吲哚菁綠在口腔癌可視化治療中的應用

張譽， 季彤

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院口腔頭頸腫瘤科，上海（200011）

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3%［1］。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（The National Comprehensive Cancer Network，NCCN）在針對口腔癌的治療指南中，將手術為主、放化療為輔的綜合治療作為口腔癌的主要治療模式。口腔頜面部淋巴網(wǎng)絡豐富，機械運動頻繁，以舌癌為代表的口腔癌常見早期淋巴轉移，頸淋巴清掃是手術治療的重要組成部分?？谇话┑男g后缺損對患者日常生活、心理健康產(chǎn)生較大負面影響，血管化游離皮瓣移植被廣泛運用于術區(qū)缺損的修復。口腔癌的手術治療中，如腫瘤邊界的確定、選擇性頸淋巴清掃的適應證、游離皮瓣的術后危象預測等問題存在較大爭議。熒光成像技術在解決這些問題上顯示出良好的前景。吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）以其低創(chuàng)傷、高時效、低細胞毒性、高顯像分辨率等特點，已在肝臟外科［2］、乳腺外科［3］、神經(jīng)外科［4］中得到廣泛應用，而ICG在口腔癌治療中的應用卻較少提及。本文就ICG及其在口腔癌診治中的應用予以綜述。

1 ICG成像原理

ICG是一種水溶性陰離子，分子量為776 Da，半衰期在150～180 s，可被肝臟代謝清除，發(fā)生過敏反應的比例很低（1︰10 000）［5］，ICG通常被認為是一種被動聚集熒光顯影劑，但以ICG偶聯(lián)腫瘤靶向抗體的主動聚集熒光顯影劑的研究成為目前研究的一大熱點。

腫瘤的熒光標記根據(jù)原理可分為主動聚集與被動聚集兩類。主動聚集是采用熒光物質偶聯(lián)腫瘤抗原靶向藥物，從而使熒光物質主動、特異性地聚集于腫瘤組織進而對其進行精準定位，最常見的方式即腫瘤特異性抗體偶聯(lián)熒光物質。有研究通過偶聯(lián)抗人表皮樣生長因子抗體西妥昔單抗與熒光物質IRDye800對12例口腔癌患者進行術中實時腫瘤定位，發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物對術中腫瘤的定位、腫瘤標本的體外取材都有指導意義，并且熒光強度的高低與顯微鏡下腫瘤細胞的惡性程度存在關聯(lián)［6］。

Day等［7］比較了帕尼單抗偶聯(lián)IRDye800CW與西妥昔單抗偶聯(lián)IRDye800CW對口腔癌腫瘤組織定位的差異，發(fā)現(xiàn)兩者相對于對照組（igG?IRDye800CW）均有較強的背景對比度。這些分子合成物均顯示了良好的應用前景，但是主動聚集的熒光物質存在細胞毒性、過低的清除率及背景干擾信號等缺點，其進一步的臨床應用仍需研究。被動聚集的原理是熒光物質高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）在腫瘤細胞中積聚。所謂的EPR效應是指由于腫瘤微環(huán)境中的血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子類物質和脂質顆粒具有選擇性高通透性和滯留性［8］。以ICG為代表的熒光物質與血紅蛋白結合后通過EPR效應在腫瘤微環(huán)境內聚集，在波長為650～900 nm的近紅外光激發(fā)下，產(chǎn)生熒光，由于水和脂質吸收波長大于900 nm的可見光，從而產(chǎn)生較低的背景干擾信號［5，9］。

2 ICG在腫瘤可視化中的應用

腫瘤的完整切除是影響預后的重要因素。Scholl等［10］通過對268例舌鱗狀細胞癌的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，與腫瘤首次切除后的陰性切緣相比，腫瘤首次切除后取得陽性切緣+擴大切除獲得二次陰性切緣具有更差的預后。Liao等［11］認為距離口腔癌浸潤邊緣7 mm切除腫瘤，可同時兼顧腫瘤的局部根治與正常組織的保存。腫瘤的完整切除是外科醫(yī)生在治療過程中首要考慮的問題。大部分口腔癌的手術過程中，外科醫(yī)生多通過視診、觸診及經(jīng)驗來確定腫瘤的切除范圍，這顯然是不夠客觀的。ICG通過EPR效應在腫瘤組織中富集，在近紅外光的激發(fā)下顯示出腫瘤組織邊界，為腫瘤的完整切除提供一種較為客觀的參考。

ICG指導腫瘤的切除已經(jīng)在多種腫瘤中得到應用。Acerbi等［4］啟動了一項Ⅱ期臨床試驗以評估熒光素引導膠質瘤切除手術的安全性和有效性，通過對比分析熒光區(qū)和非熒光區(qū)標本，發(fā)現(xiàn)熒光素鈉對分辨高級別膠質瘤的敏感度為91%，特異性達100%。Yang等［2］通過術中靜脈注射ICG，以此引導手術切除經(jīng)病理診斷為肝癌的10名患者，結果均取得了陰性的切緣，其中4名患者的部分病灶經(jīng)ICG熒光顯影切取并經(jīng)病理診斷為高分化的肝細胞癌，在術前超聲等各項檢查中均未被檢出。在小鼠的骨肉瘤模型上單獨使用ICG引導腫瘤的切除，最終ICG引導下腫瘤切除組的11只小鼠在1個月的觀察期內無局部復發(fā)，而對照組的11只小鼠有9只出現(xiàn)局部復發(fā)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義［12］。

口腔癌的研究中，研究者主要將ICG偶聯(lián)腫瘤特異性抗體作為示蹤手段，并取得了較好的成效。有研究利用抗平足蛋白抗體偶聯(lián)ICG在荷載口腔鱗狀細胞癌的裸鼠上成功顯示腫瘤邊界，但對于部分早期癌變組織及20%～30%未能表達平足蛋白的口腔鱗癌則效果不佳［13］。單純使用ICG顯示腫瘤的邊界以指引口腔癌手術切除的研究目前并無相關報道。

臨床診斷為N0的早期口腔癌，依舊有20%左右的淋巴結隱匿性轉移可能，對于這類病人是否進行選擇性的頸淋巴清掃一直存在爭議。前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）指口腔癌淋巴轉移的首個區(qū)域淋巴結，對于判斷口腔癌是否存在頸淋巴轉移有指導意義。以99 mTc為示蹤劑的放射性核素顯影是許多歐洲國家進行SLN檢測的常用方法，以ICG判斷SLN是否存在轉移已在包括口腔癌的多種腫瘤臨床試驗中取得成效。

KleinJan 等［14］進行了一項皮膚癌、口腔癌、胰腺癌、列腺癌及外陰癌共計495例的前瞻性研究，通過術中注射ICG?99 mTc?硫化錸注射液的偶聯(lián)物與亞甲藍染料進行比較。在1 327個術后病理證實為淋巴結轉移陽性的淋巴結中，基于99 mTc單獨使用手持gamma探針追蹤的檢出率>98%，基于ICG單獨使用熒光追蹤的的檢出率>95%，而基于亞甲藍染料的肉眼追蹤檢出率為22%～78%［14］。在經(jīng)病理診斷為口腔鱗狀細胞癌的組織周圍注射ICG?99 mTc?硫化錸注射液，在43枚經(jīng)手持gamma探針與熒光追蹤檢測并最終經(jīng)病理診斷為轉移的SLN中，有4枚臨近注射區(qū)的SLN僅通過ICG的熒光顯影被發(fā)現(xiàn)，一枚臨近面神經(jīng)下頜緣支的SLN僅能被gamma探針所檢測到；經(jīng)分析，臨近注射區(qū)的部位，放射性核素因為較高的背景信號而顯影不佳，ICG的熒光則未受影響；在距離術野較深的層面（>0.5 cm），由于ICG產(chǎn)生熒光的穿透力較弱，99 mTc則發(fā)揮出更主要的作用［15］。隨后Chris?tensen等［16］的研究也證實了這一猜測。

3 ICG在修復重建中的應用

口腔癌手術往往導致患者顏面部外觀與功能缺陷。目前，血管化游離皮瓣移植的應用，在保證了腫瘤最大限度根治的同時，使患者獲得了外形與功能的恢復［17］。然而術后游離皮瓣的壞死仍給臨床醫(yī)生及患者帶了許多困擾。通過ICG指導乳房切除后的游離皮瓣乳房再造術已經(jīng)被廣泛應用［18?19］。而在口腔癌的修復重建中，ICG在術前及術中的游離皮瓣設計和術后早期皮瓣危象的檢測上都顯示出了良好的前景。Beckler等［20］回顧了73例因口腔癌手術切除而產(chǎn)生的黏膜皮膚貫通缺損并且接受腓骨肌皮瓣進行修復的患者，48例通過術中皮瓣顏色、毛細血管充盈實驗及皮瓣邊緣真皮層的出血情況等臨床觀察方法設計皮瓣；另一組通過術中靜脈注射ICG（5 mL），以近紅外熒光探測器與成像分析系統(tǒng)來制備皮瓣；最終結果顯示48名術中通過臨床觀察方法進行腓骨肌皮瓣皮島設計的患者中有16例出現(xiàn)了術后皮島的部分缺血；而16例術中通過ICG引導進行皮島設計的患者中，僅2例出現(xiàn)了皮島的部分缺血。經(jīng)分析，ICG可以指導腓骨肌皮瓣的皮島設計，也可對術中游離皮瓣血管吻合后可能產(chǎn)生部分壞死的皮島進行ICG指引下的皮島修整從而降低術后并發(fā)癥幾率。Eguchi等［21］在3例舌癌的游離皮瓣修復中使用ICG觀察前臂皮瓣血管吻合后頭靜脈的熒光強度，成功避免了血管吻合靜脈回流不暢而產(chǎn)生的皮瓣危象。

Bui等［22］研究了1 193例頭頸部惡性腫瘤切除后游離皮瓣修復的患者，由于頭頸部難以制動，術前的誘導放化療等因素，頭頸部的游離皮瓣術后密切觀察時間應為5 d。游離皮瓣從發(fā)現(xiàn)危象到打開術區(qū)探查的時間是影響危象皮瓣存活的關鍵因素。然而過低的皮瓣探查門檻也造成了14%的陰性探查結果。因而術后對游離皮瓣危象的發(fā)現(xiàn)及皮瓣探查必要性的判斷顯得尤為重要，ICG正在其中顯示出了良好的應用前景。Betz等［23］應用ICG檢測11例口腔癌游離皮瓣修復患者術后的皮瓣血流后發(fā)現(xiàn)，皮瓣區(qū)的熒光顯影時間較周圍組織長8～22 s；與周圍正常組織相比，無皮瓣危象的皮瓣區(qū)域熒光強度≥64%，而出現(xiàn)危象的一例皮瓣熒光強度≤33%。

4 ICG在非手術治療中的應用

手術治療是口腔癌綜合序列治療中的主要手段，而非手術治療在喉、口咽癌的治療中取得的出色效果讓研究者開始重新審視一些早期口腔癌及晚期口腔癌的治療方案。除放化療以外，光熱治療（photothermal therapies，PTT）及光動力治療（pho?todynamic therapies）顯示出了巨大的潛力。光熱治療利用具有較高光熱轉換效率的材料，將其注射入人體內部，利用靶向性識別技術聚集在腫瘤組織附近，在外部光源（一般是近紅外光）的照射下將光能轉化為熱能來殺死癌細胞。光動力治療則是通過分子氧的參與，產(chǎn)生單態(tài)氧和（或）自由基，從而殺死癌細胞［24?25］。Ren 等［26］合成了一種兼顧PTT與 PDT 效應的納米材料 PEG?PCL?C3?ICG NPs。C3是人工合成的具有多個苯環(huán)與共軛雙鍵的小分子化合物（4.8 kDa），在小于808 nm波長的激發(fā)光下產(chǎn)生熱能并在氧的參與下產(chǎn)生氧自由基從而殺死癌細胞。ICG在該化合物中發(fā)揮雙重作用，既在近紅外光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，指導外部光源“有的放矢”，又可以吸收光能產(chǎn)生熱量及氧自由基。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）與聚己內酯（polycaprolactone，PCL）可以穩(wěn)定整個化合物，并且降低ICG的清除率。相較于常規(guī)的PTT介質如以金、銅、鎢為核心的納米材料，PEG?PCL?C3?ICG NPs具有更低的細胞毒性、生物相容性以及更強的抗腫瘤細胞效應。將載荷了口腔鱗狀細胞癌的小鼠分為4組，每組4只，分別靜脈注射生理鹽水、PEG?PCL?ICG NPs、PEG?PCL?C3 NPs以及PEG?PCL?C3?ICG NPs，在注射后8 h對瘤體進行近紅外光照射（808 nm，2 W/cm2，8 min）發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠在15 d內腫瘤體積增長了12倍，另外3組在第一天腫瘤體積分別增長了2.3倍、2.6倍、1.1倍；而最終的生存曲線顯示60 d觀察時間內，對照組的小鼠在43 d內全部死亡，PEG?PCL?C3?ICG NPs組僅一只小鼠死亡［26］。Ma等［27］利用牛血清蛋白荷載青蒿素，并偶聯(lián)ICG形成納米光動力抗癌藥物，在荷瘤小鼠上取得了明顯的減瘤作用。

5 小結

ICG在口腔癌的腫瘤可視化、修復重建以及非創(chuàng)傷性治療中均顯示了良好的應用前景。在腫瘤可視化方面，多數(shù)研究者利用ICG偶聯(lián)腫瘤特異性抗體指引腫瘤的外科切除，這一策略不僅可降低背景干擾，還能為患者進一步制定靶向藥物治療方案提供參考。在口腔癌前哨淋巴結的檢測中ICG與99 mTc的聯(lián)合應用，解決了ICG熒光信號穿透力弱與99 mTc背景干擾較高的問題，在未來決定口腔癌是否行選擇性頸淋巴清掃上顯示出了可觀的前景。在口腔癌手術治療的修復重建方面，通過熒光強度的定量分析排除血供不佳的供區(qū)；游離皮瓣顯微血管吻合后輔助判斷血運重建的情況；術后對于臨床判斷皮瓣危象的皮瓣進行血供觀察與分析，在皮瓣探查與保守治療間取得平衡。如何將ICG的熒光顯影從定性分析改進至定量分析以指導循證醫(yī)學是目前的研究難點。在口腔癌的非手術治療方面，ICG在光熱治療與光動力治療上顯示出重要作用，越來越多研究者將ICG加入納米復合物以合成新型光動力材料［28?29］，然而人體試驗及長期的生存分析是目前研究的難點與熱點。