組織工程人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

趙文強(qiáng) ，溫樹正 ，郝增濤 ，殷超 ，張國榮

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 手足顯微外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

周圍神經(jīng)損傷是一種比較常見的臨床問題，并將不同程度影響患者的生活質(zhì)量。周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的治療策略在臨床研究中受到了很多關(guān)注，周圍神經(jīng)損傷后傳統(tǒng)的修復(fù)方法效果往往并不令人滿意，在臨床上應(yīng)用最廣泛的修復(fù)方式是以自體神經(jīng)移植為主。但自體神經(jīng)移植存在供區(qū)感覺功能缺失、自體神經(jīng)來源有限及遺留手術(shù)瘢痕等問題，對于較長或粗大的神經(jīng)缺損，自體神經(jīng)移植難以滿足需要。隨著組織工程在周圍神經(jīng)領(lǐng)域的研究不斷深入，組織工程人工神經(jīng)將成為修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的新途徑，本文將對周圍神經(jīng)損傷的類別、神經(jīng)組織工程的基礎(chǔ)研究和與之緊密相關(guān)的組織工程人工神經(jīng)血管化等問題進(jìn)行綜述。

1 周圍神經(jīng)損傷概述

圍神經(jīng)系統(tǒng)包括脊髓和顱神經(jīng)的運(yùn)動、感覺和自主神經(jīng)元，以及神經(jīng)根、神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)叢等[1]。在日常生活中周圍神經(jīng)很容易受損傷，是外周神經(jīng)病變中的主要因素之一，周圍神經(jīng)的損傷與中樞神經(jīng)損傷不同之處在于其具有較強(qiáng)的再生能力，但再生程度與損傷的類型直接相關(guān)。

在20 世紀(jì)40 年代，Seddon 基于對創(chuàng)傷病例的觀察發(fā)表了神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度的分類：壓迫導(dǎo)致的神經(jīng)失用型，其損傷可被修復(fù)；軸突斷裂，可觀察到軸突連續(xù)性喪失但保留有神經(jīng)鞘膜；神經(jīng)斷裂，其連續(xù)性中斷完全的神經(jīng)切片。后來，Sunderland 根據(jù)組織病理學(xué)特征而將周圍神經(jīng)損傷分為五級（圖1）[2]。Ⅰ級和Ⅱ級對應(yīng)于Seddon 提出的定義，即Ⅰ級：神經(jīng)失用；Ⅱ級：軸突斷裂；Ⅲ級：軸突和神經(jīng)內(nèi)膜受損而神經(jīng)束膜完整；Ⅳ級：軸突、神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜受損，但保留有神經(jīng)外膜；Ⅴ級：對應(yīng)神經(jīng)斷裂，即完全神經(jīng)橫斷。在接下來的部分中，將根據(jù)最近的研究討論Sunderland（1951）描述的不同等級的神經(jīng)損傷。

1.1 Ⅰ級周圍神經(jīng)損傷

Ⅰ級通常對應(yīng)于周圍神經(jīng)壓迫，這種類型的損傷是由神經(jīng)干受直接壓力或根部受壓迫引起，此外，神經(jīng)壓迫性損傷最常影響穿過骨骼表面的神經(jīng)。神經(jīng)壓迫綜合征，也稱為壓迫性神經(jīng)病，可引起多種疾病，如肘管綜合征（尺神經(jīng)）、腕管綜合征（正中神經(jīng)）等[3]。在坐骨神經(jīng)痛綜合征中也發(fā)現(xiàn)類似的病變，主要是因突出的椎間盤壓迫坐骨神經(jīng)而導(dǎo)致。壓迫性神經(jīng)病也可發(fā)生在長期持于單一體位的患者中，如“星期六夜麻痹”，其患者的上臂受壓，通常是指因?yàn)樯媳劭恳伪乘X而橈神經(jīng)受壓出現(xiàn)麻痹。已知機(jī)械性壓迫可導(dǎo)致繼發(fā)性缺血性損傷，另一方面當(dāng)神經(jīng)內(nèi)部壓力超過動脈內(nèi)壓力時，神經(jīng)缺血導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度的軸突損傷。這兩種病理機(jī)制，即機(jī)械壓迫和局部缺血，被認(rèn)為與Ⅰ級損傷有關(guān)。Ⅰ級損傷通常伴有髓鞘形態(tài)學(xué)的改變或節(jié)段性脫髓鞘，電生理檢查可顯示脫髓鞘傳導(dǎo)阻滯或軸突受損。Ⅰ級損傷時通常運(yùn)動和感覺功能沒有完全喪失，因?yàn)榫S持了其完整的神經(jīng)連續(xù)性，有時可能會導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛。

1.2 Ⅱ-Ⅳ級周圍神經(jīng)損傷

Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級比Ⅰ級更嚴(yán)重。如上所述，Sunderland 分類中描述的不同等級取決于病變的嚴(yán)重程度，如軸突連續(xù)性和髓鞘（Ⅱ級）的喪失，以及神經(jīng)內(nèi)膜的損傷（Ⅲ級）和神經(jīng)束膜的損傷（Ⅳ級）。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級損傷病變原因包括擠壓傷和牽拉。神經(jīng)擠壓傷是由突然顯著的力量施加于神經(jīng)而引起的，例如鈍器傷。這些病變還可以通過外科鉗在手術(shù)期間的操作或車輛撞擊事故引起的擊打來誘導(dǎo)[4]。擠壓傷的嚴(yán)重程度雖不一，但一直觀察到的病理改變是軸突的連續(xù)性中斷，進(jìn)而遠(yuǎn)端會發(fā)生Wallerian變性，在損傷后幾個小時內(nèi)損傷遠(yuǎn)端的軸突和髓鞘開始崩解，48～96 h 后軸突將失去傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的能力。在病理生理學(xué)上，神經(jīng)結(jié)締組織支架還沒有中斷，因此，神經(jīng)纖維的再生相對比較容易，因此可以更好地恢復(fù)功能。然而，在損傷部位經(jīng)常觀察到創(chuàng)傷性神經(jīng)瘤的形成，這可能限制甚至阻止神經(jīng)再生，因此，神經(jīng)功能區(qū)恢復(fù)非常不均勻，即便功能區(qū)恢復(fù)是完整的，但通常需要相當(dāng)長的時間。研究人員常用神經(jīng)擠壓模型來研究周圍神經(jīng)再生，通常使用“鋸齒”狀或非“鋸齒”狀外科手術(shù)鉗對嚙齒動物的坐骨神經(jīng)造成人為損傷以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。文獻(xiàn)報道有很多產(chǎn)生擠壓傷的方式。因此，研究中存在著強(qiáng)烈的異質(zhì)性，主要是由于使用了不同的手術(shù)器械。Beer 等[5]描述了使用非“鋸齒”狀夾具，旨在使施加于神經(jīng)的壓力更趨于標(biāo)準(zhǔn)化。在動物模型中，通常認(rèn)為組織再生和功能恢復(fù)是存在個體間差異的，這一特征使得坐骨神經(jīng)擠壓傷模型特別適于研究周圍神經(jīng)再生的生物學(xué)以及制定治療方案以改善功能恢復(fù)。然而，在實(shí)驗(yàn)動物中觀察到的自發(fā)性軸突再生通常不會在人類中發(fā)生，這是由于在損傷部位觀察到廣泛的組織纖維化。因此，在許多嚴(yán)重的情況下，擠壓病變需要手術(shù)以移除受損組織并用導(dǎo)管代替。學(xué)者還開發(fā)了化學(xué)模型來模擬Ⅱ級和Ⅲ級。例如大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)注射甘油，觀察到的神經(jīng)病變顯示神經(jīng)纖維和髓鞘的完全破壞，但維持有結(jié)締支架，包括神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜并將該模型用于評估神經(jīng)再生期間的血管形成等問題[6]。

圖1 周圍神經(jīng)損傷模擬圖

周圍神經(jīng)也容易受到過度牽拉，隨著牽拉力的增加，超過了神經(jīng)的彈性，髓鞘、軸突和一些結(jié)締組織可能會破裂。實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)牽拉研究表明，大鼠坐骨神經(jīng)伸長8%會增加神經(jīng)內(nèi)壓，并使血流減少[7]。人體牽拉傷的一個例子是新生兒Erb-Duchenne 麻痹，這是一種臂叢神經(jīng)麻痹，最常見于復(fù)雜或困難分娩期間臂叢神經(jīng)的肩部撕脫。在人類中，一個重物落在人的肩膀上可能會產(chǎn)生另一種拉傷，導(dǎo)致臂叢神經(jīng)撕脫，并拉出脊髓根，這些撕裂傷最常見于車輛事故。

1.3 Ⅴ級周圍神經(jīng)損傷

根據(jù)Sunderland 的分類，Ⅴ級是最嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。在這種類型的損傷中，神經(jīng)干的連續(xù)性完全喪失。最常見的病因是周圍神經(jīng)的橫斷或撕裂。橫斷傷一般是由切割物體造成的（如刀傷、碎玻璃、金屬碎片、電鋸刀片）。另一個例子是在外科手術(shù)期間無意中橫切脊神經(jīng)分支，雖然可能發(fā)生部分恢復(fù)，但完全自發(fā)恢復(fù)是不可能的。在臨床中，神經(jīng)缺損需要使用感覺神經(jīng)（通常是腓腸神經(jīng)）作為自體移植物，在組織損失的情況下，另一種解決方案是使用生物材料（生物神經(jīng)導(dǎo)管、各種自體組織、生物功能化生物材料）和/或合成材料（硅膠、殼聚糖）植入重建[8]。

2 周圍神經(jīng)組織工程

周圍神經(jīng)組織工程的基礎(chǔ)是以雪旺細(xì)胞為核心，以相容性良好的生物可降解材料為支架，能維持雪旺細(xì)胞存活和神經(jīng)再生的生長因子為誘導(dǎo)劑的有機(jī)整體。組織工程人工神經(jīng)是一種橋梁，在修復(fù)周圍神經(jīng)損傷中起著營養(yǎng)支持的作用，其有三個要素，即種子細(xì)胞、生物支架材料和生長因子。

2.1 種子細(xì)胞

2.1.1 雪旺細(xì)胞

雪旺細(xì)胞（SCs）是周圍神經(jīng)纖維的重要組成成分，是構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維的髓鞘和無髓神經(jīng)束膜的主要成分，周圍神經(jīng)損傷后，遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian 變性，軸索和髓鞘完全崩解，此時SCs 分裂增殖，形成Bunger帶，引導(dǎo)軸突再生。此外，在神經(jīng)軸突生長過程中，雪旺細(xì)胞還可以分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)等多種活性物質(zhì)，產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)，和細(xì)胞粘附分子等，不斷誘導(dǎo)、刺激和調(diào)控髓鞘的形成和軸突的再生，為軸突再生提供先決條件，因此獲得大量、高純度、低免疫原性的SCs 是組織工程人工神經(jīng)研究的重要課題。

原代SCs 的分離和培養(yǎng)首先在1970 年代中期完成，并且很快被鑒定為外周和中樞神經(jīng)元疾病的潛在的細(xì)胞治療劑[9，10]。因此，原代SCs 的自體移植已用于增強(qiáng)周圍神經(jīng)損傷動物模型中的神經(jīng)再生[11]。從神經(jīng)組織分離并在體外培養(yǎng)的SCs 保留了表達(dá)營養(yǎng)因子以支持軸突再生和再生后髓鞘的傳導(dǎo)功能，在培養(yǎng)過程中可以用有絲分裂來擴(kuò)增培養(yǎng)的SCs 群體，從而增加移植所需的細(xì)胞數(shù)量。然后可以將培養(yǎng)的細(xì)胞移植到細(xì)胞化組織或生物材料支架中以重現(xiàn)周圍神經(jīng)樣組織。最重要的是，擴(kuò)增的人和大鼠SCs 群體在去除絲裂原后移植到嚙齒動物中時未顯示腫瘤形成[12]。但是原代SCs 的分離培養(yǎng)存在著一定的難度，手術(shù)獲取的周圍神經(jīng)含有大量的污染細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞，其在培養(yǎng)中比原代SCs 更容易復(fù)制，因此，SCs 的培養(yǎng)物可能會被成纖維細(xì)胞覆蓋，并且有證據(jù)表明活化成纖維細(xì)胞的移植實(shí)際上可能通過產(chǎn)生瘢痕而損害周圍神經(jīng)再生。國內(nèi)，韓金豹等通過改良SCs 的培養(yǎng)方法，應(yīng)用阿糖胞苷（Arab-c）抑制成纖維細(xì)胞生長，并加入NGF 促進(jìn)SCs 生長獲得了濃度超過90%的SCs，并將其應(yīng)用于后期的組織工程人工神經(jīng)的研究中[13]。目前，研究者們也將SCs 用于治療脊髓損傷的臨床試驗(yàn)，對于周圍神經(jīng)損傷的治療SCs 有重大的臨床應(yīng)用價值。

2.1.2 干細(xì)胞

原代SCs 的分離和培養(yǎng)的困難導(dǎo)致研究人員尋找替代的細(xì)胞來源以支持組織工程構(gòu)建體的軸突再生。干細(xì)胞是一種合理的選擇，因?yàn)樗鼈兡軌蚍只啥喾N細(xì)胞類型并在培養(yǎng)中自我更新。它可以在特定條件下被誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化，例如在特定誘導(dǎo)條件下干細(xì)胞也可分化為表達(dá)S-100 蛋白、角質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），和 P75 等SCs 特有標(biāo)記物的雪旺細(xì)胞樣細(xì)胞，而且已經(jīng)研究證實(shí)：分化成的雪旺細(xì)胞樣細(xì)胞同樣可以促進(jìn)軸突再生[14]。根據(jù)發(fā)育階段干細(xì)胞被分類為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育潛能分類為：從受精卵母細(xì)胞中分離的胚胎干（ES）細(xì)胞被定義為全能干細(xì)胞，并且從胚泡中取出的ES細(xì)胞被稱為多能細(xì)胞，全能干細(xì)胞可直接克隆人體，多能干細(xì)胞可直接復(fù)制各種臟器和修復(fù)組織。目前應(yīng)用于構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)的主要干細(xì)胞有：胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、神經(jīng)嵴干細(xì)胞（neuralcreststemcells，NCSCs）、毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）、脂肪干細(xì)胞（ASCs）、嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotentstemcells，iPSCs）等。已經(jīng)在周圍神經(jīng)損傷模型中研究了每種類型的干細(xì)胞，以確定它們在損傷后支持軸突再生的能力[15]。因此，在組織工程人工神經(jīng)構(gòu)建中干細(xì)胞或可替代雪旺細(xì)胞，成為首選的種子細(xì)胞。

2.1.3 基因工程細(xì)胞

盡管最近在神經(jīng)再生和外科修復(fù)技術(shù)方面取得了很多進(jìn)展，但修復(fù)受損神經(jīng)后的功能完全恢復(fù)是罕見的。生長因子是周圍神經(jīng)損傷后再生過程的主要組成部分，神經(jīng)損傷后生長因子的表達(dá)在遠(yuǎn)端神經(jīng)和失神經(jīng)肌肉中被上調(diào)，在損傷部位遠(yuǎn)端的神經(jīng)肌肉組織中表達(dá)較高，而在受損神經(jīng)的近端殘端中觀察到最小表達(dá)。神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端和失神經(jīng)肌肉的產(chǎn)量增加發(fā)生在損傷后早期，隨著時間的增加表達(dá)逐漸減少，損傷后生長因子表達(dá)的模式產(chǎn)生了一個臨時的濃度梯度，隨著損傷部位距離的延長而增加。臨時遠(yuǎn)端上調(diào)和生長因子的分泌是促進(jìn)軸突再生的信號，但是信號的持續(xù)時間通常短于再生軸突到達(dá)末端器官目標(biāo)所需的時間。慢性去神經(jīng)支配后遠(yuǎn)端神經(jīng)中的生長因子水平不足以刺激近端殘端的強(qiáng)健軸突再生[16]，因?yàn)樵谏窠?jīng)到達(dá)目標(biāo)之前，刺激它的信號變得很低或者消失。

基于周圍神經(jīng)損傷后生長因子體內(nèi)擴(kuò)散不良和代謝活動窗口短的結(jié)果，現(xiàn)研究外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子給藥作為增加周圍神經(jīng)再生的新途徑。使用基因工程細(xì)胞系統(tǒng)的新興研究表明，新的治療基因轉(zhuǎn)移到周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，用于局部長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)，作為受損外周神經(jīng)的新的治療方法。受損外周神經(jīng)的新型治療方式，基因工程細(xì)胞的使用已證實(shí)，但也注意到某些缺點(diǎn)，最重要的是其中神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的平衡調(diào)控，如濃度表達(dá)過高，反而可能會限制神經(jīng)突向外生長，因?yàn)樯窠?jīng)突不會繼續(xù)逆轉(zhuǎn)不利的神經(jīng)營養(yǎng)濃度梯度[17]。因此為了避免這種效應(yīng)，需要開發(fā)條件性表達(dá)的基因工程細(xì)胞系統(tǒng)，通過這種方式，生長因子的生理水平可以在遠(yuǎn)端殘端的需要區(qū)域保持適當(dāng)?shù)臅r間長度，并且可以在再生軸突橫穿缺損區(qū)后沉默。大量的文獻(xiàn)證實(shí)，基因修飾細(xì)胞技術(shù)可根據(jù)需要選擇性增強(qiáng)種子細(xì)胞對某個或多個細(xì)胞因子的釋放，經(jīng)特殊工藝處理后還能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子釋放的可控性。因此，在組織工程人工神經(jīng)研究領(lǐng)域中具有巨大的優(yōu)勢及廣闊的應(yīng)用前景，它將成為未來種子細(xì)胞研究的方向之一。

2.2 生物材料

隨著生物材料學(xué)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，生物材料的臨床應(yīng)用日益廣泛。在組織工程人工神經(jīng)研究領(lǐng)域一種理想的生物材料應(yīng)符合以下要求：第一，材料必須具有良好的組織相容性和生物安全性，以保證植入體內(nèi)后不會發(fā)生明顯的排異及對機(jī)體的毒性作用。第二，應(yīng)具有良好的表面活性，以利于種子細(xì)胞的生長和黏附并更好地發(fā)揮其生物學(xué)活性。第三，管壁材料應(yīng)具有選擇通透性，以利于維持種子細(xì)胞的活性以及人工神經(jīng)早期血管化的構(gòu)建。第四，材料應(yīng)具有適合神經(jīng)軸突生長的三維空間結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)再生提供通道。第五，材料還應(yīng)具有優(yōu)良的機(jī)械力學(xué)性能，以利于承載神經(jīng)再生所需要素。第六，在完成神經(jīng)支架使命后材料應(yīng)能完全降解并排出機(jī)體。

最初，生物惰性材料用于修復(fù)組織損傷，但它們只能為組織爬行提供支撐。但這些材料無法加速修復(fù)，因此學(xué)者們開始研究其他材料，目前生物支架材料種類繁多，主要有以下幾種。

2.2.1 人造合成材料

聚酯是神經(jīng)組織工程中常用的合成材料，如聚乳酸、聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸。當(dāng)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合時，聚乳酸表現(xiàn)更好并加速周圍神經(jīng)修復(fù)，能引導(dǎo)SCs 的遷移并誘導(dǎo)正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)的形成[18]。聚己內(nèi)酯材料在修復(fù)神經(jīng)方面具有與自體移植物相似的效果，其性能優(yōu)于聚乳酸導(dǎo)管。當(dāng)與白細(xì)胞介素-β10 結(jié)合時，聚己內(nèi)酯納米纖維支架促進(jìn)受損外周神經(jīng)周圍的活化，這對其修復(fù)很重要。聚乙醇酸也為神經(jīng)修復(fù)提供支持，聚乙醇酸具有良好的機(jī)械性能，可用于修復(fù)長段神經(jīng)缺損[19]。人造合成材料具有良好的生物相容性和生物降解性，重要的是它們的分解對機(jī)體幾乎沒有傷害。缺點(diǎn)是生產(chǎn)制造支架所需的高純度聚合物單體需要花費(fèi)大量的時間和金錢，而且這種材料的彈性和硬度較差，需用化學(xué)或物理方法去改善這些材料的性能。

2.2.2 天然生物材料

組織修復(fù)中使用三種主要的天然生物材料，膠原蛋白、絲素蛋白和明膠。Ⅰ型膠原導(dǎo)管是臨床上使用最廣泛的生物材料，純化的Ⅰ型膠原蛋白廣泛應(yīng)用于神經(jīng)組織工程。當(dāng)用于長間隙缺損損傷時，它可以獲得與神經(jīng)移植物類似的效果，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。當(dāng)以合適的比例與殼聚糖和明膠結(jié)合時，材料的微觀結(jié)構(gòu)在所有方面都是可觀的，包括孔徑等，這對受損神經(jīng)的康復(fù)具有積極作用[20]；絲素蛋白材料可以促進(jìn)神經(jīng)生長因子顆粒等相關(guān)因子的釋放，提供更多的營養(yǎng)因子和更合適的微環(huán)境來促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。絲素蛋白與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有良好的相容性，并支持細(xì)胞生長；明膠材料可用于修復(fù)周圍神經(jīng)損傷，減少神經(jīng)重建過程中的顯微操作，使修復(fù)更方便[21]。與原彈性蛋白結(jié)合，明膠在體內(nèi)降解得更慢，表明有可能支持緩慢再生神經(jīng)的生長。上述天然生物材料豐富且易于獲得，具有良好的生物相容性和生物降解性，并且易于在生物體內(nèi)吸收。然而，每種天然生物材料都有其自身的缺點(diǎn)。有些是脆的，容易破裂，或在潮濕的環(huán)境中容易被侵蝕，一些天然材料不溶于水和普通有機(jī)溶劑，因此限制了其應(yīng)用，然而化學(xué)改性和與其他材料的混合可以改善其功能并促進(jìn)其使用。

2.2.3 新型可降解材料

殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙?；蟮难苌?，殼聚糖及其衍生物憑借良好的組織相容性、多樣的生物活性、無細(xì)胞毒性、生物降解性及低致敏性被稱作多功能材料，其出眾的物化性質(zhì)，如高比表面、多孔性、抗張力強(qiáng)度及導(dǎo)電性，使其醫(yī)學(xué)用途廣泛，已廣泛應(yīng)用于臨床。顧曉松等將殼聚糖作為支架材料，成骨研制組織工程化神經(jīng)，修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損[22]。殼多糖在神經(jīng)修復(fù)的早期階段起到支持、保護(hù)和引導(dǎo)作用，并且在再生過程中可以提供相對穩(wěn)定的局部微環(huán)境，在神經(jīng)修復(fù)和再生的后期逐漸被吸收和降解。當(dāng)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合時，殼聚糖促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。與藻酸鹽支架相比，用于修復(fù)脊髓損傷的殼聚糖支架導(dǎo)致較少的瘢痕形成[23]。石墨烯是一種二維碳納米材料，具有良好的光學(xué)、電學(xué)和機(jī)械性能，當(dāng)石墨烯的納米顆粒摻入殼聚糖/明膠支架中并用于修復(fù)大鼠的坐骨神經(jīng)損傷時，它能促進(jìn)受損神經(jīng)的再生，減少炎癥反應(yīng)并加速內(nèi)源性成神經(jīng)細(xì)胞的遷移[24]。這些材料非常新穎，因此需要進(jìn)一步研究以發(fā)現(xiàn)其優(yōu)缺點(diǎn)，以更好地應(yīng)用于臨床。

2.3 生長因子

生長因子的神經(jīng)營養(yǎng)作用可間接影響神經(jīng)導(dǎo)管中的種子細(xì)胞，作為組織工程神經(jīng)移植的一部分，可以將外源性生長因子添加到神經(jīng)導(dǎo)管中，尋求更好的神經(jīng)修復(fù)效果。最常用的是神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等。裝載有NGF 的殼聚糖/絲膠蛋白復(fù)合支架可維持生物活性成分的局部釋放，以治療慢性周圍神經(jīng)壓迫損傷。BDNF 在促進(jìn)神經(jīng)元存活、增加突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)生方面的作用顯著，當(dāng)表達(dá)BDNF 的慢病毒載體注射到由模板化瓊脂糖多通道引導(dǎo)支架橋接的坐骨神經(jīng)損傷部位時，它增強(qiáng)了周圍神經(jīng)再生[25]。GDNF 可以支持運(yùn)動神經(jīng)元的存活，為它們提供營養(yǎng)并調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育和分化。當(dāng)游離GDNF 與氧化鐵納米顆粒綴合以延長其活性時，顯著加快髓鞘的發(fā)生和生長[26]。神經(jīng)營養(yǎng)因子 3（NT-3）、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）和 VEGF也已被用于修復(fù)周圍神經(jīng)損傷。生長因子主要以蛋白質(zhì)為主，它們的功能在高溫、高壓或與有機(jī)溶劑接觸的條件下容易破壞，然而，這些方法對于生產(chǎn)支架材料是必需的，因此在制備材料期間必須考慮將生長因子應(yīng)用于支架以增強(qiáng)對生長因子的保護(hù)。

3 組織工程人工神經(jīng)血管化

組織工程學(xué)是將種子細(xì)胞種植于組織相容性及生物降解性良好的生物材料上，形成細(xì)胞-支架材料復(fù)合物，并在生長因子的輔助下移植到組織或器官。目前組織工程學(xué)在各研究領(lǐng)域都有了突破性進(jìn)展，然而組織工程神經(jīng)的移植效果一直不是很理想，與自體神經(jīng)移植相比還有差距。分析其原因，學(xué)者們認(rèn)為這可能與神經(jīng)移植物的再血管化延遲有關(guān)，不能及時建立內(nèi)在有效的血液循環(huán)，缺血缺氧，這可能導(dǎo)致種子細(xì)胞枯萎，進(jìn)而神經(jīng)再生功能降低。研究表明，體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞位于距離最近的血管源100～200μm，以確保通過擴(kuò)散充分輸送氧以滿足細(xì)胞代謝的需要[27]，如超過這個距離就需要血管提供氧氣以維持組織器官正常功能。因此必須找到解決組織工程神經(jīng)移植區(qū)血管化的方法是課題關(guān)鍵。

我國顧曉松院士的科研團(tuán)隊(duì)，多年來致力研究周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的相關(guān)課題，如殼聚糖、絲素等支架材料及不同種子細(xì)胞、生長因子等，認(rèn)為血管生成和神經(jīng)再支配是密切相關(guān)的過程。Ferretti 等[28]研究顯示，在移植的人類皮膚模型中，血管形成先于神經(jīng)支配過程，表明神經(jīng)組織的發(fā)育是由血管系統(tǒng)提供的營養(yǎng)或營養(yǎng)因素驅(qū)動的。雖然一些研究者證明在神經(jīng)再生的同時發(fā)現(xiàn)了足夠的神經(jīng)內(nèi)血管形成，但對血運(yùn)重建在神經(jīng)再生中的特殊作用了解較少。周圍神經(jīng)的血管化可分為兩個縱向系統(tǒng)：第一個是神經(jīng)周圍的血管系統(tǒng)，通過提供分支連接到外部血管系統(tǒng)，外在系統(tǒng)包括一系列沿周圍神經(jīng)表面運(yùn)動的動脈和靜脈，主要供應(yīng)神經(jīng)外膜和神經(jīng)周圍區(qū)域。第二個是神經(jīng)內(nèi)血管（INV）系統(tǒng)，相比之下，內(nèi)在系統(tǒng)獨(dú)立于外在系統(tǒng)運(yùn)行，其位于神經(jīng)束內(nèi)并且由小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管組成，向神經(jīng)內(nèi)隔室區(qū)域供應(yīng)血液和溶解的營養(yǎng)物[29]。血管成分和神經(jīng)組織被血-神經(jīng)屏障（BNB）分開，在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜對于BNB 的形成是必需的，神經(jīng)束膜主要具有機(jī)械功能，而神經(jīng)內(nèi)膜則控制兩側(cè)之間的交換，神經(jīng)束膜層狀包繞在分束周圍，其中每層都有成纖維細(xì)胞并被基底層覆蓋，肌纖維母細(xì)胞位于該基底層上，該組織主要與神經(jīng)的牽拉順應(yīng)性有關(guān)。神經(jīng)內(nèi)膜由神經(jīng)內(nèi)膜成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和有髓神經(jīng)纖維的膠原組織致密基質(zhì)組成，神經(jīng)內(nèi)膜還含有神經(jīng)內(nèi)膜液，類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦脊液，通過INV 系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞維持對神經(jīng)內(nèi)液體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，血液和神經(jīng)內(nèi)膜間的交換是通過載體如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 等進(jìn)行。最后一個成分是髓鞘，它對軸突有營養(yǎng)和保護(hù)功能?？傊庵苌窠?jīng)的氧合和營養(yǎng)供應(yīng)在神經(jīng)發(fā)育、體內(nèi)平衡和再生中起關(guān)鍵作用。

還有一些研究指出了皮膚中神經(jīng)和血管的排列以及它們的相互成熟之間的聯(lián)系[30]，然而，盡管這些研究大多集中在血管網(wǎng)絡(luò)對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，但對于INV 系統(tǒng)如何發(fā)展并在周圍神經(jīng)損傷后促進(jìn)軸突再生的機(jī)制尚不明確，因此這種機(jī)制值得我們?nèi)パ芯俊artial 等[31]研究分析甘油注射損傷的周圍神經(jīng)切片的血管再生情況，觀察發(fā)現(xiàn)在D14 和D21神經(jīng)細(xì)胞的增加與基底膜的增殖有關(guān)。此外，還注意到由幾個新毛細(xì)血管包圍的小動脈的存在，這些觀察結(jié)果有利于INV 系統(tǒng)的再生，在D60 觀察到具有正常外觀的血管，因此表明INV 系統(tǒng)完全再生。對此得出結(jié)論，血管反應(yīng)由兩個階段組成，早期階段包括損傷后第1 周，其特征是血管體積變大，血管數(shù)量保持不變。第二階段在損傷后1～6 周，觀察到血管數(shù)量的增加。血管反應(yīng)的第一階段與巨噬細(xì)胞的募集和Wallerian 變性產(chǎn)生的軸突退化和髓鞘碎片的清除有關(guān)，而第二階段與神經(jīng)再生有關(guān)，包括細(xì)胞增殖、軸突伸長和髓鞘形成。實(shí)際上，有大量證據(jù)表明，毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)和功能特別有利于軸突再生。在再生期間，神經(jīng)內(nèi)膜毛細(xì)血管的數(shù)量和毛細(xì)血管滲透性的增加，可以促進(jìn)碎屑的清除并且有助于延長軸突，SCs 遷移和軸突再生在血管良好的區(qū)域中最為明顯。

此外，有關(guān)研究強(qiáng)調(diào)了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對神經(jīng)元存活和SCs 增殖的有益作用，在硅膠腔室中添加的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）顯示在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型中顯著增加血管形成并增強(qiáng)軸突再生和SCs 增殖，表明血管化和神經(jīng)再生過程之間的相互依賴性[32]，血管化增加與神經(jīng)再生增強(qiáng)之間存在正相關(guān)關(guān)系。VEGF 是組織修復(fù)過程中需要的有效血管生成因子，具有促進(jìn)血管通透性增加和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。另一項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞分泌的VEGF-A 可能通過血管生成、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)等作用來支持和增強(qiáng)再生神經(jīng)纖維的生長[33]。

總之，血管形成和神經(jīng)再生之間的相互聯(lián)系已得到很好的證實(shí)。首先，脈管系統(tǒng)提供諸如氧氣的營養(yǎng)物，用于再生軸突和相關(guān)細(xì)胞，從而增加長期存活。此外，內(nèi)皮細(xì)胞分泌可有益于神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)再生的分子。最后，血管也可作為施萬細(xì)胞遷移的軌道，從而引導(dǎo)軸突生長。因此，血管化人工神經(jīng)導(dǎo)管是探索周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的一種令人興奮的方法。圍繞此研究，我們將簡單描述實(shí)現(xiàn)神經(jīng)血管化的技術(shù)方向。

血管化神經(jīng)移植物（VNG）涉及將完整脈管系統(tǒng)的神經(jīng)移植物移植到神經(jīng)再生部位，并且已經(jīng)開發(fā)用于解決許多生理性挑戰(zhàn)。VNG 可促進(jìn)人體血管化不良區(qū)域的神經(jīng)內(nèi)灌注和營養(yǎng)輸送，通過恢復(fù)神經(jīng)血管而避免常規(guī)神經(jīng)移植物的早期缺血。盡管VNG具有改善神經(jīng)修復(fù)的潛力，但主要限制是缺乏供體部位。VNG 在大神經(jīng)中起作用，特別是在長間隙中。然而，為了獲取如此大的神經(jīng)，供體部位的發(fā)病率和瘢痕形成不可避免。

使用血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）和生物材料支架預(yù)制血管化神經(jīng)構(gòu)建體的組織工程為長間隙神經(jīng)修復(fù)中的血管形成提供了另一種方法。一項(xiàng)研究表明，通過在纖維增強(qiáng)的3D 復(fù)合支架內(nèi)同時培養(yǎng)SCs 和VECs，可以形成血管化神經(jīng)工程化構(gòu)建體[34]。根據(jù)該研究，將來自兔子的SCs 和VECs 以2∶1 的比例進(jìn)行培養(yǎng)，然后將該混合細(xì)胞群注射到纖維增強(qiáng)支架的兩端以形成血管化組織工程神經(jīng)構(gòu)建體。這些構(gòu)建體在三個不同的術(shù)后時期（4、8 和16 周）對兔坐骨神經(jīng)損傷模型進(jìn)行評估，并且在傳導(dǎo)速度、神經(jīng)纖維數(shù)量和髓鞘厚度方面益于促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，表明當(dāng)存在VECs 時，神經(jīng)生長顯著增強(qiáng)，支持在組織工程化神經(jīng)構(gòu)建體中內(nèi)皮細(xì)胞具有的效用。

4 展望

周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程復(fù)雜，由多種因素共同參與。組織工程人工神經(jīng)若要滿足自體移植“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，甚至超越自體移植仍有很多的技術(shù)問題需要進(jìn)一步解決，如：⑴支架材料的選擇，需選擇與種子細(xì)胞相容性良好，更好地促進(jìn)種子細(xì)胞在其上增殖分化，同時能負(fù)載細(xì)胞生長因子，從而更好地改善體內(nèi)微血管化；⑵在時間和空間上調(diào)控加入的生長因子，把關(guān)平衡，實(shí)現(xiàn)生長因子的高度表達(dá)；⑶周圍神經(jīng)血管系統(tǒng)促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的相關(guān)機(jī)制還未見明確。為此，希望神經(jīng)組織工程研究不斷深入與完善，精準(zhǔn)而快速地促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，在臨床實(shí)踐中得到更為廣泛的推廣和應(yīng)用，為人類造福。