纖維素酶法輔助提取火棘果多糖的工藝研究

李彬，張薇

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

火棘果（Pyracantha fortuneana（maxim）Li），又稱救軍糧，水杈子。薔薇科，常綠灌木，是一種可藥可食可觀賞的多用途花果植物，以果實(shí)、根、葉入藥，性平，味甘、酸，葉能清熱解毒，外敷治瘡瘍腫毒，是一種極好的春季看花、冬季觀果植物。研究表明火棘果中含有的功能性成分主要有黃酮、多酚、多糖、色素等，具有預(yù)防腫瘤、保護(hù)心肌、降血脂、改善脂蛋白、消食健脾等作用[1-3]。目前對火棘果的研究主要集中在紅色素、黃酮、果膠的提取、分離純化和保健作用等方面，對火棘果多糖提取的研究較少。多糖作為重要的生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[4]。鑒于此，本研究采用纖維素酶輔助提取火棘果中多糖類物質(zhì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)通過對料液比、酶濃度、酶解溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等條件對多糖類物質(zhì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以確定火棘果中多糖提取的最優(yōu)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

火棘果（2018 年12 月采自商洛市商州區(qū)）。

1.1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；纖維素酶（酶活力＞30 u·mg-1）；石油醚、鹽酸（20%）、活性炭、氯仿、正丁醇、苯酚（重精餾）、濃硫酸、無水乙醇、95%乙醇、無水乙醚等（以上藥品均為分析純或生化試劑）。

1.1.3 儀器

干燥箱、高速粉碎機(jī)、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

將采集的火棘果清洗干凈后晾干，于60 ℃干燥48 h 至恒重，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過60 目篩，棕色瓶中密封冷藏備用。

1.2.2 粗多糖的提取

將適量火棘果粉末加入適量石油醚（70 ℃～90 ℃）回流脫脂2 次，回收石油醚。準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，加入一定體積的蒸餾水，按一定的提取條件（料液比、酶濃度、酶解溫度、酶解時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、緩沖液pH 等）進(jìn)行浸提，待反應(yīng)結(jié)束后立即在沸水浴中滅活10 min，經(jīng) 4 000 r·min-1，離心 20 min 后棄去沉淀，待提取液冷卻后用Sevag 法去除蛋白，活性炭吸附法去除色素，加入5 倍體積95%乙醇沉淀，于4 ℃靜置過夜。將醇沉液于4 000 r·min-1，離心10 min，取沉淀物，依次用無水乙醇、無水乙醚洗滌2～3次，干燥后即得火棘果粗多糖[7]。

1.2.3 火棘果多糖含量的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以0.25 mg·mL-1葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量。以蒸餾水為空白參比，在490 nm 處測定其吸光度（重復(fù)3 次，取其平均值），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

2）火棘果粗多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取樣品粗多糖，加水溶解后定容于10 mL 容量瓶中，搖勻，吸取1 mL 溶液于具塞試管中，采用苯酚-硫酸法測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算多糖提取率的公式為[9]：

式中：C——樣品提取多糖濃度，mg·mL-1；

V——提取液的體積，mL；

N——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

m——火棘果樣品重量，g。

1.2.4 主要工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)

1）料液比對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，調(diào)整溶液pH 為4.0，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，纖維素酶濃度為0.6%，于50 ℃恒溫水浴中浸提120 min。分別考察料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

2）酶濃度對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，調(diào)整溶液pH 為4.0，在料液比1:15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，于50 ℃恒溫水浴中浸提120 min。分別考察酶濃度為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

3）酶解溫度對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2的方法，調(diào)整溶液pH 為4.0，在料液比為1:15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，纖維素酶濃度為0.6%，于不同溫度恒溫水浴中浸提120 min。分別考察酶解溫度為 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

4）酶解時間對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2的方法，調(diào)整溶液pH 為4.0，在料液比為1:15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，纖維素酶濃度為0.6%，于50 ℃恒溫水浴中浸提不同時間。分別考察酶解時間為30、60、90、120、150、180 min 時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

5）乙醇體積分?jǐn)?shù)對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，調(diào)整溶液pH 為4.0，在料液比為1:15，纖維素酶濃度為0.6%，于50 ℃恒溫水浴中浸提120 min。分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85%、90%時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

6）緩沖液pH 對火棘果多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取回流后的火棘果粉末2.0 g，按照1.2.2 的方法，在料液比為1:15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，纖維素酶濃度為0.6%，于50 ℃恒溫水浴中浸提120 min。在 pH3.0～5.0 纖維素酶具有較強(qiáng)的活力，分別考察緩沖液pH 為3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2 時其對火棘果多糖提取率的影響，測定樣品的吸光度并計(jì)算多糖的提取率[10-11]。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在主要工藝參數(shù)對火棘果多糖提取率的影響基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，選取具有顯著影響的工藝參數(shù)進(jìn)行正交優(yōu)化，以確定火棘果多糖提取的最優(yōu)工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果見圖1，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程是y=9.3643x-0.012，R2=0.9979。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 主要工藝參數(shù)對多糖提取率的影響

2.2.1 料液比對火棘果多糖提取率的影響

由圖2 分析可知，隨著料液比的增加，多糖提取率呈先增高后降低的趨勢，料液比為1:15時達(dá)到最大值。這可能是由于料液比在較低時，多糖不能很好的洗脫；當(dāng)料液比增大時，由于酶對細(xì)胞壁的充分反應(yīng)使物料滲透性加大，促進(jìn)多糖溶出，利于多糖的充分提?。焕^續(xù)增大料液比，會稀釋料液中酶的濃度，過多溶劑會使物料分子相互作用減弱，降低溶出速度，也不利于醇沉工藝操作[12]。綜合考慮提取率和能耗，選擇料液比1:10～1:20 為較佳。

2.2.2 酶濃度對火棘果多糖提取率的影響

由圖3 分析可知，隨著酶濃度的增大，多糖提取率呈先增高后稍微降低的趨勢，其原因是酶濃度低時，火棘果細(xì)胞壁酶解不完全，多糖物質(zhì)溶出較少；當(dāng)酶濃度最佳時，酶解反應(yīng)較徹底，此時多糖溶出最多；酶濃度過高時，酶與底物的接觸面積過剩，使反應(yīng)速率降低，多糖溶出會降低，且增加了成本[13]?？紤]提取率及節(jié)約酶用量，酶濃度0.5%～0.7%為火棘果多糖提取的較佳濃度。

圖2 料液比對火棘果多糖提取率的影響

圖3 酶濃度對火棘果多糖提取率的影響

2.2.3 酶解溫度對火棘果多糖提取率的影響

由圖4 分析可知，隨著酶解溫度的不斷增加，多糖取率呈先增高后降低的趨勢，在50 ℃時，提取率達(dá)到最高，隨后提取率降低。其原因是溫度高于酶催化所需要的最適溫度，過高的溫度導(dǎo)致酶活力降低或使部分酶失活[14]，造成提取率降低。溫度在45 ℃～55 ℃為火棘果多糖提取的較佳溫度。

圖4 酶解溫度對火棘果多糖提取率的影響

2.2.4 酶解時間對火棘果多糖提取率的影響

由圖5 分析可知，隨著酶解時間的不斷增加，多糖提取率呈先增高后降低的趨勢，酶解時間為120 min 時，提取率達(dá)到最高。這可能是隨酶解時間的增加，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被完全破壞，提取反應(yīng)越完全，多糖提取率不斷增高。但隨著提取時間太長，則造成多糖的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化或降解[15]，從而降低了多糖的提取率。確定浸提時間在120 min火棘果多糖提取率最佳。

圖5 酶解時間對火棘果多糖提取率的影響

2.2.5 乙醇體積對火棘果多糖提取率的影響

由圖6 分析可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多糖提取率呈先增高后降低的趨勢。多糖的沉淀主要是因?yàn)榧尤胍掖?，可降低水溶液的介電常?shù)，使多糖脫水而沉淀。在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%～80%的范圍之間，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，沉淀現(xiàn)象越明顯，沉淀所用時間也相應(yīng)縮短。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%后，提取率反而逐漸降低，這是因?yàn)橐掖剂吭黾拥耐瑫r，也使體系總?cè)芤毫吭黾?，從而稀釋了體系中目標(biāo)物濃度，不利于多糖沉淀[15]，故乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%～85%火棘果多糖提取率較佳。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響

2.2.6 緩沖液pH 對火棘果多糖提取率的影響

由圖7 分析可知，隨著緩沖液pH 的增大，火棘果多糖提取率呈先增高后降低的趨勢，緩沖液pH 為4 時，多糖的提取率達(dá)到最大值。酶與最適pH 值偏離較小時，酶變性程度低，但酶活性部位的基團(tuán)離子會發(fā)生改變，使酶活力降低；酶與最適pH 值偏離較大時，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的共價鍵受到干擾，使酶蛋白自身變性[10]。緩沖液pH 超出纖維素酶的最適pH 范圍，使纖維素酶活性喪失，導(dǎo)致火棘果多糖提取率降低。故確定緩沖液pH 為4 時火棘果多糖提取率最佳。

圖7 緩沖液pH 對火棘果多糖提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)主要工藝參數(shù)對多糖提取率的影響結(jié)果，選擇對多糖提取率影響較顯著的因素（ρ≥1.5%）如料液比、酶濃度、酶解溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等4 個因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化，并確定酶解時間為120 min，緩沖液pH 為4。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析見表3。

2.3.1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1、表2 和表3 可知，影響火棘果多糖提取率的因素依次為A＞B＞D＞C，即料液比＞酶濃度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞酶解溫度。正交試驗(yàn)分析確定最佳工藝條件為A2B2C2D2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

因?yàn)檎辉囼?yàn)分析的優(yōu)組合A2B2C2D2與正交試驗(yàn)中最佳組合A2B2C3D1不一致，故進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

表4 火棘果多糖提取驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，在A2B2C2D2條件下多糖提取率高于A2B2C3D1條件下，因此正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合A2B2C2D2符合實(shí)際。即纖維素酶法輔助提取火棘果多糖的最佳工藝參數(shù)為：料液比1:15、纖維素酶濃度0.6%、酶解溫度50 ℃、酶解時間120 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、緩沖液pH 為4.0，火棘果多糖的提取率為5.35%。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)主要工藝參數(shù)對多糖提取率的影響試驗(yàn)表明，在料液比為1:15～1:20，酶濃度為0.5%～0.7%，酶解溫度為 45 ℃～55 ℃，酶解時間為 90～150 min，緩沖液為 pH 3.6～4.4，火棘果多糖的提取率均達(dá)到較大值。料液比、酶濃度、酶解溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖的提取率有明顯影響，而酶解時間和緩沖液pH 的影響相對較小。本研究正交試驗(yàn)表明，纖維素酶法輔助提取火棘果多糖的最佳提取工藝條件為A2B2C2D2。即料液比1:15、纖維素酶濃度0.6%、酶解溫度50 ℃、酶解時間120 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、緩沖液pH 為4.0，火棘果多糖的提取率為5.35%。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時需要考慮的影響因素較多，未涉及到原料的粒度和提取級數(shù)對火棘果多糖提取率的影響，應(yīng)在后續(xù)研究中予以關(guān)注。酶法輔助提取火棘果多糖較一般傳統(tǒng)提取技術(shù)有節(jié)省能源、省工、省時、對環(huán)境污染低等優(yōu)點(diǎn)，但大規(guī)模用于工業(yè)生產(chǎn)還需要進(jìn)一步解決提取條件的精確控制等方面問題[16]。另外，采取多種酶聯(lián)合使用，或者聯(lián)合微波處理或超聲處理對火棘果多糖的提取能否更有效地提高提取率，有待進(jìn)一步深入研究。