子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞的研究進展

王賽璐 何金英 馬玉珍

子宮宮腔表面的內(nèi)膜呈現(xiàn)激素依賴性、規(guī)律性改變，具有高度再生能力，在育齡女性體內(nèi)隨月經(jīng)周期不斷生長、分化、蛻膜化和脫落[1]。為系統(tǒng)地了解內(nèi)膜生理及病理學(xué)特征，學(xué)者們以干細(xì)胞(stem cells，SCs)為切入點進行了大量的實驗研究。至今，部分學(xué)者已從多種實驗動物子宮內(nèi)膜中分離出幾種可能的干/祖細(xì)胞，其中包括近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞(endometrial side population cells，ESPCs)[2]，并對其在內(nèi)膜中的分布、生長條件、來源、多向分化潛能以及對內(nèi)膜的重建作用等進行了詳細(xì)探究。本文就ESPCs的生物學(xué)特性及功能、相關(guān)研究進展和亟待解決的問題進行綜述。

一、子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

子宮的宮腔表面被覆子宮內(nèi)膜，是一種激素依賴性、規(guī)律性再生的組織，隨月經(jīng)周期不斷地生長、分化、蛻膜化和脫落，就未經(jīng)妊娠的育齡期女性而言，會歷經(jīng)約480次的周期性變化，并且這種現(xiàn)象也可出現(xiàn)于用雌激素治療的絕經(jīng)女性[1]。內(nèi)膜包括功能層和基底層，功能層又可細(xì)分為致密層和海綿層，功能層在月經(jīng)期可全部或部分脫落，基底層較薄且存在于整個月經(jīng)周期，在月經(jīng)周期的第5～6天，增生期的內(nèi)膜腺體和間質(zhì)開始從基底層再生，從而形成一個厚度為5～7 mm新的功能層[3]。根據(jù)子宮內(nèi)膜高度再生的特性，有學(xué)者提出人類子宮內(nèi)膜可能存在SCs，從而使得內(nèi)膜得以周期性更新[4]。2004年，Chan等人從內(nèi)膜分離出子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，ENSCs)。然而，這些細(xì)胞的解剖學(xué)部位和生物學(xué)功能尚未完全明確，ENSCs在體內(nèi)外分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的作用機制尚不清楚[5]。盡管ENSCs亞群研究較多，但是關(guān)于內(nèi)膜中何種細(xì)胞種群可行使干/祖細(xì)胞功能目前尚無達(dá)到共識。鑒于對多種動物(人類、靈長類、嚙齒類、豬、牛、綿羊、山羊，母馬)的實驗探索，Lara等提出ENSCs可能包括以下幾種類型干細(xì)胞：內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrium mesenchymal stem cell，eMSCs)、上皮干細(xì)胞、ESPCs、子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞等[3]。

二、側(cè)群細(xì)胞

1.側(cè)群細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)：1996年，Goodwell等人在用流式細(xì)胞分選術(shù)(fluorescene-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)對Hoechst33342染色的小鼠骨髓細(xì)胞進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)了在造血SCs中有小部分細(xì)胞只含有極少量熒光，將其命名為側(cè)群細(xì)胞[6]。隨后，Matsuzaki證實骨髓中的側(cè)群細(xì)胞(side population cells，SPCs)能夠長期重建致死劑量輻射小鼠的造血系統(tǒng)[7]。除嚙齒類動物外，還分別從人類、恒河猴及犬類的骨髓SCs中成功分離SPCs[8-11]。從2001年起，Zhou等對SPCs染料低著色原因進行了探索，發(fā)現(xiàn)一種SPCs表面的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運體：ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白G2(ATP-binding cassette transporter G2/breast cancer resistance protein1,ABCG2/BCRP1)，可在分子泵的作用下將胞內(nèi)的熒光染料通過主動運輸排出胞外[12-13]。盡管Hoechst染料也可在非紫外波長的光照下顯色，如藍(lán)光(450/50 nm濾波器)和紅光(675/20 nm濾波器)[14]，但是紫外光照下分辨效果最佳[15]。大量研究人員已從多種哺乳動物的多個組織器官中成功分離SPCs，包括骨髓、大腦、角膜、視網(wǎng)膜、乳腺、肝臟、腎臟、睪丸、皮膚、骨骼肌、心臟、肺臟、子宮等[16-18]，并且于正常和腫瘤組織均有發(fā)現(xiàn)[8]。

2. ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白：對Hoechst染料作用的ABC家族屬于轉(zhuǎn)運蛋白超家族，主要包括以下幾種：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體B1、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體C5和ABCG2(BRCP1)[14]。維拉帕米[13]和利血平[19]可抑制其活性。此類蛋白與ATP結(jié)合，可轉(zhuǎn)運多種內(nèi)源性及外源性化合物，如葉酸、膽固醇、卟啉等，發(fā)揮促進細(xì)胞自主調(diào)節(jié)、鐵代謝等作用[14]，同時，因癌性SPCs表面的ABCG2可快速清除細(xì)胞質(zhì)中的化療藥物，考慮認(rèn)為其與癌癥對化療藥物的耐藥性相關(guān)[20]。但是Challen 等人的研究表明：ABCG2并非SPCs的表面標(biāo)記物，僅僅為此類細(xì)胞活動的標(biāo)志[21]。

三、子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞

1.側(cè)群細(xì)胞在子宮的分布、含量及影響因素：2004年，Chan等從人體子宮內(nèi)膜細(xì)胞中分離出ESPCs[5]，因腺體和間質(zhì)形成是從基底層再生而來，推測ESPCs可能主要位于基底層。然而，Cervello[16]等人對ABCG2進行免疫組化染色觀察，發(fā)現(xiàn)功能層和基底層的結(jié)果均呈陽性，考慮可能是ESPCs由基底層遷移至功能層發(fā)揮作用所致。2007年，Ono及同事以嚙齒類動物子宮肌層為原料，成功提取SPCs[22]。但是，因內(nèi)膜和肌層之間表面缺少中間組織，并且內(nèi)膜和肌層接觸面均呈鋸齒狀，故基底層常侵及肌層[1,17]，據(jù)此，不排除侵入肌層的內(nèi)膜組織含有包括ESPCs在內(nèi)的子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的可能性。

Miyazaki在提取ESPCs時，發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞在所有子宮內(nèi)膜細(xì)胞中占(3.13%±0.61%)[19]。其后，Kato在對人體內(nèi)膜分選的間質(zhì)細(xì)胞進行研究時，報道月經(jīng)期ESPCs比例顯著高于增生期和分泌期[4]。2008年，Tsuji等人對人類內(nèi)膜細(xì)胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)增生期ESPCs數(shù)量明顯高于分泌期[23]。而在Masuda團隊的研究中，他們將人類內(nèi)膜組織按發(fā)育階段分為4類：增生早期(包括月經(jīng)期)、增生晚期、分泌早期和分泌晚期，表明增生早期ESPCs比例最高，到分泌晚期降至最低[24]。不容忽視的是，Cervello[16]研究發(fā)現(xiàn)ESPCs在上皮和間質(zhì)部分的比例分別為0.06%～6.20%和0.01%～3.80%，并且證實了這個比例在女性整個生育年限以及用性激素治療的絕經(jīng)婦女體內(nèi)保持穩(wěn)定。

Hyodo等人注射脂多糖制作BALB/c小鼠內(nèi)膜受損模型時，發(fā)現(xiàn)模型小鼠的ESPCs數(shù)量增加，而且這種情況只有在單獨進行雌二醇宮腔植入時發(fā)生，若單獨使用黃體酮或二者聯(lián)合作用均不能觀察到這種變化[25]。近年，有學(xué)者證實向免疫缺陷小鼠制作的子宮平滑肌瘤模型體內(nèi)同時注射雌二醇及黃體酮，可通過旁分泌途徑激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，作用于瘤體，致使包括SPCs在內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量的增加[26]。

2.子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞來源：多數(shù)ABCG2+細(xì)胞表達(dá)CD31，優(yōu)先定位于毛細(xì)血管，而非大血管[27]。同樣，eMSCs樣細(xì)胞分布在血管網(wǎng)周圍[16]。因此，ABCG2+細(xì)胞與eMSCs樣細(xì)胞分布位置的相似性，表明作為一種至今尚未認(rèn)證的ENSCs，ESPCs可能和eMSCs高度相關(guān)，推測ESPCs可能最初起源于骨髓[27]。之后的研究也證實骨髓來源的細(xì)胞可遷移至小鼠和人類子宮內(nèi)膜，促進組織中的血管再生[16]?？偟膩碚f，上述研究結(jié)論均支持ESPCs最初來源于骨髓的觀點，可以解釋ABCGs+細(xì)胞彌漫分布于子宮內(nèi)膜的現(xiàn)象。但是，也有研究顯示接受男性骨髓移植的女性子宮內(nèi)膜中的ESPCs不包含異性來源的細(xì)胞[16]，該結(jié)論與上述觀點相悖。因此，仍需對ESPCs的來源進行深入研究。

3.子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞特性：因為Hoechst染色時間的長短和溫度的高低對分離細(xì)胞效果均有影響[28]，Kato[4]在提取ESPCs時以不同條件篩選細(xì)胞，結(jié)果表明50 μM Hoechst、染色90 min所得ESPCs數(shù)量最多；同時發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞可分裂生成子代小圓細(xì)胞，大部分表型為CD9-及CD13-[5]。Cervello[16]用膠原酶消化增生期內(nèi)膜后，利用免疫磁珠法(magnetic cell sorting，MACS)依次分離了上皮和間質(zhì)部分表面同時布標(biāo)到CD9及CD13的細(xì)胞，其占比高于FACS所得數(shù)據(jù)，考慮可能與Hoechst染色后10%左右的活性細(xì)胞死亡有關(guān)，但FACS分離所得的純度更高。

有研究表明，c-kit在ESPCs和非ESPCs(non-endometrium side population cells，NESPCs)中同時表達(dá)。除此之外，70%上皮部分ESPCs以及80%間質(zhì)部分ESPCs表現(xiàn)為CD90+，CD34+僅占1%～2%，CD45+占5%～7%，CD105+占4%，這些數(shù)據(jù)提示兩類組織中的ESPCs均具有間葉表型[5]，說明ESPCs具有間葉組織來源特性。另外，子宮內(nèi)膜中僅15%～17%的SP細(xì)胞可在蛋白水平檢測出BCRP1；該研究同時說明ESPCs具有端粒酶活性，且相較于內(nèi)膜多能和單能SCs而言，端粒長度處于中等水平[16]。

雌激素受體(estrogen receptor，ER)ɑ和β在ESPCs和NSPCs中差異表達(dá)，實驗結(jié)果表明ESPCs表達(dá)ERβ+；NSPCs表達(dá)ERɑ以及孕激素受體(progesterone receptor，PR)[17]，提示雌激素可通過直接對ESPCs或者通過對其生態(tài)位作用從而影響ESPCs的性質(zhì)，間接解釋雌激素作用對ESPCs數(shù)量產(chǎn)生的影響。

4.子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞的生長條件：2004年，Chan等人發(fā)現(xiàn)低氧條件下上皮部分和間質(zhì)部分ESPCs的克隆效率分別是常氧條件下的6.5和3.1倍[5]。在低氧環(huán)境中，間質(zhì)部分ESPCs克隆形成率相對于NESPCs顯著增高；上皮部分二者差別不大[16]。

Kato團隊在實驗過程中，將上皮和間質(zhì)部分的ESPCs和NESPCs均分別置于兩種條件中進行培養(yǎng)：(1)含有 IL-6、促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)和10% FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)膠原涂層培養(yǎng)皿，(2)為主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros，AGM)間質(zhì)細(xì)胞來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)體系中的SPCs均增殖緩慢，且100 μg/mL 絲裂霉素C可抑制細(xì)胞的分裂增殖[4]。該學(xué)者將MACS分離所得表面同時不表達(dá)CD9及CD13的細(xì)胞同時胞置于第一種培養(yǎng)基進行體外增殖，發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞生長也較為緩慢[4]，但NESPCs的增殖能力要強于ESPCs[23-24]。事實上，將ESPCs與NESPCs聯(lián)合培養(yǎng)可提高其克隆效率，說明NESPCs可能為ESPCs生長增殖提供了所必須的微環(huán)境[19]。

有研究顯示經(jīng)過長達(dá)9個月的追蹤觀察后，發(fā)現(xiàn)針對上皮部分的ESPCs而言，飼養(yǎng)層細(xì)胞中的細(xì)胞在3個月左右可形成細(xì)胞群落，此后每代的細(xì)胞群落直徑相似；上皮和間質(zhì)部分的NESPCs在培養(yǎng)過程中形態(tài)逐漸扁平，最終在3個月內(nèi)衰亡[4]，這充分顯示了ESPCs的長期增殖能力。

5.子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞的多向分化潛能：有研究在體外成功誘導(dǎo)CD9+和CD13+的ESPCs分化過程中發(fā)現(xiàn)CD9和CD13的表達(dá)量有所降低，且與培養(yǎng)時間長短無關(guān)，同時能將該類細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成纖維樣細(xì)胞(CD13+)[4,17]。Tsuji在體外培養(yǎng)時添加雌二醇和黃體酮，發(fā)現(xiàn)ESPCs可出現(xiàn)類似于分泌期間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能變化，同時發(fā)生蛻膜樣變[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)ESPCs可分化形成中胚層譜系細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞[17]。這些結(jié)論均說明ESPCs細(xì)胞具有多向分化潛能，可能是子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)的干/祖細(xì)胞。

此外，通過異體移植研究發(fā)現(xiàn)ESPCs在體內(nèi)亦具有促進組織再生能力。2010年，Masuda等人將ESPCs植入免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的腎包膜后，可以使小鼠體內(nèi)包含腺體結(jié)構(gòu)的內(nèi)膜樣組織再生。然而，只有8%的ESPCs異體移植的小鼠重建了結(jié)構(gòu)完好的內(nèi)膜腺體樣組織[24]，說明ESPCs重建需要一個由其它內(nèi)膜細(xì)胞成分提供適合其生長的微環(huán)境。

基于上述研究，Miyazaki等人用慢病毒介導(dǎo)TdTom(tdTmomato)熒光感染人體內(nèi)膜ESPCs或者NESPCs，分別將兩種細(xì)胞移植至NOG小鼠腎包膜，發(fā)現(xiàn)二者均可促進內(nèi)膜樣組織再生，但是ESPCs的重建率≤10%，這與之前的研究結(jié)果一致。隨后，又將TdTom+ESPCs與分散的內(nèi)膜細(xì)胞混合，向小鼠腎包膜植入混合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜組織重建率100%，并且TdTom+ESPCs主要存在于重建組織中，研究結(jié)果說明內(nèi)膜細(xì)胞可促進ESPCs對子宮內(nèi)膜的重建作用[19]，與Masuda[24]等人認(rèn)為內(nèi)膜細(xì)胞可能為ESPCs生長提供適合的微環(huán)境結(jié)論一致。進一步對移植部位生成的囊性腫物進行HE染色，結(jié)果顯示腫物內(nèi)具有輪廓清晰的腺b體和間質(zhì)，Vim抗體檢測結(jié)果陽性，表明腫物由ESPCs形成。而且，將TdTom+ESPCs和內(nèi)膜細(xì)胞混合物植入小鼠體內(nèi)后，部分腺體主要由TdTom+細(xì)胞組成，但是其余腺體由TdTom+細(xì)胞和TdTom-細(xì)胞同時組成，表明ESPCs和混合的內(nèi)膜細(xì)胞均參與了腺體的再生[19]。但已有研究證實人類子宮內(nèi)膜的每一個腺體都是單克隆源性的，故可推測內(nèi)膜細(xì)胞中未經(jīng)標(biāo)記的ESPCs和TdTom+ESPCs可能隨機參與腺體形成，因此導(dǎo)致了“雜交的”或者“鑲嵌的”腺體形成[29]，故單一腺體是否為單克隆源性有待進一步研究。

對TdTom標(biāo)記的ESPCs和NESPCs進行波形蛋白(vimentin，Vim，間質(zhì)標(biāo)志物)、角蛋白(cytokeratin，CK，上皮標(biāo)志物)、 ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-smooth muscle actin，ɑ-SMA，平滑肌標(biāo)志物)、CD10、CD326、CD31的檢測。結(jié)果表明，CD326+(上皮標(biāo)志物)和CD10+(間質(zhì)標(biāo)志物)細(xì)胞比例在ESPCs和NESPCs所形成內(nèi)膜組織中并無明顯不同。相較于NESPCs，Vim+、CK+和CD31+細(xì)胞在ESPCs在重建的內(nèi)膜組織中含量更豐富，間接說明了ESPCs可進行多向分化，對子宮內(nèi)膜重建的作用更明顯，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)ESPCs主要參與了上皮組織的重建，推測ESPCs可能含有更高比例的干/祖細(xì)胞，可以分化形成不同的內(nèi)膜成分。但ɑ-SMA+ESPCs和NESPCs數(shù)量無差異[19]。ESPCs對于內(nèi)皮細(xì)胞形成的作用要大于NESPCs，然而，CD31+和CD34+細(xì)胞，并不一定是已經(jīng)分化良好的內(nèi)皮細(xì)胞，也可能是內(nèi)皮祖細(xì)胞[30]。W5C5+細(xì)胞在二者中無差異，表面同時表達(dá)CD140b和CD146的細(xì)胞在ESPCs重建組織含量較高[19]?？偟膩碚f，ESPCs和NESPCs相似的表面標(biāo)記物陽性的細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和eMSCs在ESPCs中相較于NESPCs更為豐富。

Kato開展的體外研究發(fā)現(xiàn)上皮部分來源的ESPCs也可形成腺體樣結(jié)構(gòu)，但間質(zhì)部分ESPCs只能形成少數(shù)短軸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群，并非腺體樣結(jié)構(gòu)[4]。說明ESPCs在體內(nèi)外均可形成腺體樣結(jié)構(gòu)。

四、小結(jié)

盡管已對可能的多個種群干細(xì)胞進行了大量研究，但是關(guān)于內(nèi)膜中何種細(xì)胞亞群可行使干/祖細(xì)胞功能目前尚未達(dá)成共識，包括ESPCs在內(nèi)的ENSCs的解剖學(xué)部位、生物學(xué)特性及功能尚未完全明確。也還沒有證據(jù)表明ESPCs可以在單細(xì)胞水平形成不同種祖細(xì)胞來源的干細(xì)胞[1]。由此可知，ESPCs的生物學(xué)特性和多向分化潛能在單細(xì)胞水平還需要進一步探討。但是，人類子宮內(nèi)膜的動態(tài)性變化致使在研究時需要根據(jù)月經(jīng)周期將組織分期進行檢測，目前內(nèi)膜細(xì)胞的分離方法也使得各部分ESPCs分選較為困難，間質(zhì)部分可摻入不同比例的上皮細(xì)胞，反之亦然；并且，采用FACS分選ESPCs，需要做長期的細(xì)胞準(zhǔn)備工作，過程較為繁瑣，且Hoechst染料染色時間的長短、環(huán)境溫度對FACS分選結(jié)果均有影響。因此，必須在已有分選方式的基礎(chǔ)上，不斷探索新方法分離純化細(xì)胞。

保持子宮內(nèi)膜正常的生理結(jié)構(gòu)是女性生殖的基礎(chǔ)，損傷后的修復(fù)功能就顯得至關(guān)重要，因此發(fā)展包括ESPCs在內(nèi)的SCs療法，將其應(yīng)用于宮腔粘連和薄型子宮內(nèi)膜的治療具有重要的意義。