基于nuc基因的奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌PCR檢測方法的建立

廖光華 代佳君 鄧鈺蓱 吳自豪 任 強 陳 偉,*

（1塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

（2塔里木大學動物科學學院/新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

奶牛乳腺炎是嚴重影響奶牛業(yè)健康發(fā)展的多發(fā)病之一。據(jù)報道，臨床型乳腺炎的平均發(fā)病率為33. 41%，隱性乳腺炎奶牛的平均每頭陽性率為73. 91%。病原菌的感染是引起牛乳房炎的主要原因，而傳染性病原菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡稱金葡菌）就是主要致病菌之一。金葡菌引起的奶牛乳腺炎，由于引發(fā)產奶量下降、奶品質降低、治療成本升高和高死亡率而導致巨大經濟損失［1,2］。因此，快速鑒定金葡菌可為治療奶牛臨床乳腺炎提供重要用藥依據(jù)。在分子生物學鑒定方法建立起來之前，人們用傳統(tǒng)的生化試驗完成細菌鑒定。但隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的生化試驗往往會因為操作的復雜性和操作過程中對試驗條件掌控的精準性，從而引起試驗結果出現(xiàn)偏差或者無法直接判斷［3］，并且同一種屬的不同菌株間性狀可能不同、同一菌株在重復實驗中的結果也可能不同，這導致相當高的誤判幾率［4,5］，且傳統(tǒng)鑒定結果隨著分子生物學技術的應用，有些菌種重新進行了分類，其分類地位發(fā)生了變化，更加顯示出傳統(tǒng)生化鑒定的缺點［5］。因此隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究者們提出了采用16S rRNA 基因序列分析這一分子生物學的鑒定方法，該方法較傳統(tǒng)意義上的生化鑒定更為準確。16S rRNA 擴增使用的引物是細菌的通用引物，擴增的序列是細菌高度保守的16S rRNA基因部分片段。由于擴增片段高度保守，因此擴增完成后還需要進行測序比對才能確定細菌的種類，不僅增加了細菌鑒定的成本，而且延長了細菌鑒定的時間。因此，針對金葡菌特有的基因擴增，可解決金葡菌PCR快速檢測的問題。

研究發(fā)現(xiàn)金葡菌含有nuc 基因，編碼的耐熱核酸酶( Thermostable nuclease, Thermonuclease，TNase) 不僅是金葡菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性［6,7］。同時有研究發(fā)現(xiàn)金葡菌nuc 基因有潛在增強其耐藥性的能力，加劇了公共安全用藥的緊張形勢［8］。因此，依賴于nuc基因的特異性，建立靈敏度高、特異性強的PCR 鑒定方法，可用于臨床快速鑒定金葡菌，為臨床用藥指導提供實驗依據(jù)。與此同時，該基因作為金葡菌的獨特毒力因子可為進一步研究金葡菌的耐藥性與毒素之間的關系提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

來自新疆巴州地區(qū)某奶牛場隨機選擇39 頭奶牛，每頭牛每個乳區(qū)10 ml 乳樣，共采集111 份乳樣，放入無菌試管中，保存于4℃冰盒中帶回實驗室，立即進行分離。金葡菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC 35984，以下簡稱表葡菌)、大腸桿菌（Escherichia coli，S17-1）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）及健康兔血由塔里木大學生命科學學院重點實驗室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器

Tris、SDS、EDTA、16S rRNA 擴增引物、nuc 基因擴增引物［9,10］（見表1）、dNTP、Easy Taq 酶、Easy Taq buffer，均購自上海生工生物工程有限公司；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購自Bio-Rad公司。

表1 引物名稱及序列

1.1.3 培養(yǎng)基

MSA 培養(yǎng)基（用于選擇性劃線分離培養(yǎng)金葡菌），MSB 培養(yǎng)基（用于選擇性增菌培養(yǎng)），LB 培養(yǎng)基（用于溶血試驗中兔血平皿的配制），MHA 培養(yǎng)基（OXOID,UK）

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離、鑒定與保存

從采集的乳樣中吸取100μL 乳樣分別加入到已進行高壓滅菌裝有5 ml MSB 培養(yǎng)基的試管中，并對其進行相應的編號后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-72 h 后，接種到MSA 培養(yǎng)基上，再次置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)18-24 h。挑取疑似葡萄球菌的優(yōu)勢菌落進行革蘭染色、鏡檢，確定為葡萄球菌后，進行甘油管-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生化試驗

1.2.2.1 觸酶試驗

一張潔凈的載玻片上少量3% H2O2，用接種環(huán)取少量的待檢細菌均勻涂抹于過3% H2O2液面之下，30 s 內觀察有無氣泡的產生。如果產生氣泡，則為陽性（+），反之則為陰性（-）［11］。試驗過程中同時在載玻片上做陽性對照（金葡菌ATCC 25923）和生理鹽水對照。

1.2.2.2 血漿凝固酶試驗

在潔凈的載玻片上滴加滅菌的生理鹽水1滴，用接種環(huán)挑取少量的細菌漂浮于生理鹽水中，然后滴加兔的血漿1滴，將其充分混勻，如果細菌凝集成塊，則為陽性（+）反之則為陰性（-）［11］。試驗過程中同時在載玻片上做陽性對照（金葡菌ATCC 25923）和生理鹽水對照。

1.2.2.3 溶血試驗

制備普通瓊脂（LB）培養(yǎng)基，置于高壓滅菌鍋121℃，20 min 滅菌后，冷卻至50℃左右，加入無菌的兔血，含量為5%即每95 ml 培養(yǎng)基加入5 ml 血液，充分混勻。將血瓊脂倒入滅好菌的平皿中至平皿凝固后將活化好的純化培養(yǎng)分離凍存的葡萄球菌接種到血平板上；置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h，觀察并記錄結果［11］。如果有溶血圈，則為陽性（+）反之則為陰性（-）。試驗過程中同時做陽性對照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.2.4 甘露醇發(fā)酵試驗

取甘油凍存的分離株接種于高鹽甘露醇瓊脂（MSA）培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24 h后觀察。如果菌落周圍由紅色變?yōu)辄S色則表示發(fā)酵甘露醇為陽性（+），未變?yōu)辄S色依舊為紅色則表示未發(fā)酵甘露醇為陰性（-）試驗過程中同時做陽性對照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.3 金葡菌16S rRNA及nuc基因鑒定

從通過鏡檢篩選為葡萄球菌的菌株中隨機選取50 株葡萄球菌進行16S rRNA 基因擴增測序和nuc 基因擴增，同時以非葡萄球菌的大腸桿菌和乳房鏈球菌、表葡菌ATCC35984和金葡菌ATCC25923作對照，并送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果經過GeneBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比對。本實驗采用50 μl 16S rRNA PCR 擴增體系：ddH2O(40. 7 μl）、Easy Taq 酶（0. 3 μl）、Easy Taq buffer（5 μl）、dNTP（1 μl）、引 物27F 及1492R 各1 μl。+1 min、55℃退火30 s、72℃延伸2 min、72℃總延伸10 min。同時采用相同的PCR 擴增體系用于nuc基因擴增，選用引物見表1。nuc 基因擴增程序：94℃預變性5 min、94℃變性1 min、55℃褪火30 s、72℃延伸1. 5 min、進行30個循環(huán)，72℃總延伸3.5 min。

2 結果與分析

2.1 金葡菌的分離鑒定

從所采的111 份奶牛乳樣品中分離出205 株疑似葡萄球菌菌株，經生化試驗鑒定得到金葡菌98株，分離率達到47. 8%。205 株細菌生化試驗結果統(tǒng)計如表2所示。

2.2 16S rRNA及nuc基因序列分析

根據(jù)鏡檢結果，從中隨機選取了50 株葡萄球菌進行16S rRNA 基因的擴增與測序，同時進行nuc 基因PCR 檢測，以金葡菌ATCC 25923、表葡菌ATCC 35984、乳房鏈球菌、大腸桿菌S17-1 進行nuc 基因PCR 擴增。結果表明，其中有40 株能擴增出單一的約279 bp nuc基因條帶的葡萄球菌菌株，其16S rRNA基因測序比對結果均為金葡菌。而10株未擴增出單一目的條帶的葡萄球菌，其16S rRNA 基因測序比對結果均不是金葡菌，分別為溶血性葡萄球菌（6 株）、腐生葡萄球菌（3株）和解淀粉葡萄球菌（1株）。通過對擴增的279 bp nuc 基因進行克隆測序比對，均為金葡菌nuc 基因片段，且同源性為100%。作為對照菌株的表葡菌ATCC 35984 擴增出兩條條帶，一條大于279 bp，另一條小于279 bp（見圖1）。乳房鏈球菌擴增出多條不同大小的雜亂條帶，而大腸桿菌沒有擴增出任何條帶。上述結果表明nuc 基因具有高度特異性，通過對nuc基因擴增即可鑒定金葡菌。

表2 205株細菌生化試驗結果統(tǒng)計

圖1 nuc基因電泳圖

3 結論與討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展, 通過細菌保守序列PCR 擴增來確定其種類的方法被越來越多的應用于病原微生物的分離鑒定。本實驗采用高鹽甘露醇培養(yǎng)法，篩選出205株葡萄球菌。為建立一種更快速高效的分子生物學鑒定方法，隨機選取50 株葡萄球菌，采用16S rRNA 擴增測序和nuc 基因擴增以鑒定細菌的種類。結果顯示，其中16S rRNA 擴增測序結果為金葡菌的40株菌，均擴增出清晰的、與預期片段大小相符合的nuc 基因。而未擴增出清晰的、與預期片段大小相符合的nuc 基因的10 株菌均為非金葡菌。同時用已知的表葡菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌作對照，前兩者擴增出多條非目的條帶，而大腸桿菌未擴增出任何條帶。進一步表明nuc 基因的特異性擴增不僅可區(qū)別革蘭陽性菌的葡萄球菌屬和革蘭陰性菌的大腸桿菌屬，也可區(qū)別同屬革蘭陽性菌的葡萄球菌和鏈球菌，更可區(qū)別同屬葡萄球菌屬的金葡菌與表葡菌，從而實現(xiàn)特異性擴增來快速鑒定金葡菌。這一結果表明，依賴金葡菌nuc基因的PCR 擴增具有高特異性、高效性的特點，可作為金葡菌特異性檢測的分子生物學方法。在本實驗中，為了確定金葡菌nuc 基因PCR 擴增的特異性，我們還結合了16S rRNA 基因測序方法，以確定本實驗建立的方法是否準確。結果表明凡是擴增出單一279 bp 條帶的菌株，其16S rRNA 基因測序結果均為金葡菌。而非金葡菌要么無法擴增出任何條帶，要么擴增出的條帶不是預期大小，我們能從電泳圖上很清楚地判斷出來。16S rRNA 基因序列分析在菌種鑒定中是一種有效的方法，但這種方法分析的是細菌高度保守序列，常用于分析不同原核生物間的親緣關系［12］，但與金葡菌nuc 基因檢測靶點的鑒定方法相比區(qū)分度較低［13］。而nuc基因是金葡菌特有的毒力基因，其他非金葡菌菌種不含該基因，所以可以作為特定的靶標基因用于金葡菌鑒定。因此，nuc 基因為金葡菌的鑒定提供了更有價值的方法，同時因不需要測序，則大大縮短了細菌鑒定的時間和成本，為及時臨床用藥治療提供了保障［14］。同時有研究發(fā)現(xiàn)，該基因有潛在增強金葡菌耐藥性的能力，可影響公共衛(wèi)生安全［8］。利用nuc 基因高度特異性的特點，不僅建立了一種特異性強、靈敏度高的金葡菌快速鑒定方法，同時對進一步研究nuc 基因在奶牛乳房炎發(fā)生發(fā)展中的作用也有一定的意義。