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    群體感應(yīng)分子法尼醇對(duì)樺褐孔菌液體發(fā)酵過程中三萜及白樺脂酸含量的影響

    2020-01-02 03:00:10吳嘉南陳啟和
    中國食品學(xué)報(bào) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:孔菌白樺三萜

    李 豪 吳嘉南 陳啟和

    (浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 杭州 310058)

    樺褐孔菌(Inonotus obliquus),亦稱白樺茸,是一種生長在白樺樹上的藥用真菌,屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬。主要分布于俄羅斯、芬蘭等北緯40°~50°的地區(qū)和我國的黑龍江大興安嶺、吉林長白山一帶[1]。從16世紀(jì)以來,俄羅斯、波蘭、芬蘭等國家的民間就廣泛使用樺褐孔菌來治療各種疑難雜癥,如各種癌癥、心臟病和糖尿病等[2]。

    樺褐孔菌含有多糖、三萜等多種化合物。其中的三萜類化合物是由數(shù)個(gè)異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的物質(zhì)。天然的三萜類化合物的前體主要是鯊烯,已發(fā)現(xiàn)約200多種結(jié)構(gòu)[3]。三萜的藥理研究表明:三萜具有抗癌,抗炎,抗病毒,免疫調(diào)節(jié)保肝等多種活性[4]。白樺脂酸(Betulinic acid,BA),又名樺木酸,是三萜中非常重要的一種。近年來的研究表明,白樺脂酸具有諸多的生物活性,如抗腫瘤、抗 HIV[5]、抗炎[6]、抗菌、抗瘧疾等[7]。大量試驗(yàn)表明白樺脂酸具有廣泛的抗腫瘤活性,其能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,包括白血病細(xì)胞[8]、腦瘤[9]、神經(jīng)外胚層瘤[10]、前列腺癌[11]、卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、肺癌、結(jié)腸癌[14]以及宮頸癌[15]等細(xì)胞。白樺脂酸可以選擇性地殺死人類癌細(xì)胞而不殺傷健康細(xì)胞[16],同時(shí)還具有作用機(jī)制特異、分子質(zhì)量小、低毒性等優(yōu)點(diǎn),有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景,是一類很有潛力的藥物先導(dǎo)化合物。

    目前,從高等真菌中直接提取三萜,已報(bào)道的有從靈芝、樟芝[17]中提取,也有報(bào)道從樺褐孔菌[18]中提取,而從高等真菌中提取白樺脂酸鮮有報(bào)道,已知的僅有通過黃綠蜜環(huán)菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[19]。目前對(duì)樺褐孔菌的液體深層發(fā)酵主要集中在生物量、多糖和多酚的測(cè)定,對(duì)三萜及白樺脂酸的研究報(bào)道較少。之前從高等真菌中得到的三萜和白樺脂酸的產(chǎn)量非常低,希望找到一種更為高效的提高三萜和白樺脂酸產(chǎn)量的方法。

    最近的研究表明,法尼醇作為一種群體感知分子,可以通過促進(jìn)多糖生物合成和調(diào)節(jié)菌絲體形態(tài)來顯著增加云芝中的胞外多糖產(chǎn)量[20]。然而,目前對(duì)于法尼醇的研究主要集中在白色念珠菌[21],對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵過程的研究目前還沒有報(bào)道。本試驗(yàn)將主要探討法尼醇對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵過程中生物量、三萜和白樺脂酸產(chǎn)量的影響。

    1 材料和方法

    1.1 菌種、試劑

    樺褐孔菌 (Inonotus obliquus) 菌株 (編號(hào)CFCC 83414),中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

    白樺脂酸,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖浸出液 (PDB),杭州微生物試劑有限公司;法尼醇(95%),Aladdin公司;香草醛(99%),Aladdin公司;DMSO,Sigma-Aldrich公司;乙酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸(均為分析純);乙腈、甲醇(均為色譜純);麥麩,農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);甲酸(98%,色譜純),Aladdin公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Thermo Fisher Multiskan FC酶標(biāo)儀,美國;JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;離心機(jī)(DD-5M),湘儀離心機(jī)儀器有限公司;超聲波清洗器(JP-040S),深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;恒溫?fù)u床,上海知楚儀器有限公司;超凈工作臺(tái)(SJ-CJ-2FDQ),蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司;高效液相色譜(Agilent1100),安捷倫科技有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,邦西儀器科技有限公司;凍干機(jī),美國Labconco。

    1.3 方法

    1.3.1 培養(yǎng)基的制備

    1.3.1.1 固體培養(yǎng)基 將麩皮按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%加入水中,熬制0.5 h后用8層紗布過濾除去大顆粒,得到麩皮水浸提液;然后,加入PDA合成培養(yǎng)基(市售),混合均勻后,將其煮沸后分裝在玻璃管中,每管10 mL,之后在121℃下滅菌20 min。滅菌后擺斜面至斜面凝固。

    1.3.1.2 液體培養(yǎng)基 將麩皮按照5%(以水的體積計(jì))的比例加入水中,并且熬制半個(gè)小時(shí)后用8層紗布過濾除去大顆粒,得到麩皮水浸提液;然后加入PDB合成培養(yǎng)基(市售),混合均勻后,分裝在500 mL錐形瓶中,每瓶分裝100 mL,在121℃下滅菌20 min。

    1.3.2 菌種的活化與保藏 將樺褐孔菌CFCC 83414接種到斜面上,在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右,待其長滿整個(gè)斜面。每個(gè)月更新1次斜面。

    1.3.3 接種和發(fā)酵 每個(gè)搖瓶接種1塊1 cm2的樺褐孔菌。在25℃溫度下培養(yǎng),先靜置2~3 d,然后以100 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2~3 d,之后以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。

    1.3.4 法尼醇的加入 法尼醇配制:先配制成1 mol/L的儲(chǔ)備液,然后稀釋成50 mmol/L的工作濃度。稱取0.22236 g法尼醇,溶于1 mL的DMSO中,得到1 mol/L的儲(chǔ)備液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,然后稀釋20倍,得到50 mmol/L的工作液。在發(fā)酵液中分別添加0.1,0.2,0.3,0.6 mL的50 mmol/L的工作液,使發(fā)酵液中法尼醇的終濃度為 50,100,150,300 μmol/L。同時(shí)加入 1.2%的DMSO作為空白對(duì)照組。法尼醇或1.2%的DMSO均在正常發(fā)酵過程中的第6天加入。

    1.3.5 三萜的測(cè)定 胞內(nèi) (Intracellular triterpenoids,IT)三萜:樺褐孔菌菌絲經(jīng)去離子水洗滌、離心、收集,凍干至恒重,取適量菌絲按1g/50 mL,每個(gè)約0.4 g,加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇,用細(xì)胞破碎儀破碎,于60℃,400 W下提取1 h,并重復(fù)1次,合并上清液,定容后待測(cè)。其三萜含量(mg/g)采用香草醛-高氯酸法。

    總 IT 含量(mg/100 mL)=IT 含量(mg/g)×菌絲生物量(g/100 mL)

    胞外三萜 (Extracellular triterpenoids,ET)測(cè)定:將各菌株發(fā)酵液3 500 r/min離心20 min,收集上清液并定容100 mL(記為A溶液)。取一定體積A溶液 (V1mL),用3倍體積的水飽和正丁醇萃取2次,合并萃取液并減壓濃縮蒸干,用甲醇復(fù)溶并定容 5 mL,記為溶液B,其ET含量(mg/mL)采用香草醒-高氯酸方法測(cè)定。

    總ET含量 (mg/100 mL)=B溶液中ET含量(mg/mL)×100 mL/V1

    香草醛-高氯酸測(cè)定方法:取待測(cè)樣品溶液或樣品稀釋液0.1 mL于試管中,70℃加熱揮干溶劑,加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.5 mL,混勻后于60℃水浴中20 min,取出,置于冷水中15 min,最后加入冰醋酸5 mL,混勻,吸取200 μL于波長550 nm處測(cè)定吸光值。每個(gè)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

    三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 (以白樺脂醇為對(duì)照):稱5 mg白樺脂醇于離心管中,加10 mL無水乙醇,配成500 μg/mL的儲(chǔ)備液。用無水乙醇稀釋成200 μg/mL的工作液。取 200 μg/mL的白樺脂醇工作 液 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mL 于 試 管 中(對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度 10,20,40,60,80,100,120 μg/mL),之后按照香草醛-冰醋酸法測(cè)量。

    1.3.6 白樺脂酸含量的測(cè)定 胞內(nèi)BA:將得到的菌體超聲破碎儀破碎5次,每次1 min,加入等量的乙酸乙酯萃取,60℃,400 W下提取1 h,萃取2次。合并上層有機(jī)相,3 500 r/min離心20 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后用色譜純的甲醇溶解,0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾,RP-HPLC法檢測(cè)。

    胞外 BA:取 1.3.5 節(jié)中一定的體積 C(V3),加入等量的乙酸乙酯萃取,60℃,400 W下提取1 h。萃取2次,合并上層有機(jī)相,3 500 r/min離心20 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后用色譜純的甲醇溶解,0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾,RP-HPLC法檢測(cè)。

    采用反相液相色譜法(RP-HPLC),色譜檢測(cè)條件:色譜柱 Cosmosil (4.6 ID×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈/0.1%甲酸(體積比91/9);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長210 nm;柱溫 35℃;進(jìn)樣量20 μL;跑樣時(shí)間25 min,梯度洗脫。

    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣,在色譜檢測(cè)條件下測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積值(A),以峰面積值A(chǔ)為縱坐標(biāo),白樺脂酸的濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    試驗(yàn)組在發(fā)酵中期時(shí)加入法尼醇,對(duì)照組加入同樣濃度的DMSO。

    2 試驗(yàn)結(jié)果

    2.1 法尼醇對(duì)樺褐孔菌菌體生物量的影響

    法尼醇對(duì)樺褐孔菌生物量的影響如圖1所示。對(duì)照組菌體生物量最大,當(dāng)法尼醇的添加量從50 μmol/L 遞增到 300 μmol/L 時(shí),菌體的生物量呈遞減趨勢(shì)。150 μmol/L和300 μmol/L兩個(gè)濃度的法尼醇對(duì)菌絲的生物量的抑制效果相當(dāng)。加入法尼醇可抑制樺褐孔菌的生長,并呈濃度依賴關(guān)系。

    2.2 法尼醇對(duì)胞內(nèi)三萜的影響

    三萜是樺褐孔菌非常重要的一類次生代謝產(chǎn)物。法尼醇的濃度對(duì)胞內(nèi)三萜的影響如圖2所示。100 μmol/L和150 μmol/L法尼醇的添加量對(duì)應(yīng)的菌體中三萜的含量分別為14.95 mg/g和15.55 mg/g,與對(duì)照相比,各提高了11.2%和16.0%。50 μmol/L和 300 μmol/L的添加量對(duì)菌體中三萜含量的影響不大。從圖2可看出,隨著法尼醇濃度的增大,胞內(nèi)三萜呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),150 μmol/L的法尼醇對(duì)菌體中三萜的促進(jìn)作用最大。

    圖1 法尼醇濃度對(duì)菌體生物量的影響Fig.1 Effect of the concentration of farnesol on the mycelia’s biomass

    圖2 法尼醇濃度對(duì)胞內(nèi)三萜的影響Fig.2 Effect of the concentration of farnesol on intercellular triterpenoids

    2.3 法尼醇對(duì)胞外三萜的影響

    樺褐孔菌胞外的三萜含量研究較少。圖3為法尼醇濃度對(duì)胞外總?cè)坪康挠绊?。隨著法尼醇濃度的增大,胞外三萜呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),50 μmol/L的法尼醇對(duì)胞外三萜的促進(jìn)作用達(dá)到最大值,與對(duì)照相比,含量提高了約1倍。結(jié)合圖2 可知,添加 100 μmol/L和 150 μmol/L 法尼醇時(shí),三萜更多地保存在了胞內(nèi),胞外三萜的含量不是很高。

    2.4 法尼醇對(duì)胞內(nèi)BA的影響

    法尼醇濃度對(duì)菌體中BA含量的影響如圖4所示。法尼醇的添加量較低時(shí),對(duì)菌體中BA含量的提高作用不明顯。當(dāng)法尼醇的添加量增到150 μmol/L時(shí),菌體中BA的含量急劇增加,與對(duì)照相

    圖3 法尼醇濃度對(duì)胞外三萜的影響Fig.3 Effect of the concentration of farnesol on extracellular triterpenoids

    2.5 法尼醇對(duì)胞外BA的影響

    圖5所示為法尼醇的濃度對(duì)發(fā)酵液中BA濃度的影響。隨著法尼醇濃度的增大,發(fā)酵液中BA的濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)。在法尼醇添加量為 100 μmol/L,發(fā)酵液中 BA的質(zhì)量濃度最大,0.1395 μg/mL,與對(duì)照 0.0351 μg/mL 相比,提高了3倍。在法尼醇添加量為50,150,300 μmol/L時(shí),發(fā)酵液中BA的含量也有所提高,分別提高了21.6%,70.6%,14.8%。比,提高了4倍。當(dāng)法尼醇的添加量為300 μmol/L時(shí),菌體中BA的含量為41.0 μg/g,是對(duì)照的10倍。菌體中BA的含量隨法尼醇添加量的增加而增加。

    圖4 法尼醇濃度對(duì)菌體中BA含量的影響Fig.4 Effect of the concentration of farnesol on the content of BA in mycelia

    圖5 法尼醇濃度對(duì)發(fā)酵液中BA濃度的影響Fig.5 Effect of the concentration of farnesol on the concentration of BA in fermentation broth

    3 討論

    本研究結(jié)果表明,在樺褐孔菌發(fā)酵過程中,隨著法尼醇添加量的增加,菌體的生物量逐漸下降,即法尼醇的加入抑制菌體的生長。菌體中的三萜,發(fā)酵液中的三萜和BA隨著法尼醇添加量的增加,都呈先增后降的趨勢(shì),且對(duì)于這3個(gè)指標(biāo),法尼醇的最佳添加量分別為 150,50,100 μmol/L。而菌體中BA的含量隨著法尼醇添加量的增加而增加。

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