(jié)直腸癌CSCs信號(hào)通路中的作用機(jī)制綜述如下。

1 microRNAs的合成途徑及生物學(xué)作用機(jī)制

microRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不直接參與編碼蛋白質(zhì)，但卻可以通過(guò)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)實(shí)施調(diào)控［6］。microRNA的生物合成主要包括以下步驟［7-9］：首先在細(xì)胞核內(nèi)microRNA基因經(jīng)過(guò)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-microRNA即原始microRNA，之后由Drosha（一種核糖核酸酶Ⅲ）與DGCR8（一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白）一起構(gòu)成蛋白復(fù)合體對(duì)pri-microRNA進(jìn)行加工、剪切，形成含60～100個(gè)核苷酸且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-microRNA即前體microRNA，接著在Ras相關(guān)核蛋白GTP酶（Ran-GTP）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exporting-5共同作用下，由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，最后在細(xì)胞質(zhì)中Dice酶（一種核糖核酸酶Ⅲ）識(shí)別pre-microRNA的雙鏈部分并將其莖環(huán)基部的兩圈螺旋解開(kāi)，Dicer酶對(duì)兩條鏈進(jìn)行切割形成含有22個(gè)核苷酸的microRNA雙鏈體，其中一條與RISC結(jié)合形成成熟的microRNA，另一條互補(bǔ)鏈則被降解。microRNAs 5′端第2～7個(gè)核苷酸與目的基因3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）結(jié)合的部位稱為種子序列。microRNAs可以通過(guò)降解或抑制目的基因翻譯兩種途徑參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，但對(duì)目的基因具體所起的作用，還要取決于microRNAs 5′端與靶基因mRNA 3′-UTP堿基互補(bǔ)配對(duì)程度。當(dāng)microRNAs 5′端與靶基因mRNA 3′-UTP完全配對(duì)時(shí)，靶基因mRNA被Argonaute（AGO）蛋白的核酸內(nèi)切酶降解。但大多數(shù)情況下microRNAs 5′端與目的基因mRNA 3′-UTP不完全配對(duì)，而是主要通過(guò)抑制目的基因mRNA翻譯調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程［10］。

2 microRNAs在調(diào)控結(jié)直腸癌CSCs相關(guān)信號(hào)通路中的作用

越來(lái)越多的證據(jù)表明，microRNAs可以通過(guò)CSCs相關(guān)信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌CSCs起調(diào)控作用［11］。這些通路主要包括Wnt/β-catenin［12］、Notch［13］、JAK/STAT3［14］、Hedgehog（HH）［15］、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［16］等。

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究表明Wnt信號(hào)通路對(duì)腸道干細(xì)胞的存活和腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，而其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路在約90%的結(jié)直腸癌中發(fā)生突變，這些突變主要存在于大腸腺瘤性息肉病（APC）和β-catenin基因中［17-18］。Wnt/βcatenin信號(hào)通路不僅在細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)組織的動(dòng)態(tài)平衡和自我更新方面起關(guān)鍵作用，對(duì)于維持CSC的自我更新和治療抵抗也起重要作用［17］。Yu等［19］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，相較于結(jié)腸癌親本細(xì)胞（HCT-116和HT-29），miR-21在 結(jié) 腸 癌CSCs（HCT-116CSCs和HT-29CSCs）中表達(dá)明顯上調(diào)；同時(shí)在結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）中過(guò)表達(dá)miR-21增加了結(jié)腸CSCs的比例，結(jié)腸CSCs的自我更新能力提高了60%～80%。進(jìn)一步研究表明過(guò)表達(dá)miR-21可通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ（TGFBR2）抑制表達(dá)，而TGFBR2的下調(diào)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路、T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合因子的激活，并增加下游靶基因c-Myc和cyclin-D1的表達(dá)，從而在結(jié)腸CSCs調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Jiang等［20］研究發(fā)現(xiàn)miR-30-5p在結(jié)直腸癌組織和CD133+CRC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-30-5p則明顯降低了CD133+CRC細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物（CD133和Sox2）的表達(dá)和成球能力，進(jìn)一步研究表明miR-30-5p通過(guò)靶向調(diào)控Wnt/β-catenin靶基因（Axin2和myc）的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌CSCs的特性和耐藥性。但Axin2和myc與miR-30-5p作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。上述研究表明microRNAs可以通過(guò)靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而參與結(jié)直腸癌CSCs的調(diào)控，這部分microRNAs有望成為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

2.2 Notch信號(hào)通路Notch基因編碼一類(lèi)高度保守的細(xì)胞表面受體，調(diào)節(jié)多種生物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、增殖及細(xì)胞邊界的形成，同時(shí)能夠促進(jìn)不同類(lèi)型的癌癥進(jìn)展［21］。在正常干細(xì)胞中，Notch通路是不對(duì)稱分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與正常干細(xì)胞的情況類(lèi)似，干擾不對(duì)稱分裂可以改變CSCs自我更新和分化之間的平衡，并影響腫瘤生長(zhǎng)［22］。大量研究表明Notch信號(hào)在多種CSCs中過(guò)度激活，已證實(shí)Notch的激活突變與結(jié)直腸癌［13］、乳腺癌［23］、肺癌［24］CSCs表型的獲得及自我更新有關(guān)。Jin等［25］發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在32例結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，通過(guò)結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW620和HT29）在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)出SW620 CSCs和HT29 CSCs，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-195-5p后CSCs標(biāo)志物（CD133和Sox2）表達(dá)下調(diào)、成球能力減弱、裸鼠體內(nèi)成瘤能力下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-195-5p直接靶向調(diào)控Notch信號(hào)蛋白（Notch2和RBPJ）的3′UTR，抑制CSCs的干性和腫瘤生長(zhǎng)。Bu等［26］通過(guò)從新鮮結(jié)腸癌組織中培養(yǎng)出CSCs，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）證實(shí)結(jié)腸癌CSCs中miR-34a表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-34a充當(dāng)Notch信號(hào)通路的切換開(kāi)關(guān)，即miR-34a通過(guò)靶向Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌CSC自我更新和腫瘤形成。Bu等［27］發(fā)現(xiàn)miR-34a可通過(guò)與Notch1和Numb（一種抑癌基因）mRNA的3′UTR結(jié)合來(lái)抑制Notch1和Numb翻譯，Numb則通過(guò)促進(jìn)Notch1的內(nèi)吞和降解來(lái)抑制Notch1，即miR-34a、Numb和Notch1形成不連貫的前反饋回路，調(diào)節(jié)小腸和結(jié)腸癌中的不對(duì)稱干細(xì)胞分裂。以上研究表明microRNAs可以通過(guò)靶向Notch通路干擾結(jié)直腸癌CSCs的不對(duì)稱分裂，進(jìn)而調(diào)控結(jié)直腸癌CSCs的自我更新。

2.3 JAK/STAT3信號(hào)通路Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路最初是在干擾素（IFN）-α、IFN-γ和白細(xì)胞介素-6（IL-6）介導(dǎo)的下游信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)的［28］。已證實(shí)JAK/STAT3在包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤中過(guò)度激活［29］。在STAT蛋白家族的7個(gè)成員中，STAT3對(duì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤為重要，是腫瘤治療最有前途的新靶點(diǎn)之一。目前研究認(rèn)為STAT3信號(hào)通路在調(diào)控CSCs的自我更新中起重要作用［30］。有研究表明microRNAs可以通過(guò)直接靶向或通過(guò)STAT3上游或下游的靶基因激活STAT3信號(hào)通路［31］。Ren等［14］發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p在大腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)并且與大腸癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480和HT116）過(guò)表達(dá)miR-196b-5p后，上述結(jié)直腸癌細(xì)胞的成球能力增強(qiáng)、側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞）比例增加、干細(xì)胞因子（NANOG、BMI-1、OCT4和Sox2）的表達(dá)上調(diào)；沉默miR-196b-5p后上述指標(biāo)變化趨勢(shì)則相反；進(jìn)一步研究表明miR-196b-5p通過(guò)靶向調(diào)控STAT3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子SOCS1和SOCS3，激活STAT3信號(hào)通路，從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的干性和對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性。

2.4 HH信號(hào)通路自從在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)HH信號(hào)通路以來(lái)，HH信號(hào)通路受到了廣泛的關(guān)注［32］。目前研究已證實(shí)HH信號(hào)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)分化密切相關(guān)，不僅在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、干細(xì)胞調(diào)控、組織再生方面發(fā)揮重要作用，而且在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常激活并參與腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和CSC的維持［33］。microRNAs通過(guò)HH通路調(diào)控結(jié)直腸癌CSCs，可能與microRNAs參與調(diào)控與細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。Wang等［34］利用腫瘤基因圖譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-372/373在607例CRC患者癌組織中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-372/373可通過(guò)增加結(jié)直腸癌CSC標(biāo)志物陽(yáng)性細(xì)胞（CD24+CRC、CD26+CRC、CD44+CRC和CD133+CRC）的比率而增強(qiáng)結(jié)直腸癌CSCs的特性，表現(xiàn)為自我更新、化療耐藥性以及侵襲能力的增強(qiáng)。為了研究miR-372/373誘導(dǎo)干性的機(jī)制，Wang等［34］通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-372/373后，與CRC干性相關(guān)的HH通路表達(dá)上調(diào)；而與分化相關(guān)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK/Erk）通路和維生素D相關(guān)受體（VDR）通路等則被miR372/373明顯抑制，提示miR-372/373通過(guò)抑制分化基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)CRC的干性，該研究為結(jié)直腸癌靶向治療提供了新的思路，然而關(guān)于HH通路和分化相關(guān)的信號(hào)通路仍然知之甚少，需要更深入的研究。

2.5 EMT EMT過(guò)程不僅參與腫瘤轉(zhuǎn)移，而且與CSCs特性的獲得與保持也密切相關(guān)，經(jīng)歷EMT的腫瘤細(xì)胞可以獲得CSCs特性。大量研究發(fā)現(xiàn)在多種上皮腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)EMT啟動(dòng)子（Twist1或Snail）激活EMT后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了多種CSC特性，包括CSC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的升高、懸浮培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞成球能力的增加、小鼠體內(nèi)致瘤能力的增加［35-36］。有研究認(rèn)為，EMT激活后癌細(xì)胞分泌蛋白譜發(fā)生改變，導(dǎo)致其建立了自分泌信號(hào)通路，這有助于腫瘤細(xì)胞干性的出現(xiàn)［37］。Zhu等［16］通過(guò)建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Snail（EMT轉(zhuǎn)錄因子）的結(jié)直腸癌細(xì)胞系（DLD1-Snail和HCT116-Snail），發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞特性增強(qiáng)，同時(shí)產(chǎn)生了放療抵抗，通過(guò)miR-145啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Snail可以結(jié)合miR-145啟動(dòng)子的核心序列并抑制miR-145表達(dá)，反之，過(guò)表達(dá)miR-145則逆轉(zhuǎn)了Snail介導(dǎo)的干細(xì)胞特性并恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。Ning等［38］研究證實(shí)miR-147在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步在CRC細(xì)胞系（HCT116和SW480）中過(guò)表達(dá)miR-147后發(fā)現(xiàn)EMT過(guò)程被抑制，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E鈣蛋白表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志物纖維連接蛋白和波形蛋白表達(dá)降低，同時(shí)CSC標(biāo)志物（OCT4、Sox2和NANOG）的表達(dá)下調(diào)，經(jīng)EMT誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）激活EMT后，上述指標(biāo)變化趨勢(shì)相反，表明過(guò)表達(dá)miR-147通過(guò)抑制EMT過(guò)程進(jìn)而抑制CRC的CSCs特性。以上研究結(jié)果表明microRNAs可以通過(guò)靶向調(diào)控EMT過(guò)程在調(diào)控結(jié)直腸CSCs中發(fā)揮作用。盡管CSCs與EMT的相關(guān)性在大量研究中得到證實(shí)，但具體的分子機(jī)制仍不清楚，仍需要更深層次的研究。

3 小結(jié)與展望

盡管大量研究表明microRNAs通過(guò)靶向不同的信號(hào)通路及EMT調(diào)控結(jié)腸CSCs的干性。但關(guān)于microRNAs的具體功能和調(diào)控結(jié)直腸癌CSCs詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。目前以microRNAs為靶點(diǎn)治療結(jié)直腸癌研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象多基于離體細(xì)胞，尚缺乏足夠的臨床研究數(shù)據(jù)。因此，仍需大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證體外試驗(yàn)的結(jié)果。已知的與結(jié)直腸癌CSCs相關(guān)的microRNAs較多，如何篩選及驗(yàn)證與結(jié)直腸癌CSCs確切相關(guān)的microRNAs，以及是否能結(jié)合其他預(yù)測(cè)指標(biāo)，建立預(yù)測(cè)模型和microRNAs在結(jié)直腸癌CSCs的表達(dá)譜，用于指導(dǎo)臨床上個(gè)體化治療，都是亟待解決的問(wèn)題，故需要更加優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)一步研究。開(kāi)發(fā)專(zhuān)門(mén)針對(duì)結(jié)直腸癌CSCs的治療方法仍任重而道遠(yuǎn)。