沙蠶EN制劑改善肝癌前病變小鼠代謝的研究

李慧婷 李 娓 郭銳華 費(fèi)迎心 吳文惠 包 斌*

（1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306

2 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海 201306

3 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心 上海 201306）

惡性腫瘤是臨床常見疾病，也是當(dāng)前及今后相當(dāng)長一段時間內(nèi)威脅人類健康和導(dǎo)致死亡的主要原因[1-2]。腫瘤病人因腫瘤異常生長和代謝、疼痛、梗阻而存在不同程度的營養(yǎng)不良[3]?；诿庖吲c營養(yǎng)密切相關(guān)，采用合理的營養(yǎng)支持改善腫瘤患者機(jī)體的免疫功能，成為食品研究的前沿方向。應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)支持輔助治療癌癥及危重病患者也受到越來越多的重視[4]。

研究表明，腸內(nèi)營養(yǎng)（Enteral nutrition，EN）可以改善腸道功能，減少內(nèi)毒素入血和體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放[5]。腫瘤型腸內(nèi)營養(yǎng)制劑主要應(yīng)用在重癥患者手術(shù)前、后以及放療和化療期間[6]。目前我國腸內(nèi)營養(yǎng)制劑主要來自于歐洲進(jìn)口[7]，國內(nèi)上市的EN制劑產(chǎn)品所采用的主要原材料為陸源性動植物及其提取物，其中蛋白質(zhì)源主要為大豆蛋白、牛奶蛋白和雞蛋蛋白或水解植物蛋白及其衍生物[8]。用新型蛋白源開發(fā)安全有效的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑，也是臨床EN制劑領(lǐng)域或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。

沙蠶屬于藥食同源的海洋生物，也是魚蝦的天然飼料[9]。雙齒圍沙蠶具有補(bǔ)脾益胃、補(bǔ)血養(yǎng)血、利水消腫等功效。其營養(yǎng)成分豐富，氨基酸含量占干重的67.43%，脂肪酸含量占干重的14.24%，其中 EPA 含量為 6.53%，還含有 Cu、Sn、Se、Hg、As、I、Zn和Cd等多種微量元素[10-11]。沙蠶中含有的超氧化物歧化酶、纖維蛋白溶解酶、纖維酶原激活物、膠原酶等活性成分具有優(yōu)良的抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥和預(yù)防高血壓、消除動脈硬化等功效[12-13]。沙蠶蛋白中高比例的精氨酸和谷氨酰胺可通過維持免疫細(xì)胞的功能性完整來支持重癥患者免疫系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14-16]。沙蠶中含有的ω-3脂肪酸，能有效延遲炎癥反應(yīng)，預(yù)防自由基損傷[17]。

鑒于雙齒圍沙蠶的藥食同源特性和抗腫瘤等免疫調(diào)節(jié)作用，以雙齒圍沙蠶的營養(yǎng)成分為基礎(chǔ)，根據(jù)腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的配制要求和質(zhì)量指標(biāo)，將雙齒圍沙蠶作為EN制劑的蛋白質(zhì)來源，制備適用于早期肝癌前病變患者的EN制劑，研究其對肝癌前病變動物模型的營養(yǎng)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)和肝功能指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 雙齒圍沙蠶 （Perinereis Aibuhitensis），鹽城豐悅源釣餌有限公司提供；立適康營養(yǎng)配方粉，西安力邦臨床營養(yǎng)有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級ICR雄性小鼠72只，7周齡，體重30～35 g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK（滬）2013-0006。

1.1.3 主要試劑 二乙基亞硝胺 （DEN）：0.95 g/m，99 mL生理鹽水加1 mL DEN振蕩混勻?yàn)?%的DEN溶液（4℃保存），上海蒙昌儀器有限公司（批號：DD200068）；試劑盒：IL-2和 TNF-α 檢測試劑盒，上海博湖生物科技有限公司 （批號：201609）。

1.1.4 主要儀器 H1750臺式高速離心機(jī)，日本HITACHI；MiniPRESS-ⅡSF 壓片機(jī)，Rimek公司；SH-1000型酶標(biāo)儀，日本HITACHI；邁瑞（Mindray）全自動生化儀BS-180，深圳邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙齒圍沙蠶腸內(nèi)營養(yǎng)片劑的制備 將雙齒圍沙蠶分別用1%檸檬酸和10%食鹽水溶液高速旋轉(zhuǎn)洗滌，隨后，勻漿凍干磨成粉末，過40目篩制成沙蠶粉。雙齒圍沙蠶的營養(yǎng)成分分析見表1。

表1 雙齒圍沙蠶的營養(yǎng)成分分析Table1 Nutritional composition analysis of Perinereis aibuhitensis

以雙齒圍沙蠶為蛋白源，并添加精氨酸、L-谷氨酰胺、ω-3脂肪酸，以及復(fù)合維生素和復(fù)合礦物質(zhì)，用MiniPRESS-ⅡSF壓片機(jī)壓制成中心厚度0.8 mm的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑。

每100 g，所含熱量為1 968 kJ，其中蛋白質(zhì)供能比為20%、脂肪供能比為15%、碳水化合物供能比為65%。

1.2.2 小鼠早期肝癌前病變模型建立 建立小鼠早期肝癌前病變模型方法如下：清潔級ICR小鼠正常飼養(yǎng)1 w后禁食12 h，腹腔注射1%DEN溶液0.1 mL/10 g，1/w，連續(xù)注射 4 w，建立小鼠早期肝癌前病變模型。第4周末小鼠再次禁食12 h（只禁食不禁水），取肝臟做HE染色觀察其病理變化。

1.2.3 小鼠分組及腸內(nèi)營養(yǎng)支持 清潔級ICR小鼠 72 只，體重 30～35 g，雄性，正常飼養(yǎng) 1 w，購自上海西普爾必凱有限公司。將小鼠隨機(jī)分為沙蠶處理組1（A 60%雙齒圍沙蠶蛋白/總蛋白，質(zhì)量比）、沙蠶處理組2（B 40%雙齒圍沙蠶蛋白/總蛋白，質(zhì)量比）、沙蠶處理組3（C 20%雙齒圍沙蠶蛋白/總蛋白，質(zhì)量比）、陽性對照組（立適康）、空白組和對照組 （腹腔注射與DEN等體積的0.9%生理鹽水溶液），每組12只，分組情況如表2。

自首次注射12 h起，A組、B組和C組按1 320.06 kJ/kg/d給予不同取代度的雙齒圍沙蠶腸內(nèi)營養(yǎng)制劑 （2片/只/d），D組給予相同熱量的立適康腸內(nèi)營養(yǎng)制劑（2片/只/d）。E組和F組給予相同熱量的飼料。每組每晚21：00投予對應(yīng)食物，其它時間自由飲水。連續(xù)喂養(yǎng)4 w。其中，D組（立適康營養(yǎng)配方粉）每100 g粉劑含1 817 kJ能量，蛋白質(zhì)功能比為35%、脂肪功能比為19%、碳水化合物功能比為20%。

表2 各組處理情況表Table2 Processing table of each group

1.2.4 檢測指標(biāo)

1.2.4.1 小鼠形態(tài) 每天觀察各試驗(yàn)組小鼠進(jìn)食情況與體毛特征變化，每周記錄兩次小鼠體重變化和存活率。

1.2.4.2 營養(yǎng)指標(biāo) 分別在注射DEN溶液第1，2，3，4周禁食12 h后，心臟取血，加入1%EDTA二鈉溶液抗凝，3 000 r/min離心5 min，取上清液，用全自動生化分析儀測定血漿總蛋白（Total Protein，TP）和白蛋白（Albumin，Alb）濃度。

1.2.4.3 肝功能指標(biāo) 分別在注射DEN溶液第1，2，3，4 周禁食 12 h 后，心臟取血，加入 1%EDTA二鈉溶液抗凝，3 000 r/min離心5 min，取上清液，用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Transaminase，AST）濃度。

1.2.4.4 肝組織形態(tài) 小鼠注射DEN溶液第4周后，禁食12 h，取肝臟，以100 g/L甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，制成組織病理切片，光學(xué)顯微鏡下 （10×40倍）觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4.5 炎癥指標(biāo) 分別在注射DEN溶液第1，2，3，4周禁食12 h后，心臟取血，加入1%EDTA二鈉溶液抗凝，3 000 r/min離心5 min，取上清液，用ELISA試劑盒測定小鼠腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）水平。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)全部采用SPSS軟件處理，計(jì)量資料均用±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，規(guī)定P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動物形態(tài)及體重的變化

F組小鼠處理期間正常進(jìn)食和飲水，活動正常，背毛光澤柔順，無死亡。3 w后，除F組外，其余各組小鼠背毛凌亂，精神萎靡，食欲減退，活動減少。試驗(yàn)過程中每周稱取小鼠體重2次，體重變化如圖1。

圖1 給藥小鼠注射前后1月的體重變化Fig.1 Changes of body weight before and after administration of drug injection in mice in one month

各組小鼠在試驗(yàn)開始前D1體重沒有顯著差異，營養(yǎng)支持4 w后，各組小鼠體重明顯上升，從35.74 g 分別增加到 43.75，42.98，42.87，42.56，40.98和 46.63 g。

F組體重增加明顯高于A組、B組、C組、D組和E組（P＜0.01）；A組體重增加顯著高于E組（P＜0.05）；B組和C組之間小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；A組與B組和C組之間小鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；D28，A組比E組小鼠體重增加 61.49%（P＜0.05），見圖1。

D28后，F(xiàn)組小鼠無死亡，死亡率為0%，除F組外，其余各組每組死亡1只，死亡率為8.30%。

2.2 雙齒圍沙蠶EN制劑對DEN誘發(fā)小鼠肝癌前病變模型的營養(yǎng)指標(biāo)的影響

檢測肝癌前病變小鼠D7，D14，D21和D28的血漿TP和Alb含量，如圖2和圖3所示。

圖2 早期肝癌前病變小鼠TP指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of TP index in mice with early liver cancer

與E組相比A組、B組和C組的TP含量有所增加，D7，A組的TP與B組、C組、D組無顯著性差異 （P＞0.05），D14、D21和 D28，A 組的TP 顯著高于B組和C組（P＜0.05），分別高了12.37%，9.35%，8.73%和 3.30%，11.41%，9.76%；A 組的TP含量與E組相比，顯著升高30.32%。

與E組相比A組、B組和C組的Alb含量有所增加，D7，A組的Alb與B組、C組、D組無顯著性差異 （P＞0.05）；D14，A 組的Alb與 B組無顯著性差異（P＞0.05），與 C 組差異性顯著（P＜0.05），D21和D28，A組顯著高于B組、C組和D組 （P＜0.05）。D28，A組的Alb含量與E組相比，顯著高了13.68%。

圖3 早期肝癌前病變小鼠Alb指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of Alb index in mice with early liver cancer

2.3 雙齒圍沙蠶EN制劑對DEN誘發(fā)小鼠肝癌前病變模型的肝功能指標(biāo)（ALT和AST）的影響

檢測肝癌前病變小鼠D7，D14，D21和D28的血漿ALT和AST含量，如表3和表4所示。

A組的ALT顯著低于E組高于F組（P＜0.05），其中A組顯著低于B組和C組 （P＜0.05）；D7和D14，A組的顯著低于E組，分別低了39.50%和106.04%，D21和D28，A組的ALT水平比E組低47.76%（P＜0.05）和 83.75%（P＜0.05）。

A組的AST顯著低于E組高于F組（P＜0.05），其中 A組顯著低于 B組和 C組 （P＜0.05）；D7，A組和B組的AST顯著高于D組（P＜0.05），分別高了12.97%和5.12%，D14、D21和D28差異性不顯著；D28，A組的AST水平比E組低128.20%（P＜0.05）。

表3 早期肝癌前病變小鼠ALT水平（U/L）Table3 Changes of ALT level in mice with early liver cancer （U/L）

表4 早期肝癌前病變小鼠AST水平（U/L）Table4 Changes of AST level in mice with early liver cancer （U/L）

2.4 雙齒圍沙蠶EN制劑對DEN誘發(fā)小鼠肝癌前病變模型病理變化分析

在光學(xué)顯微鏡下 （10×40倍）觀察肝癌前病變小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，如圖4所示。

從組織切片圖可以觀察到，圖F小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰，胞漿紅染，圓形核居中，染色質(zhì)均勻，無顯著炎性細(xì)胞浸潤；圖E小鼠肝臟纖維增生條索完全分割肝小葉，形成假小葉，肝細(xì)胞排列紊亂，肝竇狹窄，肝細(xì)胞水腫、脂肪變性，胞漿郁膽，核大可見核內(nèi)包涵體，纖維間隔均勻纖細(xì)，可見大量巨噬細(xì)胞浸潤；圖A、圖B、圖C和圖D小鼠肝臟肝細(xì)胞變性和核異型性減輕，巨噬細(xì)胞浸潤減少，其中圖A炎癥最輕。

圖4 各組肝癌前病變小鼠肝組織形態(tài)學(xué)切片圖Fig.4 The histomophology of precancer tissue slice from rat live in each group

2.5 雙齒圍沙蠶EN制劑影響小鼠肝癌前病變模型炎癥指標(biāo)的變化

檢測肝癌前病變小鼠D7，D14，D21和D28的血漿TNF-α和IL-2含量，如圖5和圖6所示。

由圖5可知，A組的TNF-α水平顯著低于E組高于 F組（P＜0.05）。D14，A 組與 B 組的TNF-α 顯著低于 C組（P＜0.05），分別低了 5.39%和3.24%；D21和 D28，A組顯著低于 B組和 C組（P＜0.05），分別低了 6.17%，7.16%和 6.13%，7.49%，比 E 組顯著降低（P＜0.05），低了 23.36%和30.15%。

由圖6可知，A組的IL-2水平顯著高于E組低于F組（P＜0.05）。D7，A組和B組的IL-2顯著高于 C組（P＜0.05），分別高了 8.28%和 6.25%，與D 組無顯著性差異（P＞0.05）；D7、D14和 D28，A 組的IL-2顯著高于B組和C組。

圖5 早期肝癌前病變小鼠TNF-α指標(biāo)的變化Fig.5 Changes of TNF-α index in mice with early liver cancer

圖6 早期肝癌前病變小鼠IL-2指標(biāo)的變化Fig.6 Changes of IL-2 index in mice with early liver cancer

3 討論

惡性腫瘤的營養(yǎng)代謝表現(xiàn)為厭食、營養(yǎng)缺乏、體重下降等癥狀，宿主呈現(xiàn)惡液質(zhì)，特別是腫瘤與宿主爭奪能量和營養(yǎng)素，是導(dǎo)致死亡的主要原因[18-19]。因此，惡性腫瘤病人的合理營養(yǎng)支持受到普遍關(guān)注，腸內(nèi)營養(yǎng)制劑或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品得到快速發(fā)展。當(dāng)腫瘤病人處于應(yīng)激狀態(tài)或進(jìn)食狀態(tài)時，腸道功能受損使細(xì)菌和內(nèi)毒素入血而激活了巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α大量釋放[20-21]。早期腸內(nèi)營養(yǎng)支持可通過保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和功能完整，減少腸道內(nèi)毒素入血，從而降低體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放[22]。由于重癥患者機(jī)體易發(fā)生營養(yǎng)物質(zhì)的合成代謝障礙，所以提供合理充分的外源性營養(yǎng)物質(zhì)，能對腫瘤病人機(jī)體的合成代謝產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用[23]。

用DEN誘發(fā)小鼠肝癌模型是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的研究人類肝癌的一種理想動物模型，根據(jù)趙鵬等[24]用DEN建立大鼠肝癌前病變模型的方法，和毛文超等[25]用DEN建立小鼠肝癌前病變模型的方法，經(jīng)過改良，使用大劑量（100 mg/kg）的DEN，間隔1周持續(xù)處理4次，能制備成肝癌前病變小鼠模型。試驗(yàn)結(jié)果顯示，A組、B組、C組和D組小鼠肝臟病理組織切片鏡下觀察的癌變陽性率均低于E組，其中A組肝癌前病變改善最明顯。表明雙齒圍沙蠶EN制劑具有降低DEN誘導(dǎo)的小鼠早期肝癌的發(fā)生率和抑制癌變進(jìn)展的作用。

白蛋白和球蛋白組成血漿總蛋白，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成白蛋白，占血漿蛋白質(zhì)總量的40%～60%[26]。肝臟疾病患者蛋白的合成不足會導(dǎo)致白蛋白偏低，而總蛋白多種情況都會引起它的改變，輕微病變時總蛋白無顯著性降低，病情較重的肝硬化、肝癌會出現(xiàn)明顯的差異[27]。注射DEN小鼠在應(yīng)用沙蠶EN制劑4周后，TP、Alb含量都顯著高，其中A組的TP和Alb顯著高于D組；B組和C組的Alb與D組比較無顯著差異。試驗(yàn)過程中除了不同比例的沙蠶添加量，A組、B組、C組的營養(yǎng)配方組成完全相同，包括谷氨酰胺、精氨酸以及ω-3脂肪酸，說明EN制劑或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品在添加量范圍內(nèi)補(bǔ)充更高含量的沙蠶蛋白可降低肝癌患者高代謝反應(yīng)，促進(jìn)血漿蛋白質(zhì)的合成。

腫瘤患者抗感染能力減低，導(dǎo)致和促進(jìn)單核細(xì)胞合成及釋放TNF-α，同時，腫瘤患者體內(nèi)某些復(fù)合物也能促進(jìn)機(jī)體分泌TNF-α[28-29]。EN制劑通過刺激Peyer’s叢的M細(xì)胞，促進(jìn)SIgA分泌，維持腸道免疫功能，顯著降低TNF-α及C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平[30]。Jun Fan等[31]報道過與普通腸內(nèi)營養(yǎng)相比，強(qiáng)化型谷氨酰胺EN制劑能顯著降低體內(nèi)TNF水平（P＜0.05）。沙蠶中含有豐富的谷氨酰胺。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與攝入普通鼠糧組小鼠相比，給予沙蠶EN制劑支持組小鼠能明顯降低TNF值，這意味著炎癥反應(yīng)的緩解。與上述研究結(jié)果一致。從細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，因?yàn)榘┘?xì)胞分泌的大量免疫抑制因子可以抑制免疫細(xì)胞的活性，從而明顯抑制IL-2的產(chǎn)生及反應(yīng)性[32]。試驗(yàn)中沙蠶EN制劑支持組的IL-2與E組比較顯著升高，說明添加沙蠶的EN制劑可以緩解早期肝癌前病變小鼠炎癥反應(yīng)，較好改善其營養(yǎng)狀況。

ALT和AST是腫瘤病人肝臟重要指標(biāo)，如果肝臟功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，將導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，ALT和AST從細(xì)胞中釋放進(jìn)入血液循環(huán)[33]。試驗(yàn)結(jié)果顯示沙蠶EN制劑能夠明顯降低肝癌前病變小鼠ALT和AST水平，說明雙齒圍沙蠶EN制劑能減輕DEN對于小鼠肝臟的損傷，具有保護(hù)肝臟的功能。

我國EN制劑主要依靠進(jìn)口，許多優(yōu)質(zhì)海洋生物資源需要開發(fā)[34]。試驗(yàn)制備的雙齒圍沙蠶EN制劑能夠改善肝癌前病變小鼠的營養(yǎng)代謝狀況，抑制肝臟受損，減輕炎癥反應(yīng)，且雙齒圍沙蠶蛋白占制劑總蛋白60%時，營養(yǎng)功效最顯著，彌補(bǔ)了國內(nèi)海洋型生物EN制劑的空白。試驗(yàn)得出的結(jié)論也能為今后沙蠶或其它海洋生物來源的添加物應(yīng)用在特殊人群用腸內(nèi)營養(yǎng)特殊食品提供寶貴的參考價值。