丹參有效成分
——二氫丹參酮Ⅰ抑制胃癌的作用研究

鐘雄東

珠海市人民醫(yī)院普外科(珠海 519000)

基于我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ是丹參的主要成分之一，并預(yù)測發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ能靶向胃癌的多個關(guān)鍵靶點。既往已經(jīng)有部分研究證實二氫丹參酮Ⅰ對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用[1- 6]，但其對胃癌的作用和具體機(jī)制仍未明確。本項目研究主要通過體內(nèi)外實驗明確二氫丹參酮Ⅰ對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以明確二氫丹參酮Ⅰ對胃癌的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

二氫丹參酮I(dihydrotanshinoneⅠ，DHTS，純度>98%)購于天津中新藥業(yè)集團(tuán)有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，青鏈霉素(Gibco)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,二甲基亞砜(DMSO)購自西格瑪(美國密蘇里州圣路易斯)。購買胎牛血清、青霉素和鏈霉素，天津昊陽生物制品有限公司(中國天津)。除非另有說明，其他試劑均從Sigma購買。將DHTS溶解于DMSO中并在- 20 ℃下儲存，使用前用新鮮培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從中國科學(xué)院(上海，中國)型培養(yǎng)組的細(xì)胞庫中獲得人胃癌細(xì)胞株AGS、HCG27和人胃上皮細(xì)胞株GES- 1，并在5% 37 ℃的CO2濃度為10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 CCK8細(xì)胞活性檢測

使用Cell Counting Kit(CCK8)CCK- 8/WST- 8試劑盒(碧云天)：消化細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸浮液，以2 000個/孔的密度于96孔板中接種，每組設(shè)置5個復(fù)孔，加入不同濃度的DHTS處理24 h。檢測前，每孔加入10 μL CCK- 8 試劑，37 ℃避光孵育2 h；然后將孵育后的培養(yǎng)基移到酶標(biāo)板中，450 nm 處用BIO-RAD 酶標(biāo)儀測定的吸光度。

1.4 平板克隆形成實驗

細(xì)胞以200個/孔的細(xì)胞量接種于六孔板中，細(xì)胞貼壁后開始采用DHTS干預(yù)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)。每隔2天在顯微鏡下觀察克隆的大小，每隔3天換上新的培養(yǎng)液。處理14 d后，在熒光顯微鏡下拍照。隨后吸去培養(yǎng)液，用PBS 小心洗滌一次，每孔加0.1 mL 10%甲醇溶液固定細(xì)胞30 s。吸去甲醇溶液，每孔加0.1 mL 結(jié)晶紫染液，室溫中放置20 min。輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37 ℃烘干拍照計數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞

使用凱基公司KGA1026試劑盒。用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，1 500 rpm，3 min離心，吸去上清，用PBS洗1遍，離心后用PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取1E+5 個細(xì)胞量的懸液，離心棄上清，加入500 μL Binding buffer 重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-APC，混勻后，再加入5 μL 7-AAD染液，混勻，室溫，避光，反應(yīng)5～15 min后置于冰上。1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀機(jī)檢測。GFP的綠色熒光：FITC通道篩選GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-APC/7-AAD熒光檢測。Annexin V-APC的紅色熒光：激發(fā)波長633 nm，最大發(fā)射波長660 nm。7-AAD紅色熒光：激發(fā)波長Ex=546 nm；發(fā)射波長Em=647 nm。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測定

細(xì)胞內(nèi)的ROS水平通過Fuorogination探針CM-H2DCFDA測定。簡言之，用不同濃度的DHTS加或不加NaC(500 μm)處理AGS細(xì)胞2 h或4 h。然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，并在37 ℃下用H2DCFDA(30 μm)稀釋30 min。孵育后，細(xì)胞被洗滌兩次，再懸浮在新鮮的PBS中。使用Facstar-Fow細(xì)胞儀(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey，美國)。

1.7 氧化應(yīng)激檢測

采用DHTS處理，測定了谷胱甘肽(GSH)/氧化二硫化物(GSSG)比值，以測定AGS細(xì)胞的氧化應(yīng)激。在本研究中，總谷胱甘肽的濃度用酶法測定T-GSH、GSH和GSSG。通過5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)GSSG還原酶回收試驗測定了T-GSH。使用生成的5-硫代- 2-硝基苯甲酸(TNB)測定GSSG與DTNB的還原GSH反應(yīng)。在410 nm處測量的信號被用來分析TNB的形成。通過從t-gsh中減去gssg計算降低的gsh水平。計算公式如下：

1.8 半胱天冬酶活性檢測

caspase- 3、caspase- 8和caspase- 9活性根據(jù)制造商的說明(abcam)用熒光分析試劑盒進(jìn)行測定。簡單地說，收集細(xì)胞并用溶解緩沖液溶解。蛋白(20 μg)用半胱天冬酶孵育。3個底物ac-devd amc、caspase- 8底物ac-ledh amc或caspase- 9底物ac-ietdamc(50 μg)，分別在37 ℃下保持2 h。然后將混合物轉(zhuǎn)移到96孔中。黑色底的微孔板。在福雷森特平板閱讀器(美國密理博公司)中分別記錄了400 nm和505 nm無酵底物和劈裂底物的熒光。

1.9 裸鼠成瘤實驗

小鼠實驗符合暨南大學(xué)動物倫理委員會審核通過。裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司，Balb/c裸鼠，雄性，6周齡，每組5只)，適應(yīng)一周后進(jìn)行注射：HCG27細(xì)胞消化離心后制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后取適量的細(xì)胞用PBS懸浮，在Balb/c裸鼠側(cè)腹部皮下接種。每只接種2E+6個細(xì)胞，注射體積為100 μL。當(dāng)小鼠成瘤后，采用DHTS溶于生理鹽水，以5 mg/kg每天對小鼠瘤體進(jìn)行瘤內(nèi)注射，此后，每隔3天測量注射部位腫瘤的體積。21天后小鼠頸椎脫臼處死，取出腫瘤稱重，4%多聚甲醛固定，待后續(xù)病理分析。采用免疫組化檢查小鼠腫瘤組織中Ki67、Caspase- 3、Caspase- 8的表達(dá)水平，免疫組化由珠海市人民醫(yī)院病理科完成。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

圖1 CCK8檢測DHTS對人胃癌細(xì)胞的抑制作用注：(A)DHTS的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(B-C)不同濃度DHTS對胃癌HCG27、AGS細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響；(D)不同濃度DHTS對人胃上皮細(xì)胞株GES- 1的影響(與對照組相比較， **P<0.01， ***P<0.001)

2 結(jié) 果

2.1 二氫丹參酮Ⅰ對人胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

DHTS的分子結(jié)構(gòu)式如圖1A所示。采用CCK8技術(shù)檢測DHTS對人胃癌細(xì)胞株HCG27和AGS細(xì)胞活性的影響，隨著DHTS劑量濃度增加(從0 μmol、5 μmol、10 μmol、20 μmol)，DHTS對HCG27和AGS細(xì)胞的抑制顯著增強(qiáng)(圖1B-C)。而不同濃度的DHTS對人胃上皮細(xì)胞株GES- 1沒有顯著的抑制作用，如圖1D所示。

2.2 二氫丹參酮Ⅰ對人胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

采用平板克隆形成實驗檢測DHTS對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響，采用DHTS 10 μmol對HCG27和AGS細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)2周后，與DMSO對照相比，顯著抑制了HCG27和AGS細(xì)胞的克隆形成能力，見圖2。

2.3 二氫丹參酮Ⅰ對細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DHTS對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，采用DHTS 10 μmol對HCG27和AGS細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h后，與DMSO對照相比，DHTS組的細(xì)胞凋亡率高于DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。

2.4 二氫丹參酮Ⅰ促進(jìn)AGS細(xì)胞氧化應(yīng)激

圖2 DHTS對人胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響注：(A-B)DHTS 10 μmol對HCG27和AGS細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)2周細(xì)胞克隆形成代表圖；(C-D)DHTS 10 μmol處理HCG27和AGS細(xì)胞后克隆形成數(shù)統(tǒng)計對比(與DMSO組對比， ***P<0.001)

圖3 DHTS對人胃癌細(xì)胞凋亡的影響注：(A-B)DHTS 10 μmol對HCG27和AGS細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h流式細(xì)胞檢測凋亡細(xì)胞比例；(C-D)DHTS 10 μmol處理HCG27和AGS細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計比例(與DMSO組對比， ***P<0.001)。

圖4 DHST對HCG27和AGS細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響注：(A-B)DHTS 10 μmol對HCG27細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平和GSH/GSSG的比例的影響；(C-D)DHTS 10 μmol對AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平和GSH/GSSG的比例的影響(與Ctr組對比， **P<0.01， ***P<0.001；與DHTS組相比， #P<0.05)。

通過測定DHTS處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和還原型谷胱甘肽(GSH)/氧化二硫(GSSG)比值，檢測DHTS處理后的AGS細(xì)胞氧化應(yīng)激。結(jié)果表明，孵化2 h和4 h，DHTS處理(10 μmol)均能提高HCG27和AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平(P<0.05)，DHTS(10 μmol)加NAC(活性氧ROS阻斷劑)孵育2 h和4 h均能降低AGS細(xì)胞氧化應(yīng)激(P<0.05)，見圖4A、C所示；此外，此外，10 μmol的DHTS能抑制HCG27和AGS細(xì)胞中GSH/GSSG的比例，而NAC能逆轉(zhuǎn)對HCG27和AGS細(xì)胞中GSH/GSSG比例的抑制，見圖4B、D。

2.5 二氫丹參酮Ⅰ在AGS細(xì)胞中激活caspase- 3和caspase- 8活性

為了研究DHTS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，用熒光分析法研究了細(xì)胞凋亡相關(guān)的天冬氨酸半胱氨酸酶。與caspase- 9相比，用DHTS(10 μmol)處理HCG27和AGS細(xì)胞可提高caspase- 3和caspase- 8的活性，活性氧抑制劑NAC抑制了DHTS對AGS細(xì)胞caspase- 3和caspase- 8的激活，而DHTS處理HCG27和AGS細(xì)胞后對caspase- 9活性沒有的影響，見圖5。

圖5 DHTS對HCG27和AGS細(xì)胞caspace- 3、caspace- 8及caspace- 9酶活性的影響注：(A-C)檢測DHTS處理后的AGS細(xì)胞內(nèi)caspace- 3、caspace- 8以及caspace- 9的活性。(A-C)檢測DHTS處理后的HCG27細(xì)胞內(nèi)caspace- 3、caspace- 8以及caspace- 9的活性。 **P<0.01，實驗組和對應(yīng)對照組相比較； #P<0.05，與DHTS治療組相比。

2.6 二氫丹參酮Ⅰ對裸鼠胃癌腫瘤的抑制作用

采用HCG27細(xì)胞構(gòu)建裸鼠胃癌模型后，采用DHTS瘤內(nèi)注射干預(yù)小鼠瘤體，在干預(yù)21 d的過程中，與對照組相比，DHTS抑制小鼠腫瘤瘤體體積的增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖6A。兩組小鼠在干預(yù)后21 d的體質(zhì)量對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6B。其中DHTS干預(yù)的小鼠瘤體中，其腫瘤細(xì)胞Ki67的表達(dá)水平較對照組下降，而Caspase- 3和Caspase- 8的表達(dá)水平上升，見圖6C。

圖6 DHTS對HCG27胃癌小鼠模型腫瘤的抑制作用注：A DHTS和對照組兩組小鼠瘤體體積的對比；B DHTS和對照組兩組小鼠的體質(zhì)量對比；C 免疫組化檢測DHTS處理后的小鼠瘤體；Ki67、Caspace- 3和caspace- 8的表達(dá)水平； ***P<0.001；ns，P>0.05。

3 討 論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ是丹參的主要成分之一，并預(yù)測發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ能靶向胃癌的多個關(guān)鍵靶點。既往已經(jīng)有部分研究證實二氫丹參酮Ⅰ對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用，但其對胃癌的具體作用仍未明確。在本研究中，我們通過體內(nèi)外實驗證明了二氫丹參酮Ⅰ通過活性氧介導(dǎo)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

二氫丹參酮Ⅰ是丹參提取物之中的一種天然物，一種從傳統(tǒng)的亞洲功能性食品丹參中分離出來的天然化合物[7]。二氫丹參酮I分子量是278.30，分子結(jié)構(gòu)式是：C18H14O3，其二級質(zhì)譜碎片 m/z 261，246，233，218，205，190，179，169，141[8]。二氫丹參酮Ⅰ的結(jié)構(gòu)見圖1A所示。一直以來二氫丹參酮Ⅰ被廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病[4,9]，療效肯定。二氫丹參酮Ⅰ已被證明具有多種生物活性，包括抗炎活性[10]、化療增敏作用[2]、抗肝纖維化作用[11]等。最近幾年，二氫丹參酮Ⅰ被認(rèn)為還具有抑制各種腫瘤的作用，例如抑制肝癌細(xì)胞增殖[1]、抗宮頸癌[12]、抗乳腺癌[13]等。然而，其在胃癌的作用仍未完全明確。

活性氧(ROS)是由多種氧化還原代謝反應(yīng)產(chǎn)生的，在包括癌細(xì)胞凋亡在內(nèi)的許多生理和病理過程中起著重要作用。在本研究中我們看到，二氫丹參酮Ⅰ處理胃癌細(xì)胞HCG27 和 AGS后，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加(見圖4)。越來越多的證據(jù)表明活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與胃細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)[14]。在細(xì)胞凋亡過程中，活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致外線粒體膜通透化，導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中[15]。各種報道表明，ROS在細(xì)胞凋亡中起著中樞調(diào)節(jié)作用[16- 17]。近年來，研究表明ROS在細(xì)胞凋亡中起中心調(diào)節(jié)作用[16- 17]。此外，ROS也能通過調(diào)節(jié)磷酸化和活化MAPK途徑下調(diào)抗凋亡蛋白水平以及上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(凋亡)[16- 17]。我們的實驗研究表明ROS參與DHTS誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的定義首先由Elmore等學(xué)者提出的[18]。細(xì)胞凋亡被稱為程序性細(xì)胞死亡，可引起多種細(xì)胞變化，表現(xiàn)為細(xì)胞和細(xì)胞核的收縮，以及核染色質(zhì)的凝聚、膜泡和少核小體DNA碎片，主要特征表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、細(xì)胞膜出血、核和DNA碎裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[19]。一系列始于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的細(xì)胞信號調(diào)控凋亡，包括caspases和bcl- 2家族蛋白。線粒體通過多種凋亡蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如細(xì)胞色素c，其主要功能是控制細(xì)胞代謝和凋亡，以及誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)[20]。Caspases是一組半胱氨酸蛋白酶，以及caspases作為凋亡過程的主要執(zhí)行酶。我們的實驗展示了DHTS誘導(dǎo)caspase- 3和- 8活性顯著升高，caspase- 9活性則不明顯(見圖5和圖6C)，經(jīng)過DHTS處理的HCG27和AGS細(xì)胞的caspase- 3和- 8活性被NAC(一種活性氧的抑制劑)部分地抑制(見圖5)，這表明DHTS的促凋亡作用依賴于ROS。

裸鼠胃癌模型，采用DHTS瘤內(nèi)注射干預(yù)小鼠瘤體，在干預(yù)21 d的過程中，與對照組相比，DHTS顯著抑制小鼠腫瘤瘤體體積的增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖6A所示。結(jié)果表明DHTS能夠明顯抑制小鼠瘤體生長，但是兩組小鼠在干預(yù)后21 d的體質(zhì)量對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6B所示。其中DHTS干預(yù)的小鼠瘤體中，其腫瘤細(xì)胞Ki67的表達(dá)水平較對照組顯著下降，而Caspase- 3和Caspase- 8的表達(dá)水平明顯上升，這說明了DHTS抑制小鼠瘤體生長是通過誘導(dǎo)瘤體細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的。