一種舟山海域光參與刺參成分及結(jié)構(gòu)的比較分析

周光東 霍健聰，2* 鄧尚貴

（1 浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山 316000

2 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室 浙江舟山 316000）

海參（sea cucumber），屬海參綱（Holothuroidea），是一種生活在淺海到數(shù)千米深海的海洋棘皮動物。長期以來我國對海參豐富的營養(yǎng)價值和鮮美口感推崇備至，將其列為“海八珍”之首。我國是海參生產(chǎn)大國，北至遼寧大連，南到南沙群島均有出產(chǎn)。從海參產(chǎn)地來分，我國海參主要有兩大類：刺參和光參。刺參主要產(chǎn)于我國北方海域，肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，成為國內(nèi)海參市場主要消費對象。由于刺參本身價格較高，加上近年來刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量增加有限，造成了市場上對刺參的旺盛需求與刺參產(chǎn)量供給不足之間的矛盾，開發(fā)新的海參資源成為解決這一矛盾的主要出路。

光參（Cucumaria japonica）是廣泛存在于我國東南沿海的一類海參，主要有光參科、瓜參科和芋參科三類[1]。光參資源保有量大，當(dāng)前我國僅東海海區(qū)光參資源量約為100萬t[2]。長期以來，雖然市場對海參需求旺盛，但是由于光參這類海參資源在外形、口感等方面與刺參相差較大，加上光參體表堅硬，干燥后泡發(fā)時間長，工藝復(fù)雜，泡發(fā)效果差等問題，使得光參這類資源的開發(fā)利用始終處于空白。目前關(guān)于光參的研究多集中于酶解產(chǎn)物特性方面，而關(guān)于光參基礎(chǔ)特性的系統(tǒng)研究成果寥寥無幾。在此背景下，本課題以舟山產(chǎn)光參為研究對象，對其化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)特征進行研究，為光參的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為舟山海域光參資源的高值化開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 原料與方法

1.1 原料與設(shè)備

光參，由浙江海士得食品有限公司提供，原料捕撈于舟山魚山漁場（28°00"-29°30"N，121°54"-125°00"E），捕撈出水后立刻進行剖殺、去內(nèi)臟并蒸煮（100℃沸水中煮15 min），蒸煮后的光參置于敷有碎冰的泡沫箱后運到實驗室；原料運抵實驗室后于烘箱內(nèi)烘干至水分含量約23%，即得干光參；淡干刺參由威海紅一切食品有限公司提供，原料經(jīng)浙江海洋學(xué)院?？茖W(xué)院鑒定為海地瓜（Acaudina molpadioides，以下簡稱光參）和刺參（Apostichopus japonicus）；所需化學(xué)試劑、酶制劑及分子質(zhì)量標(biāo)準品等均購于國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司，化學(xué)試劑均為分析純。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜（Optima 5300DV），美國PerkinElmer公司；液相色譜儀（安捷倫1260），美國安捷倫科技公司；氣相色譜儀（安捷倫7820A），美國安捷倫科技公司；原子吸收分光光度計（SP-3500），上海光譜儀器有限公司；熒光分光光度計（F95S），杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；全自動凱氏定氮儀（KJELTEC），丹麥FOSS公司；紫外可見分光光度計（UV-2800），日本日立有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（A-1000S），日本東京理化；冷凍干燥機（LGJ-10B），北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160A），北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；均質(zhì)器（JZQ-Ⅱ），天津東康科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2800），日本日立有限公司；掃描電鏡（S3400N），日本日立有限公司；其余均為試驗室常用設(shè)備。

1.2 試驗方法

1.2.1 基本營養(yǎng)成分測定 多糖、灰分、蛋白質(zhì)、粗脂肪等常規(guī)營養(yǎng)成分測定參照國標(biāo)法；膠原蛋白含量測定參照Visessanguan等[3]方法。

1.2.2 氨基酸測定[4]氨基酸測定采用氨基酸自動分析儀。精確稱取一定量的樣品（精確到0.0001g）置于水解管中，加入6 mol/L的濃鹽酸，充氮封口后于110℃干燥箱內(nèi)水解22 h，然后上機測定。

1.2.3 維生素含量測定 VA和VE測定采用液相色譜法[5]；VB1和 VB2采用紫外分光光度法[6]；VB6測定采用熒光法[7]。

1.2.4 主要礦物元素測定 鐵、鎂、錳、鉛、砷等的測定采用石墨爐原子吸收法[8]；鈣測定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[9]。

1.2.5 脂肪酸測定[10]及皂甙含量測定[13]脂肪酸測定采用氣相色譜法，測定柱溫220℃；FID溫度：250℃；進樣量：0.5 μL；空氣流速 360 mL/min；氫氣流速30 mL/min。皂甙含量測定采用國標(biāo)法。

1.2.6 氨基酸營養(yǎng)價值評定[11-12]蛋白質(zhì)的氨基酸評分（amino acid score，AAS）按照下式進行。

1.2.7 膠原蛋白提取及紫外吸收光譜分析 膠原蛋白酸提法參考朱偉[17]的方法，具體操作為：將光參體壁剪碎，用0.1 mol/L的NaOH浸泡8 h，清洗至中性，再加入0.5 mol/L的乙酸溶液浸泡24 h，浸泡完畢后過濾、離心，除去不溶物；取上清液，緩慢加入一定量的固體NaCl，4℃下靜置過夜后可見有白色絮狀沉淀析出，即為膠原蛋白；上清液高速離心（10 000 r/min，30 min）后得到酸溶性膠原蛋白，1 000 u分子質(zhì)量透析膜清水中透析至中性后冷凍干燥，備用；酶法提取在參考劉成梅等[18]方法基礎(chǔ)上改用胃蛋白酶。按照質(zhì)量比1∶1 000比例加入蛋白酶（酶活力30 000 U/g），而后加入不溶物總質(zhì)量10倍、pH為2的乙酸溶液，37℃保溫2 h后100℃滅酶10 min，過濾，取濾液加入一定量的NaCl，剩余操作同酸提法。精確稱取10 mg光參膠原蛋白溶解于10 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸溶液中，于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，采用0.5 mol/L乙酸溶液為空白。

1.2.8 光參膠原蛋白電泳分析 精確稱取膠原蛋白1 mg，溶解于0.5 mol/L乙酸溶液中，用0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至中性后加入緩沖液后置于沸水浴5 min，取出后8 000 r/min離心5 min，取適量上清液進行電泳，電泳條件為直流穩(wěn)壓電源，電流為15 mA，時間2～3 h；分離膠條件為：20%分離膠：30%凝膠儲備液3 mL，3 mol/L pH 8.9的Tris-HCl緩沖液 3 mL，10%SDS 0.1 mL，10%過硫酸銨0.1 mL，TEMED 0.006 mL，再加入重蒸水0.6 mL；5%濃縮膠：30%凝膠儲備液 0.83 mL，0.5 mol/L，pH 值 6.7的Tris-HCl緩沖液 0.63 mL，10%SDS 0.5 mL，10%過硫酸銨 0.05 mL，TEMED 0.005 mL，再加入重蒸水3.4 mL；電極緩沖液：Tris-甘氨酸緩沖液，pH 8.3；樣品緩沖液：0.02 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.2，內(nèi)含 1%SDS，0.02%溴酚藍，20%甘油，1%巰基乙醇；染色液：0.25g考馬斯亮藍R-250加入91 mL 50%甲醇，9 mL冰醋酸配制而成；脫色液：75 mL冰醋酸，875 mL重蒸水和50 mL甲醇混勻。

樣品分子質(zhì)量從標(biāo)準蛋白遷移率同其分子質(zhì)量對數(shù)標(biāo)準曲線上計算獲得。遷移率按下式計算：

遷移率Rf=樣品移動距離（mm）/溴酚藍移動距離（mm）

1.2.9 掃描電鏡分析 取少量光參及刺參體壁樣品固定于進樣臺上，于紅外燈下烘干后置于樣品艙中真空條件下噴金鍍膜90 s，而后樣品固定于載物臺，在電鏡觀察室內(nèi)觀測拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 光參與刺參基本營養(yǎng)成分

表1為光參和刺參基本營養(yǎng)成分數(shù)據(jù)。從表中可以看出，光參灰分顯著高于刺參，表明光參含有豐富的礦物元素，而灰分較高也是光參類海參的主要特點之一，白肛海地瓜 （Acaudina leucoprocta）灰分含量也達到19.92%[14]；從表中還可以看出，光參多糖含量略高于刺參，而多糖類物質(zhì)普遍具有抗衰老、抗氧化、消除自由基等多種生理功效，是目前生物活性物質(zhì)的研究熱點，這一特性表明光參在促進人體健康方面可能優(yōu)于刺參，作為兼具藥食兩用的食物原料具有一定的開發(fā)潛力；盡管光參粗蛋白含量低于刺參，但膠原蛋白含量在光參中達到51.39%，顯著高于刺參（24.22%），膠原蛋白是一種廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥品的蛋白質(zhì)，海洋生物類膠原蛋白以其安全性高的特點正日益成為膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的原料獲取來源，而“多吃膠原蛋白可以美容”的觀點不僅成為普通消費者的共識，也賦予光參廣闊的市場前景；光參粗脂肪含量極低，僅為0.04%，顯著低于刺參的0.26%，也表明光參是一種蛋白質(zhì)含量較高，而脂肪含量較低的食物原料。

表1 光參與刺參基本營養(yǎng)成分比較（%，均以干基計，以下同）Table1 Nutrient composition analysis of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（%，with dry basis，the same as follows）

2.2 光參與刺參主要維生素含量

表2為光參與刺參主要維生素含量比較。從表2可以看出，光參含有的維生素盡管種類較多，但含量分布差異較大，其中VE含量最高，達到2.18 mg/100 g，且含量達到刺參的2.8倍。VE是一種天然強抗氧化劑，具有清除自由基的功效，富含VE這一特點賦予光參較強的生物活性；但其它維生素同刺參相比，除VB2之外均低于或顯著低于刺參，且VA含量為由標(biāo)準曲線推算得到的估算值。

表2 光參與刺參主要維生素含量（mg/100g）Table2 Main vitamins content of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（mg/100g）

2.3 光參與刺參氨基酸組成分析

表3是光參與刺參氨基酸組成分析。從表中可以看出，光參氨基酸含量低于刺參，但差距僅為約10個百分點；其中天冬氨酸、甘氨酸及脯氨酸含量高于刺參，但其余氨基酸含量均低于刺參；但從表3中可以看到，脯氨酸是膠原蛋白的特有氨基酸，光參和刺參氨基酸中均含有脯氨酸，表明這兩類海參中均含有膠原蛋白；同刺參相比，光參中膠原蛋白含量顯著高于刺參（10.4%和2.8%）。膠原蛋白具有多種生物活性，在化妝品、醫(yī)用保健食品領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景，光參富含膠原蛋白這一特性賦予光參廣闊的開發(fā)利用空間；此外，有資料表明[22]：精氨酸和賴氨酸比值越高，則對人體中膽固醇和高密度脂蛋白的清除效果越好。從表中可以看出，光參中精氨酸和賴氨酸比值為3.4，表明光參對人體心腦血管系統(tǒng)具有較好的保護潛力；將光參和刺參的必需氨基酸與FAO/WHO指定的蛋白質(zhì)評價的氨基酸標(biāo)準模式進行比較，光參氨基酸評分結(jié)果如表4所示。從表中可以看出，光參的8種必需氨基酸評分盡管普遍低于刺參，但除異亮氨酸和賴氨酸外，其余氨基酸評分均接近刺參，表明光參蛋白質(zhì)仍然具有較好的質(zhì)量；此外，從表中還可以看出，光參的第一限制性氨基酸為賴氨酸。

表3 光參與刺參氨基酸組成分析（g/100g）Table3 Amino acid analysis of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（g/100g）

表4 光參必需氨基酸評價（mg/g）Table4 Evaluation of essential amino acid of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（mg/g）

2.4 光參與刺參無機元素分析

光參無機元素含量結(jié)果見表5。從表中可以看出，光參礦物元素含量較為豐富，其中常見礦物元素鉀、鈉、硒等元素含量較高，分別為刺參的2.6，3.4，5.9倍，尤其是鐵元素含量達到150 mg/kg，顯著高于刺參的2.3 mg/kg，而缺鐵性貧血是當(dāng)前世界性營養(yǎng)型疾病之一，光參這一特性使其成為一類適用于貧血病人的良好食物；此外，其它礦物元素除鎂外均高于刺參，表明光參在礦物元素含量方面優(yōu)于刺參。當(dāng)前，隨著海洋污染的日益加重，重金屬食品安全問題成為海洋水產(chǎn)品的研究熱點。劉小芳與單恩莉[15-16]發(fā)現(xiàn)刺參和光參中都有重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象。而本研究中發(fā)現(xiàn)，舟山海域產(chǎn)光參鉛、砷等含量符合國家標(biāo)準（GB2762-2012《食品中污染物限量》），表明光參是一種安全、綠色的天然食品。

表5 光參與刺參無機元素含量（mg/kg）Table5 Mineral content of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（mg/kg）

2.5 光參與刺參脂肪酸及皂甙含量及比例比較

從表6中可以看出盡管光參粗脂肪含量較低（僅為原料質(zhì)量的0.04%），但脂肪酸質(zhì)量較高，其中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別占脂肪酸含量的35.06%和30.86%，飽和脂肪酸比例僅為 21.88%，尤其是花生四烯酸（C20：4，ARA）比例達到22.44%。高純度的花生四烯酸是合成前列腺素，血栓烷素和白細胞三烯等二十碳衍生物的直接前體，這些生物活性物質(zhì)對人體心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有十分重要的作用；同時，對比刺參脂肪酸種類及含量可以發(fā)現(xiàn)，所有種類脂肪酸含量比例光參均高于刺參，且優(yōu)質(zhì)脂肪酸（單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸）比例顯著高于刺參，這也表明光參盡管脂肪酸含量較低，但含有的脂肪酸質(zhì)量較高。

皂甙類物質(zhì)具有多種生理功效，是當(dāng)前除多糖之外的另一個活性物質(zhì)研究熱點。皂甙檢測結(jié)果表明，光參中皂甙含量為344 mg/100 g，盡管低于刺參539 mg/100 g，但也表明光參具有一定生理活性和藥用價值。

2.6 光參膠原蛋白紫外圖譜分析

圖1是光參酸溶膠原蛋白和胃蛋白酶溶膠原蛋白紫外吸收光譜圖。通常由于蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸、脯氨酸和組氨酸都含有共軛雙鍵，使得大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm處都有一個很強的紫外吸收，而在圖1中的280 nm處并未出現(xiàn)吸收峰，表明該蛋白并非普通蛋白；由于膠原蛋白本身含有酪氨酸和苯丙氨酸，而這兩種氨基酸具有敏感的發(fā)色團，對300 nm以下波長存在最大吸收，從圖中可以看出，兩種不同提取方式的膠原蛋白溶液在230 nm處均有最大吸收波峰，符合膠原蛋白的紫外吸收特性；此外，在230 nm處出現(xiàn)最大吸收峰也可能是由于光參膠原蛋白的多肽鏈中含有C=O雙鍵較多的氨基酸導(dǎo)致，其中天冬氨酸、精氨酸等都含有C=O雙鍵。

2.7 光參膠原蛋白電泳圖譜

圖2是光參和刺參膠原蛋白的電泳圖譜。從圖中可以看出，酶法和酸法提取的膠原蛋白分子質(zhì)量基本相同，其中酸法和酶法提取蛋白各獲得3條較為清晰的電泳帶，其中膠原蛋白的α鏈分子質(zhì)量約為100 ku，而由于β鏈為α鏈的二聚體，則分子質(zhì)量約為200 ku，而γ鏈為α鏈的三聚體，理論上分子質(zhì)量約為300 ku。通過Maker遷移率可計算得到α鏈和β鏈分子質(zhì)量98 ku和102 ku，滿足典型水產(chǎn)品膠原蛋白特性，但試驗中并未發(fā)現(xiàn)γ鏈的泳帶，這可能和分離膠濃度及電泳條件有關(guān)；從圖中還可以看出，除較為明顯的α鏈和β鏈的泳帶之外，還有若干條不太清晰的泳帶，這可能與膠原蛋白含有部分雜蛋白有關(guān)，表明酸提法盡管具有較好的提取效果，但提取的膠原蛋白純度仍需進一步提高；此外，從圖中還可以看出薛東梅[19]提取的刺參膠原蛋白電泳圖譜上同樣也出現(xiàn)3條泳帶，分別為α1、α2和β，其分子質(zhì)量分別約為112，130和210 ku，這表明盡管光參和刺參經(jīng)電泳分離后膠原蛋白鏈數(shù)目相同，都屬于膠原蛋白，但各自膠原蛋白鏈分子質(zhì)量不同，這可能是光參和刺參在采取相同處理工藝 （煮制熟化及泡發(fā)處理）而泡發(fā)時間和泡發(fā)效果相差較大的原因；另一方面是由于海參品種不同造成。

表6 光參與刺參脂肪酸組成（%）Table6 Fat acid composition of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（%）

表7 光參與刺參皂甙含量（mg/100g）Table7 Saponin content of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas（mg/100g）

圖1 光參膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet spectra of Acaudina molpadioides collagen

圖2 光參膠原蛋白及刺參膠原蛋白電泳圖譜Fig.2 Collagen electrophoretogram of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas

2.8 光參與刺參微觀結(jié)構(gòu)

對于水產(chǎn)品而言，鮮嫩是其主要食用特征之一。而嫩度主要由肌肉纖維特性決定，肌纖維長度越短、直徑和密度越小，則嫩度越好，食用品質(zhì)越好[20-21]。從圖3可以看出，光參和刺參肌纖維明顯不同，光參肌纖維呈致密不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)無序排列狀態(tài)；而刺參的肌纖維則呈現(xiàn)較為規(guī)則的片狀排布，排列具有一定的方向性，片狀結(jié)構(gòu)之間具有較大的空間，肌纖維整體排布較為松散。光參和刺參在結(jié)構(gòu)上的這種排列在一定程度上決定了兩種海參在口感上的差異。

3 討論

刺參以其細嫩、美味和滋補等特點成為作為傳統(tǒng)名優(yōu)海產(chǎn)品，市場需求量逐年擴大。但隨著近年來“糖干刺參”、“抗生素刺參”等食品安全事件的不斷發(fā)生，刺參市場銷售一路下滑。光參是舟山海域資源保有量大的一類捕撈海參，具有天然、無污染、安全等特性。長期以來光參一直未得到充分利用，主要原因是光參自體酶活性較高，捕撈出水后需要立刻進行去內(nèi)臟、蒸煮等處理，而處理后的光參泡發(fā)時間長，且泡發(fā)后仍難以恢復(fù)到口感細嫩的狀態(tài)。從本研究結(jié)果來看，盡管光參在蛋白含量、脂肪酸質(zhì)量等方面略遜于刺參，但總體看來光參仍然屬于一類高蛋白、低脂肪、富含礦物元素和活性物質(zhì)的海參資源。

圖3 光參與刺參微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicas

作為一類具有較強開發(fā)潛力的海參，光參開發(fā)目前面臨的主要問題是干光參如何短時間內(nèi)實現(xiàn)有效泡發(fā)，以達到降低嫩度的目標(biāo)。而本研究中已證實：光參膠原蛋白含量豐富，且肌肉纖維呈致密不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其硬度極高，這可能是光參難以泡發(fā)的主要原因。目前關(guān)于光參的研究多集中于光參多糖等活性物質(zhì)生物學(xué)特性和光參酶解產(chǎn)物特性研究，關(guān)于光參的嫩化研究較少，僅有本課題組采用超高壓和生物酶解的方式進行了嫩化研究[1，23]，但這些方法同樣存在設(shè)備復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高、嫩化效果較差等問題。因此，在透徹了解舟山光參基本生化特性之后，進一步研究光參的高效嫩化方法成為實現(xiàn)這類海參資源高效利用的必然途徑，這也成為今后本研究的努力方向。

4 結(jié)論

1）光參蛋白質(zhì)含量較高，粗蛋白含量達到52.38%（干基），其中以膠原蛋白為主；氨基酸評分標(biāo)準結(jié)果表明盡管光參蛋白質(zhì)質(zhì)量低于刺參，但差距不大，其第一限制性氨基酸為賴氨酸；紫外光譜分析結(jié)果表明通過酸提法和酶提法獲得的蛋白具有典型的膠原蛋白特性，在230 nm處具有典型的吸收峰；電泳圖譜表明所得的膠原蛋白具有典型的α鏈和β鏈，其分子質(zhì)量分別為98 ku和102 ku，但未分離得到γ鏈。

2）光參含有多種維生素，以VE含量最為豐富，達到2.18 mg/100 g，其余維生素含量較低；礦物元素種類較多，部分礦物元素如鉀、鈉、鎂、鐵含量較高，其中鐵元素含量顯著高于刺參，是貧血病人的良好補鐵食物來源，光參中鉛和砷含量較低，符合國家標(biāo)準，這表明光參是一種綠色天然無污染的食品；光參中含有23種脂肪酸，以單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸為主，含量分別達到35.06%、30.86%。

3）光參肌纖維呈現(xiàn)致密的不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列呈現(xiàn)無序狀態(tài)。這可能是光參硬度較大，難以泡發(fā)的主要原因。