長春花接種叢枝菌根真菌對柑橘黃龍病菌的抑制效果

全達萬　李棟　張金蓮　宋娟　胡柳　程通　黃京華　陳廷速

摘 ?要：通過篩選獲得具有顯著促生和抗病能力的AM真菌菌株，為防治柑橘黃龍病提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)，并探索防治新途徑。采用盆栽法，于長春花幼苗期分別接種17株AM真菌進行長春花農(nóng)藝性狀和對柑橘黃龍病的抗病性比較試驗，研究不同叢枝菌根真菌菌株對長春花的促生效果及對柑橘黃龍病的抑制效果。結(jié)果表明，長春花接種AM真菌后，菌株GZ10、GZ5和JX70能顯著促進植株生長，其中接種GZ10的株高和莖徑分別比CK增加了23.1%和12.1%，接種GZ5的葉片數(shù)比CK增加了12.9%;接種菌株GZ1、BNMJ和PWJ有效提高了長春花對柑橘黃龍病的抗病和耐病能力，其相對防效分別為78.39%、66.87%和69.75%。

關(guān)鍵詞：長春花;叢枝菌根真菌;優(yōu)勢菌株;柑桔黃龍病;抗性

中圖分類號：S436.66 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Effects of Inhibition Citrus Huanglongbing on Catharanthus roseus with Different Arbuscular Mycorrhizal Fungi Species

QUAN Dawan1， 4， LI Dong2， ZHANG Jinlian3， 4 *， SONG Juan4， HU Liu2， CHENG Tong3， HUANG Jinghua1 *， CHEN Tingsu4

1. School of Agronomy， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530001， China; 2. Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Coopration， Hangzhou， Zhejiang 310007， China; 3. School of Public Health Care， Xiamen University， Xiamen， Fujian 361102， China; 4. Microbiology Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： To provide fundamental references and better ways of preventing and controlling citrus Huanglongbing （HLB）， a research was conducted to obtain arbuscular mycorrhizal （AM） fungi that possess plant growth-promoting and disease resistance abilities. The experiment utilized the pot culture method， where 17 strains of AM fungi were inoculated into the roots of Catharanthus roseus that were in the seedling stage. The colonization of different AM fungi strains were analyzed to understand how AM fungi simulating the growth and ameliorate citrus HLB infection in C. roseus under greenhouse conditions. During this process， various measurements were taken， and the agronomic characters， rate of colonization， infection intensity， arbuscular abundance， and HLB infection were analyzed. After C. roseus plants were inoculated with AM strains， strains GZ10， GZ5， and JX70 significantly enhanced the growth of C. roseus. Plants inoculated with GZ10 exhibited 23.1% and 12.1% increase in stem height and diameter， while GZ5 increased leaf number by 12.9%， both in respect to CK. Three strains （GZ1， BNMJ， and PWJ） improved disease resistance to citrus HLB， with a relative prevention rate of 78.39% for GZ1， 66.87% for BNMJ， and 69.75% for PWJ. The result proved that AM inoculation could significantly improve the growth of C. roseus and to some extent increase its disease resistance to citrus HLB.

Keywords： Catharanthus roseus; arbuscular mycorrhizal fungi; dominant strain; citrus Huanglongbing; disease resistance

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.016

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing，簡稱HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上極具毀滅性的一種病害[1]，該病的病原菌為韌皮部內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于根瘤菌科韌皮部桿菌屬。柑橘植株感染柑橘黃龍病后，植株會出現(xiàn)葉黃、凋落、根部腐爛等病癥，花畸形且易脫落，果實變小、味道也發(fā)生改變，發(fā)病后幾個月至數(shù)年后整個植株會枯死。由于柑橘黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus， CaLas）至今未能從感病植物體中分離出來進行人工培養(yǎng)，這也是導(dǎo)致柑橘黃龍病的研究難以做出突破性進展的原因之一[2]。

長春花（Catharanthus roseus）是夾竹桃科長春花屬的喜光性植物，具有很高的觀賞價值和藥用價值[3]?？滤氲萚4]的研究表明：柑橘黃龍病菌可以通過寄生植物菟絲子從一株柑橘植株傳到另一株柑橘或草本植物長春花上，大約3個月的時間就能在長春花植株上觀察到由黃龍病菌引起的黃化癥狀。長春花具有生長周期短，易栽培，感染黃龍病菌后發(fā)病快，癥狀明顯等特點，因此，將其作為研究柑橘黃龍病的模式植物和實驗材料[5]。

叢枝菌根（arhuscular mycorrhizae， AM）是廣泛分布在自然界中的一類有益微生物，自然界中80%的陸生植物能與其建立共生關(guān)系[6]。AM真菌與植物根系形成的共生體能促進植株對營養(yǎng)和水

分的吸收，進而促進植物的生長，提高植物的抗逆性。AM真菌可調(diào)節(jié)次生代謝物的合成，改善植物根際微環(huán)境，對土傳病害有一定的抑制效應(yīng)[7-8]。研究表明，AM真菌能有效降低真菌、線蟲、細(xì)菌等病原體對植物的為害程度，減少農(nóng)藥的使用[9]，目前已經(jīng)證實的可有效控制植物土傳病害的AM真菌超過30種[10]。

本研究以長春花作為黃龍病的寄主植物，同時利用不同植物來源的AM真菌菌株對其進行接種，觀察長春花接種不同AM真菌菌株后黃龍病的發(fā)病情況，從而較快地篩選獲得具有顯著促生和抗病能力的AM真菌菌株，為防治柑橘黃龍病提供理論依據(jù)，并探索防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 ?材料

長春花種子及帶CaLas的長春花由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院鄧曉玲實驗室提供。

花盆（盆口直徑為15 cm、深度為12.5 cm，多菌靈浸泡后使用）、營養(yǎng)液（Hoagland）、基質(zhì)（塘泥∶沙=1∶1）。

試驗所用的AM真菌菌株由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物課題組分離保存，孢子密度均多于10個/g，接入量為20 g/盆。具體菌株及編號如表1所示。

1.2 ?方法

1.2.1 ?種苗移栽 ?在花盆底部墊一張與底部大小一致的紙片，加入1/2已滅菌的基質(zhì)，選取長勢一致、生長健康的長春花苗移栽至花盆內(nèi)，在其根部附近放入AM真菌菌株20 g，使其與根系充分接觸，繼續(xù)加入基質(zhì)至花盆的3/4，同時保證基質(zhì)沒過根系，按菌株編號掛上標(biāo)簽。同時設(shè)置不接種處理為對照，每個處理種植15盆，共270盆。

盆栽放置于大棚中，大棚內(nèi)的光照和溫度與外界環(huán)境一致，定期觀察，每2 d適量澆水，每2周施加Hoagland營養(yǎng)液100 mL/盆。

1.2.2 ?感病處理 ?將廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物所溫室內(nèi)感染柑橘黃龍病的長春花的病葉作為嫁接材料，選取8株長春花，待植株長至8～10對葉時，以去頂芽嫁接病葉的方式感染黃龍病，嫁接前植株澆透水，嫁接后立即放入提前搭好的小拱棚中進行保濕管理。嫁接后10 d內(nèi)將小拱棚嚴(yán)

密封好，使拱棚內(nèi)的相對濕度保持在90%以上，10 d后將小拱棚打開，適當(dāng)降低拱棚內(nèi)的相對濕度，20 d后可將小拱棚撤去，轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室內(nèi)，隔天澆水1次。

1.2.3 ?感病率統(tǒng)計 ?嫁接完成后，對各處理進行為期60 d的感病觀察，從第1株長春花植株出現(xiàn)柑橘黃龍病癥狀開始，記錄每個處理中感染柑橘黃龍病的植株數(shù)量，直到每一批試驗材料中出現(xiàn)的感病植株的數(shù)量不再增加為止，做好統(tǒng)計，計算其感病率、病情指數(shù)及相對防效。長春花植株感染黃龍病級別劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

感病率=感病植株的數(shù)量/（嫁接植株的總數(shù)量–植株非病死亡數(shù)量）×100%

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相對級別）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級別）×100%

防效指數(shù)=（對照病情指數(shù)–處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.4 ?長春花根系采集 ?移栽40 d后，采集長春花根系樣品，方法如下：每個處理隨機選取3盆植株，用剪刀剪下老、嫩、粗、細(xì)4種不同的根系，沖洗干凈后用50%酒精浸泡保存，用于觀察AM真菌侵染情況，記錄根系根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊和叢枝數(shù)量，計算菌根侵染率，比較不同AM真菌的侵染能力。

1.2.5 ?根系染色及菌根侵染率測定 ?根系染色參考廖楠等[11]的方法，略有改動。將根系取出沖洗干凈，剪成1 cm長的根段，加20% KOH溶液浸泡根段，90 ℃水浴8 min后沖洗干凈。加入堿性H2O2脫色1 h后沖洗干凈，加5%醋酸酸化5 min，然后再加入5%墨水醋染液，放入水浴鍋中加熱30 min。染色完成后倒去染液，沖洗后用清水浸泡12 h以上脫色，鏡檢觀察菌根侵染情況。菌根侵染率的測定參考王幼珊等[12]的方法。

1.2.6 ?測定指標(biāo)與方法 ?移栽25 d后，測量所有幼苗的株高、莖粗和葉片數(shù)，每25 d測量1次。125 d后，每個處理選取5株長春花，將植物挖出來沖洗干凈晾干后，稱量植株的鮮重，隨后裝進信封中，95 ℃殺青30 min，再在65 ℃中烘干至恒重（約24 h），稱量植株的干重。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和DPS統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理和分析，置信水平為95%（P<0.05）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同AM真菌菌株對長春花根系侵染情況

接種17種外源性AM真菌，長春花幼苗的根系侵染率存在一定差異，部分達顯著性差異（表3）。由表3可見，未接種AM真菌的處理組（CK）未觀察到菌絲和囊泡結(jié)構(gòu)，根系侵染率均為0。JX126、GZ1和E16-1-32菌株的根系侵染率較高，均超過了30%，說明這3個菌株可與長春花建立良好的共生關(guān)系。而JX145、JX165、LC-C58、E26-47、HTJ2-60和LJCK菌株的根系侵染率較低，均低于10%。17種AM真菌對長春花根系的侵染力不同，這說明AM真菌與長春花之間具有一定的偏好性。根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊結(jié)構(gòu)及叢枝結(jié)構(gòu)的染色圖像如圖1所示。

2.2 ?不同AM真菌菌株對長春花幼苗生長的影響

在移栽后25、50、75 d分別測量各處理長春花的莖徑、株高和葉片數(shù)，結(jié)果見表4。對比這3個時期中各處理長春花的莖徑、株高和葉片數(shù)的變化可以發(fā)現(xiàn)：接種處理植株莖徑，25 d時，所有接種處理植株均高于對照，除JX165、BNMJ、HTJ2-60、LSJ和PWJ菌株外，其他接種處理均顯著高于對照;50 d時，除了JX80、JX145、JX165、LC-C58、E26-47和LSJ菌株外，其他處理莖徑均顯著高于對照;而75 d時，僅GZ10菌株處理莖徑顯著高于對照，JX80、JX145、JX165、LC-C58、E26-47、HTJ2-60和PWJ菌株處理莖徑均低于對照。接種處理植株株高，25 d時，JX126、JX145、GZ10顯著高于對照;50 d時，JX126和GZ10顯著高于對照;到了75 d，僅GZ10顯著高于對照。接種處理植株葉片數(shù)，25 d時，所有接種處理植株均高于對照且大部分處理顯著高于對照;50 d時，除JX80菌株外其它菌株處理均高于對照且大部分菌株顯著高于對照;到了75 d，僅GZ5菌株處理顯著高于對照。

綜上所述，25 d時接種處理的長春花莖徑、株高和葉片數(shù)的增長大多都高于CK處理;而在75 d時CK處理與各處理間的差距變小，與CK相比，僅接種GZ10能顯著增加長春花的莖徑和株高，接種GZ5能顯著增加長春花的葉片數(shù)。

長春花種植100 d后，稱量其干鮮重，結(jié)果見表5。與CK相比，施加AM真菌菌株后只有少部分能增加長春花的鮮重和干重，其中JX70能顯著增加長春花的鮮重和干重，LSJ和NGJ能顯著增加長春花的鮮重。

2.3 長春花接種不同AM真菌對柑橘黃龍病的抑制效果

長春花接種不同AM真菌對柑橘黃龍病的抑制效果見表6，與CK相比，大部分接種AM真菌的長春花能有效延緩黃龍病病情的發(fā)展。其中防效最好的AM真菌菌株為GZ1，其發(fā)病率為14.29%，病情指數(shù)為8.33%，相對防效高達78.39%。BNMJ和PWJ菌株的發(fā)病率為28.57%，病情指數(shù)分別為12.78%、11.67%，相對防效分別為66.87%、69.75%。這3個菌株的相對防效均顯著高于對照。CK與接種GZ1、BNMJ、PWJ和E26-47菌株長春花的黃龍病癥狀如圖2所示。

3 ?討論

有研究表明，AM真菌的根外菌絲和根內(nèi)菌絲相互交錯，形成龐大的菌絲網(wǎng)[13]，提高植物對N、P、K、Zn、Fe、Mn、Cu、Ca等礦質(zhì)元素的吸收，改善宿主植物的營養(yǎng)狀況，促進植物生長發(fā)育[14-15]。在本研究中，接種AM真菌可以有效增加植物的莖徑、株高、葉片數(shù)、鮮重和干重，其中施加GZ10可有效增加長春花的莖徑和株高，施加GZ5可有效增加長春花的葉片數(shù)，施加JX70可有效增加長春花的鮮重和干重，這3種菌株可作為促進長春花生長的優(yōu)勢菌株。不同的AM真菌對同一宿主植物有不同的侵染率，侵染率高的AM真菌說明可與該宿主植物有較強的親和度[16]，在長春花根系的定殖率中發(fā)現(xiàn)，這3種菌株的侵染率不是最高的，侵染率最高的菌株JX126對長春花的促生長作用并不明顯，說明該菌株雖然與長春花根系的親和度較高，但不能有效促進長春花的生長。

AM真菌與宿主植物共生后，會誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生一些激素類物質(zhì)，如植保素、幾丁質(zhì)酶、過氧化物酶、β-1，3葡聚糖酶、胼胝質(zhì)等[17]。張偉珍[18]在接種AM真菌的箭筈豌豆的葉片中檢測到POD和CAT活性顯著高于未接種處理，說明AM真菌可以提高植物對逆境脅迫的抵抗能力。然而在AM真菌和宿主植物的互作中，并不是所有的AM真菌都能提高植物的抗病能力和耐病能力，有些會出現(xiàn)無效應(yīng)[19]甚至負(fù)效應(yīng)[20]的結(jié)果。在本研究中，感染柑橘黃龍病后，與CK相比，柑橘黃龍病的發(fā)生明顯受到了抑制，大部分接種了AM真菌的長春花感病率和病情指數(shù)皆低于CK，特別是接種GZ1，該處理相對防效高達78.39%，BNMJ和PWJ的防治效果也達到了60%以上。但也有少部分菌株引起了負(fù)效應(yīng)，如JX145和E26-47的感病率和病情指數(shù)皆高于CK。目前雖然篩選出一些有預(yù)防效果的AM真菌菌株，但其背后的抗病機理尚不明確，還需要在今后做進一步的研究。

4 ?結(jié)論

接種AM真菌后，長春花的莖徑、株高、葉片數(shù)、鮮重和干重均得到了不同程度的增加，其對柑橘黃龍病的抗病和耐病能力也有所提高。對比接種不同AM真菌對長春花的促生效果，GZ10、GZ5和JX70可選為優(yōu)勢AM真菌;對比接種不同AM真菌提高長春花對感染柑橘黃龍病的抗病與耐病能力，GZ1、BNMJ和PWJ可選為優(yōu)勢AM真菌。

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收稿日期 ?2019-09-18;修回日期 ?2019-11-06

基金項目 ?國家自然科學(xué)基金項目（No. 31360356，No. 31760137）;廈門大學(xué)聯(lián)合項目（2017-21）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技項目（No. 2015YT81）。

作者簡介 ?全達萬（1995—），男，碩士研究生，研究方向：作物生態(tài)。*通信作者（Corresponding author）：張金蓮（ZHANG Jinlian），E-mail：zhangjinlian1@126.com;黃京華（HUANG Jinghua），E-mail：hjhscau@163.com。