青海6個(gè)山丹居群的繼代培養(yǎng)效果研究

李斐斐 唐楠 唐道城 李啟琴

摘要 為了篩選出山丹繼代培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間，以利于又快又好的擴(kuò)繁，以青海6個(gè)山丹居群的初代苗為材料，研究繼代后6周內(nèi)的形態(tài)及芽分化情況。結(jié)果表明，在繼代培養(yǎng)6周內(nèi)，6個(gè)居群的芽苗高度、芽分化數(shù)在前3周不存在顯著差異，在4～6周居群間的芽苗高度表現(xiàn)為極顯著差異，芽分化數(shù)第4周居群間表現(xiàn)極顯著差異，之后各居群間差異不顯著;各居群形成的微型鱗莖直徑及葉面積在前2周不存在顯著差異，3～6周各居群的微型鱗莖直徑及葉面積存在極顯著差異。對(duì)各居群繼代培養(yǎng)期間芽苗及微型鱗莖綜合評(píng)價(jià)表明，在6周內(nèi)SZ居群長(zhǎng)勢(shì)最好，其次為Rn居群，DW居群的長(zhǎng)勢(shì)最差。

關(guān)鍵詞 山丹;繼代培養(yǎng);形態(tài)特征;居群

中圖分類號(hào) S682.2+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）24-0056-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.017

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Subculture Effect of Six Lilium pumilum DC. Populations in Qinghai

LI Feifei，TANG Nan，TANGDaocheng et al （Plateau Flower Research Center of Qinghai University， Xining，Qinghai810016）

Abstract In order to screen out the best transfer time of Lilium pumilum DC. subculture， it is conducive to rapid and good expansion.The primary cultured seedlings of 6 Lilium pumilum DC. populations in Qinghai were used as materials，the changes in the number of morphological and bud differentiation within 6 weeks after subculture were studied.The result showed that within 6 weeks of subculture， there was no significant difference in the height of buds and the number of buds in the six populations during the first 3 weeks.The height of the shoots between the populations within 4-6 weeks was extremely significant.The number of bud differentiation showed extremely significant differences among populations in the fourth week.After that， the differences between the populations were not significant; miniature bulb diameter and leaf area formed by each population did not differ significantly in the first 2 weeks.There was a significant difference in the diameter and leaf area of theminiature bulbs of each population within 3-6 weeks.Comprehensive evaluation of sprouts and miniature bulbs during subculture of each population showed that，SZ population was the best in 6 weeks.The second place was the Rn population.The DW population had the worst growth.

Key words Lilium pumilum;Subculture;Morphological characteristics; Population

山丹（Lilium pumilum DC.）別名細(xì)葉百合、山丹花，屬于百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium） 多年生鱗莖類植物[1]。我國(guó)擁有豐富的野生山丹種質(zhì)資源，地理分布范圍廣，是百合屬中分布區(qū)最廣的種，生境條件多樣，也是青海地區(qū)唯一的一種野生百合種，主要分布在海拔2 300～4 000 m[2-4]。山丹百合種球繁殖率低，生長(zhǎng)量小，隨著旅游業(yè)和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，野生山丹百合的分布空間逐漸變小，人工栽培的山丹百合因生長(zhǎng)量小和繁殖率低等原因始終未能形成生產(chǎn)規(guī)模，因此，在較短時(shí)間內(nèi)繁殖出更多更好的優(yōu)質(zhì)種源，是目前急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

百合常規(guī)的繁殖方式繁殖時(shí)間較長(zhǎng)，易受環(huán)境的影響成活率低，經(jīng)多代繁殖后病毒不斷積累，種性退化，種球的質(zhì)量與產(chǎn)量降低[5-6]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖時(shí)取材方便，不受自然條件的約束，可以大量高品質(zhì)的進(jìn)行繁殖，且生育周期短 ，還可以引種栽培、進(jìn)行種質(zhì)資源的保護(hù)以及保護(hù)瀕危植物。陳燦[7]對(duì)白芨進(jìn)行組織培養(yǎng)，成功建立了白芨高效的快繁體系。韓瀛[8]研究了鄂爾多斯半日花各生長(zhǎng)階段的適宜培養(yǎng)基種類和激素組合，為半日花物種保護(hù)和種質(zhì)資源保存奠定了一定的基礎(chǔ)。王凱[9]、劉冬云等[10]對(duì)山丹組織培養(yǎng)有一定的研究。

百合的組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)50年代末，Robb[11]采用百合鱗莖成功進(jìn)行了離體培養(yǎng)。關(guān)于百合組織培養(yǎng)的研究較多，何香杉[12]探討了不同蔗糖濃度對(duì)百合離體保存的效果，并初步建立了3種切花百合移栽馴化體系。李宏宇等[13]對(duì)東方百合西伯利亞品種的鱗片、葉片不同培養(yǎng)基及不同放置位置進(jìn)行了篩選，建立較穩(wěn)定可靠的東方百合組織培養(yǎng)快繁體系。筆者以青海地區(qū)6個(gè)山丹居群資源為研究對(duì)象，通過(guò)組織培養(yǎng)，比較了各個(gè)居群在相同環(huán)境下生長(zhǎng)的形態(tài)差異，以期通過(guò)形態(tài)差異探討不同居群在繼代培養(yǎng)中的最佳轉(zhuǎn)接繼代時(shí)間，為山丹的遺傳育種、種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試山丹百合資源于 2014年7月采自青海省互助縣（HZ）、湟中縣上莊鄉(xiāng)（SZ）、民和縣七里寺鄉(xiāng)（QL）、平安縣（PA）、黃南藏族自治州坎布拉（Rn）、同仁縣多哇鄉(xiāng)（DW），采樣點(diǎn)的地理位置見(jiàn)表 1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山丹的初代培養(yǎng)。

選擇采自野外的6個(gè)山丹百合居群個(gè)大色白、肉質(zhì)肥厚的鱗莖，沖洗表面的泥土，去掉最外2層鱗片，取中間部分，用洗衣粉沖洗干凈，流水沖洗30 min，切成（3～5）mm×（3～5）mm的小鱗片，用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3遍，0.1%氯化汞溶液浸泡12 min，再用無(wú)菌水沖洗3遍，浸泡于無(wú)菌水中備用。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MS+0.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，溫度23 ℃左右，光強(qiáng)1 400～1 800 lx，18 h/d，相對(duì)濕度70%～80%。

1.2.2 山丹的繼代培養(yǎng)。

選取初代培養(yǎng)的小鱗莖，切除葉片，每個(gè)苗高保持在0.5 mm，并選擇鱗莖直徑為4 mm左右的小鱗莖，每瓶放置3個(gè)切好的小鱗莖，在培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的配方下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23～25 ℃，光照18 h/d，光強(qiáng)1 400～1 800 lx，相對(duì)濕度70%～80%。

1.2.3 山丹各居群形態(tài)學(xué)觀測(cè)。

繼代接種后觀測(cè)記錄植株的苗高（培養(yǎng)基平面到植株最高處的垂直高度）、芽分化情況（肉眼可見(jiàn)的芽的個(gè)數(shù)）、小鱗莖直徑（鱗莖塊最寬處的直徑）、葉長(zhǎng)、葉寬。每7 d觀測(cè)一次，共觀測(cè)6次。試驗(yàn)分3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4 山丹百合各居群的綜合評(píng)價(jià)。對(duì)繼代培養(yǎng)物7 d的芽苗高、芽分化數(shù)量、微型鱗莖直徑以及葉面積進(jìn)行由低到高的排序，分別為1、2、3、4、5、6分，若2個(gè)居群出現(xiàn)相同分值，則該分值的下一個(gè)分值排序輪空。各居群每周的總分值作為判定轉(zhuǎn)接或出瓶時(shí)間，每個(gè)居群6周的總分值作為居群繼代分化的差異性評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山丹居群繼代培養(yǎng)芽苗高的差異

由表2可知，6個(gè)山丹居群植株的芽苗高在前3周內(nèi)不存在顯著差異，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)芽苗高不斷增高，第4周時(shí)SZ居群的芽苗高極顯著高于QL居群，SZ、PA居群的芽苗高顯著高于DW、HZ與Rn居群，而DW、HZ與Rn居群的苗高不存在顯著差異，第5周時(shí)Rn居群的芽苗高顯著高于DW居群，HZ、PA、SZ與QL居群不存在顯著差異，在第6周時(shí)SZ居群的芽苗高極顯著高于DW居群，HZ、PA和Rn居群之間不存在顯著差異。

2.2 山丹居群繼代培養(yǎng)物芽分化數(shù)的差異

由表3可知，繼代培養(yǎng)3周內(nèi)6個(gè)山丹居群的芽分化個(gè)數(shù)都不存在顯著差異，繼代培養(yǎng)2周后居群DW、HZ和Rn基本沒(méi)有分化，其余居群逐漸開(kāi)始分化，繼代培養(yǎng)3周后DW和Rn居群還是基本沒(méi)有分化，從第4周開(kāi)始6個(gè)山丹居群停止分化，第4周時(shí)，居群DW的芽分化個(gè)數(shù)顯著低于其他居群，與其他居群存在極顯著差異，居群PA和SZ之間的芽分化個(gè)數(shù)無(wú)顯著差異;第5周時(shí)，居群DW的芽分化個(gè)數(shù)最少，居群DW和其余居群存在顯著差異，居群HZ、PA、SZ和Rn之間無(wú)顯著差異;第6周時(shí)，居群PA與居群SZ、Rn之間不存在顯著差異 ，與居群QL、DW和HZ存在顯著差異。

2.3 山丹居群繼代培養(yǎng)物鱗莖直徑的差異

由表4可知，DW、Rn、PA和SZ居群的鱗莖直徑在1～3周增長(zhǎng)趨勢(shì)比4～6周快。前2周內(nèi)各居群的鱗莖直徑都不存在顯著差異;第3周時(shí)，SZ居群極顯著高于DW居群，HZ居群顯著高于PA和Rn居群，PA和Rn居群之間不存在顯著差異;第 4周時(shí)，SZ居群極顯著高于DW和PA居群，HZ居群顯著高于Rn居群;第5～6周時(shí)SZ居群均極顯著高于DW和PA居群。

由于居群QL初代培養(yǎng)的小鱗莖不呈緊密抱合狀態(tài)，十分分散，在接種時(shí)，只能接種其鱗片，而非鱗莖塊，因此在鱗莖直徑的差異性比較中僅對(duì)另外5個(gè)居群（DW、HZ、PA、SZ、Rn）進(jìn)行比較。

2.4 山丹居群繼代培養(yǎng)物葉面積的差異

由于在記錄數(shù)據(jù)時(shí)，接種后第1周各個(gè)居群的植株未長(zhǎng)葉，因此從接種后第2周起開(kāi)始記錄葉長(zhǎng)和葉寬。第2周時(shí)各個(gè)居群之間不存在顯著差異;第3周時(shí)，居群SZ與Rn不存在顯著差異，與居群QL存在顯著差異，與DW、HZ、PA存在極顯著差異;第4周時(shí)，居群SZ的葉片面積最大，居群DW 葉片面積最小，居群SZ的葉片面積明顯大于居群DW、Rn、QL、HZ、PA，居群SZ與Rn存在顯著差異，與居群DW、HZ、PA、QL存在極顯著差異，居群HZ與PA不存在顯著差異;第6周時(shí)，居群SZ與居群Rn不存在顯著差異，與居群DW、QL、HZ、PA 存在極顯著差異（表5）。

以進(jìn)行轉(zhuǎn)接，Rn與HZ居群的最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間是第5周，PA居群的轉(zhuǎn)接時(shí)間為第4周，QL居群最佳的轉(zhuǎn)接時(shí)間是第2周。DW居群轉(zhuǎn)接時(shí)間不受繼代培養(yǎng)周數(shù)的影響。

通過(guò)計(jì)算各居群6周內(nèi)的總得分可知（圖2），6周內(nèi)各居群長(zhǎng)勢(shì)最好的是SZ居群，其次是Rn居群，長(zhǎng)勢(shì)最不好的是DW居群。

3 討論

經(jīng)過(guò)6周的繼代培養(yǎng)，6個(gè)山丹居群的芽苗高度、芽分化、鱗莖直徑、葉片面積方面均表現(xiàn)出一定的差異，這可能是居群的遺傳差異導(dǎo)致了生長(zhǎng)的差異[14]。芽苗高度在前3周不存在顯著差異，在4周后居群間的芽苗高度有極顯著差異，第4周時(shí)SZ居群極顯著高于QL居群，第6周時(shí)SZ居群極顯著高于DW居群。從增長(zhǎng)速率來(lái)看，4周后DW和QL居群的芽苗高度比其余居群低。芽分化個(gè)數(shù)在前3周也不存在顯著差異，第4周居群間有極顯著差異，SZ和PA居群極顯著高于DW居群，第5和6周各居群間差異不顯著。鱗莖直徑在前2周不存在顯著差異，3～6周SZ居群均極顯著高于DW和PA居群，各居群的鱗莖直徑在前3周都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)，從第3周開(kāi)始居群DW、PA、SZ和Rn的鱗莖直徑生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，而HZ的鱗莖直徑在3～4周沒(méi)有增長(zhǎng)，從第4周開(kāi)始增長(zhǎng)。各居群的葉片面積在第2周不存在顯著差異，2～5周SZ和Rn居群的葉片面積極顯著大于DW居群，第6周SZ居群的葉面積極顯著大于DW居群，而Rn居群的葉面積顯著大于DW居群。

各居群的長(zhǎng)勢(shì)從優(yōu)到差為SZ>Rn>PA>HZ>QL>DW，SZ居群在2周后均可以進(jìn)行轉(zhuǎn)接，Rn與HZ居群的最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間5周后，PA居群的轉(zhuǎn)接時(shí)間為第4周，QL居群最佳的轉(zhuǎn)接時(shí)間是第2周，DW居群轉(zhuǎn)接時(shí)間不受繼代培養(yǎng)周數(shù)的影響。

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