葡聚糖及其糖基化修飾對(duì)白鰱魚(yú)糜凝膠特性的影響

尤 娟 姜雪英 尹 濤 胡 楊 黃琪琳 熊善柏 *

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 武漢 430070

2 國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心 武漢 430070）

鰱魚(yú)是我國(guó)淡水魚(yú)中分布最為廣泛的魚(yú)類(lèi)，全國(guó)產(chǎn)量從1999年的306.2萬(wàn)t增長(zhǎng)到2016年的450.7萬(wàn)t[1]。由于鰱魚(yú)產(chǎn)量大且價(jià)格低廉，所以已成為淡水魚(yú)魚(yú)糜的主要加工原料。為防止魚(yú)糜在凍藏過(guò)程中發(fā)生冷凍變性，導(dǎo)致魚(yú)糜綜合品質(zhì)下降，一些糖及糖醇類(lèi)物質(zhì)被作為冷凍變性保護(hù)劑添加到魚(yú)糜中[2]。葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的中性多糖，具有甜度低、熱量小的特點(diǎn)，可代替蔗糖等高熱量糖而用于魚(yú)糜的抗凍保護(hù)。魯耀彬等[3]比較了葡聚糖和傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑對(duì)凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的冷凍保護(hù)效果，得出小分子質(zhì)量的葡聚糖對(duì)淡水魚(yú)及相關(guān)制品的冷凍保護(hù)效果較好。另有研究者[4-6]報(bào)道葡聚糖具有增強(qiáng)人體免疫力、抗輻射、抑菌等功能。余文熙等[7]在鯖魚(yú)魚(yú)丸中添加葡聚糖以增強(qiáng)其質(zhì)構(gòu)特性并起到防腐保鮮的效果。將葡聚糖添加在魚(yú)糜及其制品中具有多方面的優(yōu)勢(shì)。然而，加工魚(yú)糜制品的過(guò)程中需經(jīng)加熱等工序，在此過(guò)程中葡聚糖可與蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)。

糖基化反應(yīng)是由蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羰基發(fā)生的非酶促褐變的化學(xué)反應(yīng)[8]。葡聚糖與許多蛋白質(zhì)如乳清蛋白[9]、豬血蛋白[10]、大米蛋白[11]、蕎麥蛋白[12]的糖基化反應(yīng)對(duì)它們功能特性的影響已有較多的研究。在水產(chǎn)領(lǐng)域，張愛(ài)榮[13]、蘆晶等[14]、陳欣[15]及尤娟[16]等研究了糖基化反應(yīng)對(duì)魚(yú)肉肌原纖維蛋白溶解性、乳化性等功能特性的影響。然而葡聚糖的糖基化反應(yīng)對(duì)魚(yú)糜制品凝膠特性的影響還較有限。鄧海萍等[17]研究了3種電荷多糖添加物（殼聚糖、葡聚糖、卡拉膠）對(duì)鰱魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)的影響，沒(méi)有注意到發(fā)生的糖基化反應(yīng)以及該反應(yīng)對(duì)魚(yú)糜凝膠特性的影響。本文以白鰱魚(yú)糜為原料，研究葡聚糖在魚(yú)糜凝膠制備過(guò)程中的糖基化反應(yīng)程度及糖基化反應(yīng)對(duì)魚(yú)糜凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

新鮮鰱魚(yú)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。葡聚糖，分子質(zhì)量10 000 u，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。其它試劑均屬于分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 魚(yú)糜凝膠的制備

參考郭秀瑾等[18]的方法，將新鮮鰱魚(yú)脊背白肉采下后攪碎，加入4倍體積的冰水?dāng)嚢? min后靜置10 min，傾去液體，重復(fù)3次，得沉淀。再向沉淀中加入4倍體積0.5%NaCl溶液，傾去液體，重復(fù)兩次。將沉淀以5 000 r/min離心10 min，得到魚(yú)糜，控制魚(yú)糜含水量在80%。將魚(yú)糜放入斬拌機(jī)中斬拌，依次進(jìn)行空斬2 min、加入一定比例的葡聚糖后斬2 min，再加入2.5%鹽斬拌3 min后制得魚(yú)糜與葡聚糖混合物，其中葡聚糖的添加量按照肌原纖維蛋白干基質(zhì)量的0倍、0.5倍、1倍、2倍加入。將混合物抽真空除去空氣后利用制腸機(jī)灌進(jìn)腸衣，再將不同糖比例的腸放入40℃分別反應(yīng)0，2，4，6，8 h，然后在 40℃水浴 1 h 后再于 90℃水浴0.5 h制成魚(yú)糜凝膠，冷藏備用。

1.3 pH的測(cè)定

將上述樣品的初始pH調(diào)至8.2，糖基化反應(yīng)的發(fā)生會(huì)引起體系pH的變化，故采用梅特勒pH計(jì)測(cè)定糖基化反應(yīng)后體系的pH。

1.4 反應(yīng)中間產(chǎn)物和褐變程度的測(cè)定

將糖基化反應(yīng)后樣品加一定量水搗碎后以5 000 r/min離心10 min，取上清液，利用721型-紫外分光光度計(jì)分別在420 nm和294 nm下測(cè)定其吸光值。294 nm下的吸光值即為糖基化反應(yīng)中有紫外吸收的中間產(chǎn)物，420 nm下的吸光值即為糖基化反應(yīng)的褐變程度。

1.5 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考郭秀瑾等[18]的方法，將制備好的魚(yú)糜凝膠切成高2 cm的柱狀體，用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀的穿刺模式進(jìn)行測(cè)定。

1.6 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考馬瑤蘭等[19]的方法，采用高倍掃描電鏡，在10 000倍的放大倍數(shù)下，觀察魚(yú)糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)根據(jù)要求做3個(gè)或5個(gè)平行，應(yīng)用Excel（2012）作圖。對(duì)采集的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析 （SAS 8.0，Institute Inc.，Cary，NC，USA）進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)時(shí)間和糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠pH的影響

通過(guò)圖1可以看出，未加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠pH值在反應(yīng)2 h后，沒(méi)有顯著性降低；而添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠pH值隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步顯著降低（P＜0.05）。糖基化反應(yīng)是由蛋白質(zhì)上游離的氨基與糖的羰基反應(yīng)，氨基被消耗且反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了甲酸、乙酸等有機(jī)酸，因此反應(yīng)的pH逐步降低[16]。由此可以說(shuō)明魚(yú)糜和葡聚糖的混合物在40℃下發(fā)生了糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致整個(gè)體系的pH逐步降低，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖基化反應(yīng)程度越高。當(dāng)葡聚糖添加比例越大，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后魚(yú)糜凝膠pH值降低的越多，說(shuō)明糖基化反應(yīng)越顯著。You等[20]在研究5種糖（木糖、半乳糖、葡萄糖、葡聚糖、低聚異麥芽糖）與水溶性蛋白的糖基化反應(yīng)時(shí)得出了相一致的結(jié)果。由此可以得出，反應(yīng)時(shí)間與葡聚糖添加比例對(duì)糖基化反應(yīng)均有影響。在試驗(yàn)條件內(nèi)，加熱時(shí)間的增長(zhǎng)和加糖比例的增大均會(huì)加速糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。加糖量越高，游離的可被利用的羰基就越多，反應(yīng)物接觸越多；加熱時(shí)間越長(zhǎng)，基團(tuán)反應(yīng)就越徹底，糖基化反應(yīng)就越劇烈[8]。

2.2 糖基化反應(yīng)時(shí)間和糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠褐變程度和中間產(chǎn)物的影響

420 nm吸光值表征了Maillard反應(yīng)中有色基團(tuán)的生成量，使體系呈現(xiàn)出褐色，是反應(yīng)Maillard反應(yīng)進(jìn)程的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。圖2反應(yīng)了糖基化反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖添加比例對(duì)魚(yú)糜凝膠褐變程度的影響。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)有添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠在420 nm下的吸光值沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠在420 nm下的吸光值均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。對(duì)于蛋白與葡聚糖比例分別為2∶1和1∶1的魚(yú)糜凝膠，其420 nm吸光值在前4 h內(nèi)顯著性升高（P＜0.05），而后沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。可能是蛋白和葡聚糖在前4 h反應(yīng)劇烈，4 h后可以反應(yīng)的底物逐漸減少，反應(yīng)減慢，褐變速率變小。而蛋白與葡聚糖比例為1∶2的魚(yú)糜凝膠，420 nm下吸光值顯著上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到8 h后吸光值略有下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，糖基化反應(yīng)進(jìn)入第3個(gè)階段，生成了不易溶解的產(chǎn)物[21]，導(dǎo)致吸光值略有降低。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，2∶1和1∶1兩個(gè)比例魚(yú)糜凝膠的吸光值沒(méi)有顯著性差異，而蛋白和糖的比例為1∶2時(shí)魚(yú)糜凝膠吸光值高于其它比例的凝膠，說(shuō)明1∶2比例的魚(yú)糜凝膠褐變程度較大，糖基化反應(yīng)程度較高。

圖1 糖基化反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠pH的影響Fig.1 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on pH of surimi gel

圖2 糖基化反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠褐變程度的影響Fig.2 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the browning of surimi gel

在糖基化反應(yīng)過(guò)程中，氨基酸和還原糖反應(yīng)使得有紫外吸收峰的物質(zhì)生成，且該物質(zhì)可在294 nm下被檢測(cè)到，因此可以用294 nm的吸光值來(lái)監(jiān)測(cè)糖基化反應(yīng)的程度[16]。如圖3所示，糖基化反應(yīng)時(shí)間為0 h的4個(gè)不同比例樣品的吸光值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)有添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠在294 nm下的吸光值沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠在294 nm下的吸光值均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。對(duì)于蛋白與葡聚糖比例為2∶1和1∶1的魚(yú)糜凝膠，其294 nm吸光值在前2 h內(nèi)顯著性升高（P＜0.05），而后沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。而蛋白與葡聚糖比例為1∶2的魚(yú)糜凝膠，294 nm下吸光值顯著上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到8 h后吸光值略有下降。該趨勢(shì)與其420 nm吸光值變化相一致，同樣說(shuō)明在2∶1和1∶1的比例下葡聚糖2 h內(nèi)可能反應(yīng)消耗。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，糖基化的魚(yú)糜凝膠吸光值顯著高于未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠，且2∶1和1∶1兩個(gè)比例魚(yú)糜凝膠的吸光值沒(méi)有顯著性差異，而蛋白和糖的比例為1∶2時(shí)魚(yú)糜凝膠吸光值高于其它比例的凝膠，說(shuō)明1∶2的樣品糖基化反應(yīng)最為活躍。

圖3 糖基化反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the content of intermediate products of glycosylation in surimi gel

2.3 反應(yīng)時(shí)間和糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響

葡聚糖添加量和糖基化反應(yīng)時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)有添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠的破斷力明顯降低（P＜0.05），當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至6 h后其破斷力沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）；而添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠的破斷力在反應(yīng)8 h內(nèi)均沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。說(shuō)明40℃前先加熱魚(yú)糜凝膠會(huì)使得魚(yú)糜凝膠的硬度降低，但葡聚糖的添加有利于增強(qiáng)魚(yú)糜凝膠的熱穩(wěn)定性。álvarez等[10]在研究豬血蛋白通過(guò)葡聚糖糖基化修飾時(shí)也得出豬血蛋白的熱穩(wěn)定性和乳化活性都得到提高，而凝膠強(qiáng)度比未糖基化的豬血蛋白降低了50%。這可能是因?yàn)槠暇厶亲璧K了蛋白與蛋白之間的作用，保護(hù)了蛋白的初始結(jié)構(gòu)，葡聚糖的存在降低了溶解蛋白溶液的流動(dòng)性，使得蛋白處在一種相對(duì)緊湊穩(wěn)定的狀態(tài)，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)[22]。在0～8 h的反應(yīng)時(shí)間段里，添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠破斷力遠(yuǎn)小于未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠破斷力，并且隨著葡聚糖添加比例的增加，魚(yú)糜凝膠在各個(gè)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的破斷力均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。

破斷力反映的是魚(yú)糜凝膠的硬度，而凹陷深度則可反映魚(yú)糜凝膠的彈性[19]。由圖4（b）可以看出，隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠的凹陷深度緩慢降低，當(dāng)加熱時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)顯著降低；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠凹陷深度沒(méi)有顯著性差異。在反應(yīng)前4 h內(nèi)，添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠凹陷深度顯著低于相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)下未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠（P＜0.05），在反應(yīng)后 4 h，比例為 2∶1 添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠凹陷深度相對(duì)較大。說(shuō)明葡聚糖的添加和加熱會(huì)減弱魚(yú)糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，可能是因?yàn)槠暇厶呛汪~(yú)糜蛋白的氨基反應(yīng)，減少了TGase促進(jìn)的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)形成的可能。另一方面，葡聚糖使蛋白分子與蛋白分子之間存在較大的空間位阻，降低了二硫鍵或蛋白分子疏水相互作用促進(jìn)的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的可能[10]。

由圖4（c）所示，葡聚糖添加和反應(yīng)時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響與破斷力的變化趨勢(shì)較一致。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度顯著性降低（P＜0.05），反應(yīng)6 h后，沒(méi)有顯著性變化；而添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度在反應(yīng)的8 h內(nèi)均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。在糖基化反應(yīng)的前4 h內(nèi)，隨著葡聚糖的添加比例的增大，魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度顯著性降低（P＜0.05）；在反應(yīng)的后4 h內(nèi)，葡聚糖添加比例為2∶1的魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度沒(méi)有顯著性變化，且高于未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度。說(shuō)明葡聚糖的添加會(huì)導(dǎo)致魚(yú)糜形成凝膠的能力下降，凝膠強(qiáng)度下降的原因是葡聚糖與魚(yú)糜蛋白進(jìn)行糖基化反應(yīng)，反應(yīng)活性越強(qiáng)，對(duì)于體系凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變就越大，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)弱化，這一結(jié)果與María等[23]研究的結(jié)果類(lèi)似，即糖基化反應(yīng)活性最高的多糖與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合凝膠最弱。

圖4 反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力（a）、凹陷深度（b）及凝膠強(qiáng)度（c）的影響Fig.4 Effects of reaction time and sugar ratio on the breaking force （a），penetration distance （b） and gel strength （c） of surimi gel

2.4 反應(yīng)時(shí)間和糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

魚(yú)糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)是影響其凝膠強(qiáng)度的重要因素。圖5顯示了不同葡聚糖添加量及糖基化反應(yīng)時(shí)間下所制得的魚(yú)糜凝膠的掃描電子顯微鏡圖。由圖5可知，在反應(yīng)前2 h內(nèi)，未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠具有較完整且致密、規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，反應(yīng)4 h后魚(yú)糜凝膠變得粗糙、不均勻，甚至出現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)時(shí)間的加熱不利于魚(yú)糜形成較好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞與肌球蛋白重鏈被蛋白酶水解有關(guān)[18]。添加了葡聚糖的魚(yú)糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)沒(méi)有較完整致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。葡聚糖添加比例為2∶1的魚(yú)糜凝膠有較稀疏的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠的孔徑稍有變大，有細(xì)小的團(tuán)聚體出現(xiàn)在稀疏的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)上；葡聚糖添加比例為1∶1和1∶2的魚(yú)糜凝膠從反應(yīng)開(kāi)始就形成了細(xì)小且均勻的小球體并聚集成團(tuán)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，聚集團(tuán)沒(méi)有顯著差異，且沒(méi)有形成有規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

魚(yú)糜形成凝膠的過(guò)程分為兩個(gè)階段，第1階段是加熱魚(yú)糜蛋白質(zhì)使其發(fā)生一定程度的變性和伸展，肌球蛋白尾部解螺旋，暴露的一些氫鍵和疏水基團(tuán)通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，第2階段是各暴露的巰基、游離氨基等功能基團(tuán)之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，于是產(chǎn)生了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8]。未添加葡聚糖的魚(yú)糜凝膠在加熱過(guò)程中經(jīng)歷這兩個(gè)階段，然而隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，由于魚(yú)糜凝膠中內(nèi)源酶的作用使魚(yú)糜凝膠劣化[24]，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)局部呈片狀結(jié)構(gòu)，局部有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而添加了葡聚糖后，在加熱的情況下，魚(yú)糜蛋白和葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，將魚(yú)糜蛋白上的游離氨基基團(tuán)消耗，糖基化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生甲酸、乙酸等中間產(chǎn)物降低環(huán)境的pH值，影響凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。另一方面，葡聚糖上含有較多的游離羥基基團(tuán)，易于與魚(yú)糜蛋白質(zhì)伸展暴露的基團(tuán)形成氫鍵等，從而占用了膠凝作用本身應(yīng)該形成氫鍵的位點(diǎn)，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)無(wú)法正常形成，從而降低了蛋白質(zhì)的凝膠性質(zhì)。

圖5 反應(yīng)時(shí)間和葡聚糖比例對(duì)魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of reaction time and sugar ratio on the microstructure of surimi gel

3 結(jié)論

未添加葡聚糖制備的魚(yú)糜凝膠（CK組）的pH、凝膠強(qiáng)度及微觀網(wǎng)絡(luò)致密度隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低。與CK組相比，葡聚糖添加量越多，制備的魚(yú)糜凝膠的凝膠特性越弱，但隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，其凝膠特性沒(méi)有顯著性差異。因此，葡聚糖在魚(yú)糜加熱過(guò)程中與魚(yú)糜蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)，且葡聚糖的添加降低了魚(yú)糜的凝膠特性，但增強(qiáng)了魚(yú)糜凝膠在加熱過(guò)程中的穩(wěn)定性。