食品中主要真菌毒素檢測方法研究進展

袁 航 丁同英

(無錫城市職業(yè)技術學院，江蘇 無錫 214000)

真菌毒素是由真菌分泌的一類天然代謝產物，食品生產的每個階段均可產生，會污染食品，并通過食物或動物飼料間接傳遞給消費者，對人類健康造成威脅。食品中真菌毒素的存在是全球關注的問題，聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，全球糧食有25%受到真菌毒素污染[1]，其中對食品安全威脅最大的真菌毒素包括黃曲霉毒素(AFs)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等[2]。隨著科學家們對真菌毒素毒性的不斷探索與研究，真菌毒素給國家經濟、人民健康帶來的危害逐漸明晰，越來越多的消費者開始注重食品安全，越來越多的企業(yè)和機構關注如何精準檢測和消減食物中真菌毒素，很多國家和地區(qū)也出臺了食品中真菌毒素限量規(guī)定，這些均有力地推動了各種毒素檢測技術的發(fā)展。從經典的薄層色譜法到生物芯片等新型技術，食品安全檢測技術有了巨大的進步，但目前如何便捷高效準確地測定食品中真菌毒素含量仍是研究的重中之重，對于食品安全具有重大意義。文章擬綜述真菌毒素的主要類型以及檢測方法，分析各方法的優(yōu)缺點，并對其未來發(fā)展方向進行展望，以期為食品安全監(jiān)控以及未來檢測技術的發(fā)展提供依據(jù)。

1 食品中主要真菌毒素種類

1.1 黃曲霉毒素(AFs)

AFs主要是由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌產生，在玉米、大豆、花生等糧油產品、堅果類產品、乳制品中易被檢出。AFs有B1、B2、B2a、G1、G2、M1等多種類型，其中AFB1毒性最強[3]，若被人體食用，輕則膽管增生，重則引起肝臟病變甚至癌變，同時對食用者后代仍具有致癌、致畸作用[4]。目前對于食品中AFs的檢測主要有薄層色譜法、高效液相色譜法以及免疫分析法等[5]。

1.2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)

DON又稱嘔吐毒素(Vomitoxin)，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌在低溫、潮濕的環(huán)境中產生，污染小麥等糧農產品。DON的理化性質穩(wěn)定，在日常烹飪和加工中難以被破壞[6]，進入人體后，會產生頭疼、發(fā)燒、嘔吐等不良反應[7]，DON還可與其他毒素一起產生協(xié)同效應，誘發(fā)更大的生理毒性[8]。近幾年糧食企業(yè)檢測DON時廣泛應用基于間接酶聯(lián)免疫原理的試劑盒法，而高效液相色譜法仍是實驗室常用的DON檢測手段[9]。

1.3 鏈格孢霉毒素(Alternaria toxins)

鏈格孢霉毒素是一種新發(fā)現(xiàn)的真菌毒素，存在于植物、種子、農產品、大氣和土壤中[10]，其主要代謝產物—鏈格孢酚(AOH)、鏈格孢酚單甲醚(AME)、細交鏈孢菌酮酸(TeA)、騰毒素(TEN)等毒素具有誘變性、慢性及急性毒性和三致效應[11-12]，可污染食物，使哺乳類動物頭暈、嘔吐以及運動功能障礙，最終導致死亡[13-14]。近幾年因鏈格孢霉毒素引起的健康風險已備受關注，但目前缺乏針對食品中鏈格孢霉毒素制定監(jiān)管限制或監(jiān)測指南，關于其限量規(guī)定也尚未見報道[15-17]，多數(shù)采用LC-MS法檢測鏈格孢霉毒素[18]。

2 傳統(tǒng)檢測方法

2.1 薄層色譜法(TLC)

TLC法于1990年被列為AOAC標準方法，是檢測真菌毒素的經典方法，通過對待測毒素進行提取濃縮及薄層分離，在紫外光下進行顯色反應，依據(jù)熒光特性進行定性分析，根據(jù)熒光斑點的大小進行定量分析[19-20]，該法多用于食品藥品領域。Rocha等[21]采用基于QuEChERS的TLC法對巴西南部地區(qū)48個小麥面粉樣品中DON含量進行分析，檢測限和定量限分別為30，100 ng/mL，回收率為80.2%～105.4%，變異系數(shù)<10%，證明該法用于DON評價是可靠的。TLC法成本低，樣品前處理簡單，但是靈敏度低，只能定量，費時費力，目前逐漸被其他方法所取代。

2.2 氣相色譜(GC)及氣質聯(lián)用(GC-MS)技術

GC是一種常用于青霉素、鏈格孢霉毒素的檢測手段，在測定ZEN時需先進行衍生化，其所用試劑對濕度敏感，有一定的局限性。而GC-MS的出現(xiàn)既避免了GC難以定性的劣勢，又彌補了MS無法分析的缺點，被應用于醫(yī)藥、食品等領域[22]。Mcmaster等[23]為克服基質干擾和信號抑制，將穩(wěn)定同位素d1-DON作為內標加入到傳統(tǒng)的GC-MS中，使用這種改進的穩(wěn)定同位素稀釋法(SIDA)測定了98份高粱品種196份樣品中的DON含量。通過采用改進的SIDA，基于d1-DON回收率的計算，發(fā)現(xiàn)用GC-MS法可以準確可靠地定量高粱樣品中的DON含量。

2.3 液相色譜(LC)及液質聯(lián)用技術(LC-MS)

LC-MS是一種集分離系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)于一體的檢測手段，可同時定性定量分析，操作簡單、特異性強、靈敏度高，在生化、藥物、食品保健分析和環(huán)境污染方面被廣泛應用。LC-MS法是多種真菌毒素分析的首選技術[24]，Guo等[25]采用超高效液相色譜—質譜聯(lián)用法(UHPLC-MS)建立了一種簡單可靠且能同時測定葡萄中鏈格孢酚(AOH)、交鏈格孢酚單甲醚(AME)、細交鏈格孢菌酮酸(TeA)和騰毒素(TEN)等幾種鏈格孢霉毒素的分析方法，通過測定線性(R2>0.99)、回收率(77.8%～101.6%)、靈敏度(檢測限0.03～0.21 μg/kg，定量限0.09～0.48 μg/kg)和精密度(RSD≤12.9%)進行驗證，表明所開發(fā)方法的準確性、可重復性和敏感性是可接受的，成功揭示了葡萄中鏈格孢屬毒素的污染狀態(tài)。Yan等[26]結合QuEChER預處理，將LC-MS法應用于同時定量不同豬組織(心臟、肝臟、脾臟和肌肉)中的9種真菌毒素，發(fā)現(xiàn)其目標毒素檢出限為0.5～1.0 ng/g，定量限為1～2 ng/g，加標組織回收率為70%～110%，重現(xiàn)性良好，驗證結果表明LC-MS法結合QuEChERS樣品前處理方法是有效的，準確可靠，重現(xiàn)性好，可滿足大量樣品的多組分同時檢測[27]。

3 免疫學快速檢測方法

3.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

ELISA是一種將現(xiàn)代檢測手段與免疫技術相結合的微量檢測技術，其彌補了以往儀器法和化學法的一些缺陷，在食品、藥品等領域有較高應用價值。Wang等[28]采用單克隆抗體13D8建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(icELISA)，可同時檢測AOH和AME，其檢出限分別為0.7，1.0 ng/mL，添加小麥樣品的平均回收率為84.5%～107.6%，變異系數(shù)<10%，其檢測結果與LC-MS法一致，表明該方法適用于小麥中AOH和AME的同時檢測，但icELISA法有時會出現(xiàn)假陽性結果，且不能用于多種毒素的同時檢測。

3.2 膠體金免疫層析法(GICA)

GICA法是一種以膠體金為示蹤劑，用于抗原抗體的檢測技術，其操作簡便、成本低，適用于基層檢測[29]。Hu等[30]基于GICA快速篩選了藥材根和根莖中毒性最強的AFB1，樣品中的遷移分析物(AFB1)和固定在測試條上的抗原之間發(fā)生競爭，爭奪膠體金標記的抗體結合的結合位點，此法達到了≤0.1 ng/mL的高靈敏度，且與LC-MS法測定結果一致。盡管中藥基質復雜，但該方法具有較高的靈敏度和選擇性，且樣品處理簡單，被證明是一種快速、經濟、可靠的現(xiàn)場篩查富含淀粉和多糖的中草藥中真菌毒素的技術。付寧等[31]用GICA法測定了100批次中藥材中的AFB1含量，假陽性率為20.8%，假陰性率為0，符合率為83.3%。為了降低篩查的假陽性率，可以采取增強檢測信號的手段，提高準確率和精確度，或者將此法與生物傳感器技術聯(lián)用以達到更為理想的效果。

3.3 時間分辨熒光免疫分析技術(TR-FIA)

TRFIA是一種集抗原抗體的特異性和示蹤劑靈敏性于一體的超微量技術，Hu等[32]建立了以Eu3+標記的免疫球蛋白為示蹤劑定量檢測飼料中AFB1含量的TRFIA法，與ELISA法相比，該方法的變異系數(shù)為1.25%～3.73%，平均回收率為93.71%～97.80%，具有較高靈敏度和精密度，通過與HPLC比較，證實了該方法的可靠性，此外可同時檢測多個樣品，大大降低了工作人員的檢測強度，減小了人為誤差，提高了工作效率和準確性，因而在安全檢測方面具有重要價值。

4 其他快速檢測方法

4.1 表面等離子體共振技術(SPR)

SPR技術可實時分析天然狀態(tài)下生物分子間相互作用，無需破壞生物分子，主要被應用于醫(yī)療、藥物、食品檢測等方面。Wei等[33]建立了基于自組裝單層膜的SPR法，測得AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、DON的最低檢出限分別為0.59，1.27，3.26 ng/mL，所有真菌毒素的交叉反應性較低。此外，將試驗數(shù)據(jù)與LC-MS分析結果進行比較，兩者吻合度較好，結果可靠，表明所建立的同時檢測多種真菌毒素的SPR方法靈敏度高、線性好、特異性強，能夠滿足谷物類食品的檢測要求，可實時分析以及免標記，為真菌毒素檢測工作帶來了極大便捷[34]。

4.2 表面增強拉曼光譜技術(SERS)

SERS是一種有極強拉曼散射增強效應的分子振動光譜技術[35]，Rostami等[36]建立了基于多孔SERS檢測平臺實現(xiàn)OTA無標記檢測的SERS法，可將支持液膜提取法與SERS法結合定量葡萄酒樣品中的OTA，其在白葡萄酒中檢測限為115 ng/mL，與LC-MS法定量相當。但是紅葡萄酒中基質效應會干擾檢測，而支持液膜提取與SERS法結合為OTA檢測提供了一種有效減少時間和成本的方法，這是優(yōu)于其他提取和直接檢測方法的明顯優(yōu)勢。Li等[37]展示了一種基于微陣列SERS的小分子免疫傳感器的復用能力，可實現(xiàn)AFB1、ZEN、OTA 3種毒素的同時分析，其檢測范圍分別為0.061～0.066，0.530～0.570，0.260～0.290 μg/kg，回收率為83.8%～108.1%，變異系數(shù)<15%。通過與常規(guī)儀器分析進行比較，二者所得結論一致，說明該方法準確可靠，具有較高靈敏度、高重現(xiàn)性、高穩(wěn)定性、寬檢測范圍，但目前僅限于實驗室使用，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測[38]，其在痕量檢測領域的應用潛力有待進一步開發(fā)[39]。

4.3 生物芯片技術(BcT)

BcT是一種快速微型分析技術，將生物大分子固化至載體表面，使二者緊密結合，根據(jù)分子間反應，采用儀器快速分析信號完成檢測[40]，在營養(yǎng)學、微生物學、毒理學與轉基因食品領域被廣泛應用。王云霞等[41]采用該技術同時測定了OTA、DON、AFB1和ZEN在奶牛飼料中的殘留量，并與HPLC方法進行結果比對，在1倍檢出限加標回收試驗和2倍檢出限加標回收試驗中，4種毒素回收率均為80%～120%，其準確性良好，變異系數(shù)均≤15%，可滿足定量測定要求，并且前處理簡便，檢測過程耗時短，適合大批量樣品的現(xiàn)場篩查工作。但是從生物芯片的應用現(xiàn)狀來看，其還存在一些限制因素，如缺少規(guī)范化的標準、檢測靈敏度雖有提升但受到諸多條件影響、檢測系統(tǒng)昂貴以及需大量準確的DNA片段信息等，這些問題還有待進一步研究[42]。

5 結束語

中國是人口大國，民以食為天，糧食污染問題不容忽視，如何實現(xiàn)食品行業(yè)中真菌毒素準確、靈敏、便捷高效檢測仍是未來食品安全檢測中的重點內容與發(fā)展趨勢。傳統(tǒng)的薄層色譜法靈敏度低、費時費力，無法滿足快速檢測的需要。氣相色譜法、氣相—質譜聯(lián)用法、液相色譜法和液相—質譜聯(lián)用法具有檢測限低、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)勢，但由于其操作繁瑣、檢測周期長，故不適合應用于農產品的現(xiàn)場快速檢測。基于免疫學原理的酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析技術和時間分辨熒光免疫分析技術具有快速、靈敏、經濟、準確等優(yōu)點，但也存在抗原抗體制備困難、有底物干擾、假陽性多等缺點。一些新興的檢測方法如表面等離子體共振技術、表面增強拉曼光譜技術和生物芯片技術等在毒素的快速檢測方面也得到了一定發(fā)展，但由于缺少規(guī)范化的標準，將其推廣使用仍需進一步的研究。