礦山土壤鎘污染微生物修復技術研究進展

石浩， 胡靜敏， 陳忻， 彭安安

佛山科學技術學院 環(huán)境與化學工程學院，廣東 佛山 528000

前言

金屬礦山開采所引起的環(huán)境問題具有潛伏性、積累性和長期性。在滿足資源需求的同時產(chǎn)生大量的尾礦，尾礦的風化、氧化及采礦廢棄物處置給礦區(qū)及周邊地區(qū)造成嚴重的重金屬污染風險。其中，重金屬鎘(Cd)污染的問題近年來備受關注。根據(jù)2014年公布的全國土壤污染狀況調(diào)查結(jié)果，我國土壤重金屬污染總的超標率為16.1%，其中鎘的點位超標率位居榜首，達到7.0%[1]。對全國22個省72個礦區(qū)的統(tǒng)計結(jié)果表明[2]，我國土壤Cd的地累積指數(shù)(Igeo)偏高，平均濃度遠超我國土壤污染風險管控標準(GB 15618—2018)。鎘元素在地殼中含量極少，無單獨的礦床，通常與Zn、Pb、Cu、Mn硫化物伴生。土壤中的重金屬鎘一方面是來源于巖石風化和火山活動等自然因素；另一方面則是由工業(yè)活動、污水灌溉、牲畜糞便、磷肥施用等人為因素導致[3]。因此金屬硫化礦特別是鉛鋅礦區(qū)附近的農(nóng)田土壤重金屬鎘污染尤其嚴重[4,5]。硫化尾礦中的鎘在氧化條件下釋放，隨地表水遷移或滲入地下水，污染整個礦區(qū)甚至更大區(qū)域，最終可通過食物鏈的富集作用，影響動植物和人類健康[6-8]。國內(nèi)外針對土壤鎘污染修復進行了諸多嘗試，如物理客土法、玻璃化法、電動修復法、化學淋洗、改良劑固定等，這些方法存在著修復成本高、易產(chǎn)生二次污染、易導致土壤退化等缺點，不適合大范圍使用[9-11]；生物法如植物法吸收重金屬有一定的效果，但也存在超積累植物品種的適應性、修復周期和效率問題的瓶頸[10]。數(shù)量龐大、種類繁多的微生物是生物地球化學循環(huán)的參與者，在土壤重金屬的形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色。采用微生物修復法操作簡單、經(jīng)濟且環(huán)境友好，本文就近年來國內(nèi)外有關土壤Cd污染的微生物修復方面的研究和實踐進行綜述。

1 鎘污染土壤的微生物修復

土壤中的微生物無法直接分解重金屬Cd，但微生物代謝產(chǎn)物及其代謝活動產(chǎn)生的能量可作用于Cd的氧化還原或沉淀過程，通過吸附、固定的方式穩(wěn)定土壤中的重金屬Cd，降低其遷移性和生物有效性；或改變鎘的化學形態(tài)，影響其在土壤可溶相和不溶相之間的平衡，進而通過淋溶或植物吸收的方式去除。

1.1 吸附與固定

Cd的微生物固定化可以通過微生物作用下不溶性有機或無機化合物對Cd的沉淀或結(jié)晶，或微生物對Cd的吸附、吸收和細胞內(nèi)隔離等來實現(xiàn)[12-13]。按照作用位置，又可分為胞外作用和胞內(nèi)作用。

1.1.1 胞外作用

Cd2+的胞外作用是細胞表面的活性基團或胞外聚合物與Cd離子間發(fā)生的物理化學反應，包括靜電吸附、離子交換和絡合反應等[14]。外界環(huán)境中的Cd最先接觸到微生物的胞外聚合物(EPS)。胞外聚合物是由多糖、蛋白質(zhì)和少量的脂類、核酸等構(gòu)成的有機高分子聚合物，胞外聚合物表面具有大量疏水區(qū)，且含有豐富的羧基、羰基、羥基、磷?；?、硫酸根、磷酸根等負電性官能團[15]，能夠與Cd結(jié)合形成生物固定。付林波[16]對比提取EPS前、后的黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBKMF 1767(CCTCC AF96007))吸附重金屬Cd的情況，發(fā)現(xiàn)未提取胞外聚合物的菌體吸附量明顯優(yōu)于提取后的菌體。魏德州等[17]采用透射電鏡、紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細胞與Cd離子的吸附過程主要與細胞多糖中的羥基、羧基及蛋白質(zhì)中的氨基有關。Zhang等[18]采用透射電鏡和X-射線能譜分析發(fā)現(xiàn)Cd在Burkholderiafungorum細胞表面的沉積，結(jié)合紅外光譜分析和X射線粉末衍射揭示了胞外多糖對Cd的吸附效果。張海鷗等[19]發(fā)現(xiàn)深海菌株SCSE425-7的可溶性胞外多糖能提高細菌的抗Cd水平，菌株SCSE709-6產(chǎn)生的不可溶性的胞外聚合物能夠有效螯合Cd離子。鐵載體是微生物產(chǎn)生的低分子有機化合物，可在濃縮Fe轉(zhuǎn)運進入細胞的同時通過絡合作用影響Cd的生物可利用性。晉銀佳等[20]證實熒光假單胞菌代謝產(chǎn)生的鐵載體能夠絡合固定Cd2+，減少油麥菜對鎘的吸收。

微生物細胞壁和細胞膜上存在的羥基(-OH)、羧基(-COOH)以及巰基(-SH)等活性基團可通過絡合、配位結(jié)合以及離子交換等化合反應吸收Cd2+[21, 22]。Zhang等發(fā)現(xiàn)細胞壁上氨基基團會與Cd2+發(fā)生絡合[18]。余雪梅等[23]用FTIR分析耐鎘芽孢桿菌Bacillussp. PFYN01吸附Cd2+后的菌株表面，發(fā)現(xiàn)與Cd2+結(jié)合的官能團有酰胺基(N-H)、羧基(COOH)、羥基(O-H)、烴基(C-H)、羰基(C=O)等，說明細菌胞外的多聚糖、蛋白質(zhì)和脂肪酸等參與了吸附過程。林雁冰[24]通過能譜分析發(fā)現(xiàn)放線菌細胞表面形成的沉積物中存在大量的Cd，紅外光譜分析表明主要與-OH、-NH2、-COOH、-CO-NH-、-CN等功能基團有關。Huang[25]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌RC-1細菌的活細胞和死細胞對Cd2+都具有生物吸附能力，分別達24.01 mg/g和31.95 mg/g。

1.1.2 胞內(nèi)作用

細胞內(nèi)部作用主要是指微生物細胞對金屬鎘的累積。微生物利用細胞代謝活動提供的能量通過親脂滲透、離子通道、細胞內(nèi)吞、離子泵、絡合后滲透、載體運輸?shù)葯C制將胞外Cd運輸?shù)桨麅?nèi)，然后經(jīng)生物沉淀過程固定、儲存在脂質(zhì)囊泡，或與細胞內(nèi)金屬硫蛋白等發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)化[26]。Rani等[27]發(fā)現(xiàn)菌株Pseudomonasputida62BN能顯著降低植物與土壤中Cd的含量，且P.putida62BN細胞內(nèi)積累了大量的Cd。黃飛[28]發(fā)現(xiàn)在Cd2+濃度>20 mg/L時，蠟狀芽孢桿菌(BacilluscereusRC-1)胞外Cd2+吸附量遠大于胞內(nèi)積累量，吸附過程以胞外吸附為主；而在Cd2+濃度<20 mg/L下時，胞內(nèi)積累量大于胞外吸附量，吸附過程以胞內(nèi)積累為主。金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一種半胱氨酸含量高、熱穩(wěn)定好的蛋白質(zhì)，含有大量極易與重金屬Cd離子結(jié)合的巰基[29]，與微生物對重金屬的累積、及其重金屬環(huán)境耐受能力等相關。Suleman等[30]發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白基因重組大腸桿菌E.coliBL21 DE3對Cd2+的吸附量與比對照提高19倍。湯曉燕[31]將金屬硫蛋白表達在酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞表面后，重組菌對Cd2+的吸附去除率提高了19.39%。張弛等[32]將融合表達金屬硫蛋白基因的工程菌用于污水重金屬處理，發(fā)現(xiàn)MT工程菌對Cd2+有較好的親和性。Kuroda等[33]將酵母源金屬硫蛋白展示在S.cerevisiae的細胞表面，其Cd2+的吸附能力提高到27.1 nmol/mg細胞干重，為對照的12倍。

1.2 溶解與活化

微生物的代謝活動產(chǎn)生大量的低分子有機酸，如甲酸、乙酸、檸檬酸、乙二酸、草酸等，這些有機酸改變土壤pH值，釋放出可絡合溶解的鎘離子和含鎘礦物中的鎘元素，促進鎘進入土壤液相，增加其遷移性，該方式有利于減少重金屬對局部土壤的危害。早在20世紀80年代，真菌分泌的氨基酸、有機酸和其他代謝產(chǎn)物可以溶解重金屬及含重金屬的礦物就有文獻報道[34]。Chanmugathas等[35]發(fā)現(xiàn)土壤微生物能夠在土壤濾瀝過程中通過分泌有機酸絡合并溶解土壤中的重金屬Cd。王京文等[36]研究發(fā)現(xiàn)接種耐鎘菌株Arthrobactersp. m6后，礦區(qū)土壤中水溶態(tài)Cd增加2倍，可交換態(tài)增加16%，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)和有機物結(jié)合態(tài)的Cd不同程度的下降，菌株使土壤難溶態(tài)Cd向生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化。Xu等[37]采用Cd污染土壤中分離到的異養(yǎng)菌和礦井酸性廢水中分離到的自養(yǎng)菌混合浸出處理Cd重度污染稻田土壤，得到了較好的Cd去除率(32.09%)，且發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)和異養(yǎng)菌株的協(xié)同代謝活性可能是除pH和ORP(氧化還原電位)外的Cd去除決定因素。Hao等[38]采用混合營養(yǎng)嗜酸菌的兩步生物淋溶去除了污染稻田土壤總Cd的34%和有效Cd的87%，且盆栽實驗接種混合菌的空心菜組織Cd濃度提高了78%。土壤中重金屬常以硫化物或磷酸鹽的形式存在，微生物分泌有機酸促進重金屬硫化物或磷酸鹽溶解獲取硫和磷等營養(yǎng)元素的同時，也提高了生物有效態(tài)重金屬的含量。楊卓等[39]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)混合微生物制劑產(chǎn)生的有機酸能促進土壤有效態(tài)磷、鉀的釋放，使土壤中Cd的有效態(tài)含量提高15.02%，同時促進印度芥菜(Brassicajuncea)的生長及其地上部分Cd的含量增加17.93%。Wei等[40]發(fā)現(xiàn)富集的鐵氧化微生物[主要為Alicyclobacillusferripilum(46.4%)和Alicyclobacillusaeris(35.6%)]浸出處理12 d可去除豬糞中90.5%的Cd，使生物有效磷含量上升25.9%，能較好地保留肥料性能且環(huán)境友好。

微生物具有較強的分解代謝能力和較高的代謝速率，修復重金屬污染成本低，環(huán)境污染小，相關理論研究和實踐探索已取得一定進展。但由于土壤微生物代謝活動對土壤環(huán)境條件變化的敏感，外源功能微生物對環(huán)境的適應、生長代謝調(diào)控、與土著微生物的相互作用等機制較為復雜，單純的微生物技術在實地修復應用時往往與實驗室結(jié)果出現(xiàn)較大差別。而微生物方法與其他修復方法的綜合運用可克服單項修復技術的局限，提高污染土壤的修復速率與效率，成為近年來許多研究者新的選擇。

2 微生物-植物協(xié)同修復

微生物-植物協(xié)同修復是利用植物及其相關微生物的相互作用規(guī)律來實現(xiàn)土壤鎘污染的原位修復。微生物主要通過促進植物對Cd吸收，進而移除植物的可收割部分實現(xiàn)土壤重金屬濃度的降低；或通過穩(wěn)定土壤中的鎘，以及抑制植物對鎘的吸收而降低農(nóng)作物中Cd的含量兩種方式來實現(xiàn)，是一種較為“經(jīng)濟的、非侵入性”的方法[41]。

2.1 微生物促進植物生長和鎘的累積

植物與其生長環(huán)境中的微生物關系密切。許多微生物進化出耐受高Cd2+濃度的能力，即使在高濃度的Cd環(huán)境下，抗Cd的植物促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)仍具有分泌吲哚乙酸、鐵載體和ACC脫氨酶的能力，后者能促進植物生長獲得更大的生物量和更好的Cd吸收效果，如黃文[42]從某礦區(qū)重金屬污染土壤中分離篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的假單孢菌屬細菌Pseudomonassp. LKS06，在促進龍葵的生長同時顯著提高植物對鎘的富集能力，使其根和地上部鎘的總累積量最高分別比對照增加36.7%和42.4%。嗜酸性微生物的活動往往改變土壤的酸堿環(huán)境，有利于重金屬Cd的溶解和遷移，如劉衛(wèi)敏[43]添加氧化亞鐵硫桿菌菌液到礦區(qū)土壤盆栽的黑麥草，顯著増加了根際土壤的酸溶態(tài)Cd含量，且黑麥草地上和地下部分Cd含量最大增量分別達347.45%和743.94%。與植物共生的微生物如菌根真菌等在幫助植物在促進宿主營養(yǎng)吸收的同時，有可能將積累的Cd轉(zhuǎn)移到高等植物中，如高玉倩[44]接種濃度2.5%的叢枝菌根真菌摩西球囊霉菌根(Glomusmosseae)促進了鴨跖草對尾礦中Cd的吸收。

2.2 微生物抑制植物對Cd的吸收

重金屬鎘對人類健康的最大威脅來自食物鏈的累積，因此，降低農(nóng)作物可食用部分鎘的積累是解決鎘污染土壤持續(xù)安全生產(chǎn)的有效途徑之一。叢枝菌根真菌可將鎘轉(zhuǎn)化為毒性較小的不活躍形式來增強水稻抗Cd的能力，通過菌絲將鎘滯留在根部抑制其轉(zhuǎn)移，同時還能改善植株的磷營養(yǎng)狀況，增加根系磷的吸收[45]。羅方舟等[46]發(fā)現(xiàn)接種叢枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)能同時降低旱稻對Cd的富集和轉(zhuǎn)運能力，從而顯著降低其各部分Cd含量，特別是籽粒中的Cd含量被降低了26.8%～57.1%。Li等[47]發(fā)現(xiàn)水稻(OryzasativaL.)與兩種叢枝菌根真菌Rhizophagusintraradices(RI)和Funneliformismosseae(FM)共生能夠降低植株地上部和根系的Cd濃度，縮小在植株嫩枝和根部中無機態(tài)和水溶性態(tài)Cd的濃度和比例。胡振琪[48]研究發(fā)現(xiàn)，接種叢枝菌根真菌Glomusdiaphanum使玉米的生物量增加了5.79倍，地上部分鎘含量降低了53.9%，地上部分磷含量增加了4.6倍。

微生物-植物共修復可以彌補微生物修復技術與植物修復技術兩者在土壤污染物修復中的不足,提高生物修復效率，但實際應用中構(gòu)建合適的微生物和植物的修復模式是其重點和難點[49]，離大規(guī)模推廣尚有一定距離。

3 微生物-土壤調(diào)理劑聯(lián)合修復

添加土壤調(diào)理劑的原位穩(wěn)定化技術是目前修復重金屬污染土壤中較普遍且廉價高效的技術之一。土壤調(diào)理劑可通過沉淀、吸附、絡合或氧化還原作用調(diào)控土壤的理化性質(zhì)，從而改變土壤中重金屬的賦存形態(tài)，降低其生物有效性、水溶性及擴散性等性質(zhì)，減少重金屬對土壤環(huán)境的危害和影響；同時，土壤微生態(tài)環(huán)境和土壤微生物群落多樣性也得到改善和提高[50]。土壤微生物是表征土壤功能的敏感指標，微生物數(shù)量的增加和多樣性的改善對土壤解毒和植物生長有促進作用，因此，微生物菌劑配合土壤調(diào)理劑使用，是土壤重金屬污染修復特別是農(nóng)業(yè)用地修復的有效的戰(zhàn)略之一[51]。

常用的土壤調(diào)理劑有黏土礦物、磷酸鹽化合物、石灰、金屬氧化物、有機廢物和生物炭等。功能微生物聯(lián)合生物炭(Biochar，BC)使用，近年來在重金屬污染土壤修復應用領域備受關注[52-54]。生物炭是厭氧或限氧條件下生物質(zhì)熱轉(zhuǎn)化的富碳材料，一般為堿性，且具有多孔結(jié)構(gòu)、比表面積大、表面活性位點多等特點，能夠調(diào)節(jié)土壤pH值，有很強的重金屬吸附親和力[55]。研究表明，作為土壤調(diào)理劑，生物炭可通過表面豐富的羥基、羧基和酚基以及芳族結(jié)構(gòu)上的π電子富集域等有機官能團來捕集可溶性Cd，從而降低其遷移率和生物利用度[55-57]。生物炭的多孔性和表面特性可為土壤微生物生長與繁殖提供良好的棲息環(huán)境與養(yǎng)分，增加微生物豐度，因此，生物炭的加入可改變土壤性質(zhì)、土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)[58]，對重金屬污染土壤的原位生物修復有積極意義。Tu等[59]以玉米秸稈生物炭負載耐重金屬假單胞菌Pseudomonassp. NT-2作用于污染礦山土壤，75 d盆栽試驗結(jié)果表明，5%生物炭菌劑的施用可使土壤pH維持在7.2～7.5之間，與單一生物炭調(diào)理劑相比可顯著提高Cd殘渣態(tài)的比例、降低可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的比例。Wu等[60]把植物促生菌Serratiamarcescensstrain SNB6成功地固定在生物炭上組合成復合生化材料(BCM)，并結(jié)合超累積植物香根草(ChrysopogonzizanioidesL.)構(gòu)建了生物炭-促生菌-超累積植物的土壤重金屬鎘污染修復體系，該體系顯著可提高土壤可提取態(tài)Cd的比例、香根草的生物量和鎘含量，同時生物炭與菌株表面的官能基團也有助于Cd的固定化，為重金屬Cd的現(xiàn)場治理提供了一條新的途徑。但由于目前關于生物炭異質(zhì)性、環(huán)境穩(wěn)定性以及對其他環(huán)境因子的影響機制的研究還有待完善[61,62]，微生物與生物炭在土壤修復過程中的作用機制及效果等還有待進一步研究。

4 展望

土壤鎘污染是一個全球性問題。由于鎘在地殼中含量極少，通過微生物活動改變土壤結(jié)構(gòu)、pH值、氧化還原態(tài)、土壤酶等物理生化性質(zhì)影響重金屬Cd的溶解性和生物有效性，實現(xiàn)土壤原位修復的是相對經(jīng)濟、環(huán)境友好的選擇。綜觀國內(nèi)外有關研究，篩選具有一定Cd耐受能力的功能微生物，對其在Cd的吸附、固定或者促進溶解改變Cd的生物有效性方面的功能、以及在一定環(huán)境下與其他微生物互作來實現(xiàn)土壤重金屬Cd修復的過程進行研究，仍是當前該項技術的關鍵。由于礦山土壤環(huán)境的特殊性，礦山及周邊重金屬污染往往是伴生的多種重金屬的復合污染，有些區(qū)域還受到選礦藥劑的影響，如鉛鋅礦周邊Cu、Cd、Pb、Zn、As等重金屬污染可能同時存在且相互影響，Cd、As在土壤中具有相反的地球化學行為[63]等，單一微生物菌劑的使用或單純的微生物修復方法難以在實際應用中達到理想效果，多種方法的聯(lián)合使用來提高修復效率，如利用根際和共生微生物與超累積植物的互作或采用土壤調(diào)理劑(如生物炭等)與功能微生物配合使用等，具有較大發(fā)展空間。此外，隨著基因工程和納米技術的發(fā)展，在風險可控的前提下采用轉(zhuǎn)基因方法將重金屬Cd抗性基因引入微生物細胞及其相關植物細胞，表達天然螯合劑、功能蛋白質(zhì)或與Cd的形態(tài)轉(zhuǎn)化相關的酶等來增強功能微生物的修復能力，也將是重要發(fā)展方向。