熱處理?xiàng)l件對(duì)南極磷蝦酶活性的影響

王凱欣，歐陽杰，沈 建，談佳玉，馬田田

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200120;2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092)

南極磷蝦(Antarctickrill)是一種生活在南極洲水域的磷蝦，單種資源數(shù)量位居地球生物前列，物種生長周期短，資源量豐富，在有序合理的開發(fā)下,能夠創(chuàng)造出巨大而有效的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1- 3]。中國在2009年開始南極磷蝦捕撈，然而相對(duì)國外漁業(yè)發(fā)達(dá)國家，存在技術(shù)落后、船載精深加工能力低等問題。目前中國正在研究南極磷蝦船載設(shè)備的快速分離與加工技術(shù)，磷蝦捕獲后在船上直接進(jìn)行蝦粉制品加工[4]，南極磷蝦粉作為主要產(chǎn)品之一，其工藝流程為：原料→蒸煮→離心脫水→一次干燥→二次干燥→粉碎→包裝→成品[5- 7]。南極海域寒冷、嚴(yán)酷的生存環(huán)境形成了南極磷蝦酶獨(dú)特的酶學(xué)特性,體內(nèi)存在著獨(dú)特、高效的酶活體系[8]，較高的酶活性導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)受到不同程度的破壞和損失，成為現(xiàn)階段加工過程中的主要難點(diǎn)之一。在蝦粉加工的初始蒸煮階段進(jìn)行有效滅酶，成為提高品質(zhì)必要的處理步驟。

南極磷蝦體內(nèi)存在著較高活性的酶系，該酶系具有迅速降解南極磷蝦體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的能力[9]，這種現(xiàn)象對(duì)南極磷蝦的加工生產(chǎn)有著一定的影響。目前，國內(nèi)外尚未有針對(duì)蒸煮階段熱處理?xiàng)l件對(duì)南極磷蝦酶的影響的研究，相關(guān)研究主要集中在分離純化和酶學(xué)性質(zhì)等方面，如向宇等[10]研究了南極磷蝦胰蛋白酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及其生物活性；陳怡炫等[11]研究蛋白酶抑制劑的開發(fā)等。

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，研究蒸煮階段加熱溫度、加熱時(shí)間、顆粒大小對(duì)磷蝦多酚氧化酶、蛋白酶、脂肪酶的影響，旨在探究熱處理?xiàng)l件與南極磷蝦酶活性之間的變化規(guī)律，以期得到高效的蒸煮滅酶條件，降低由于酶活較高而導(dǎo)致品質(zhì)受損的風(fēng)險(xiǎn)，為南極磷蝦粉船載加工設(shè)備的熱處理?xiàng)l件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦，2018年捕撈，貯藏于-20℃冷庫中備用，購于中國水產(chǎn)有限公司；L- 脯氨酸、酪氨酸、福林試劑，生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二酚、干酪素(化學(xué)純試劑)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉二水、十二水合磷酸氫二鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、鹽酸、異丙醇、95 %乙醇(分析純試劑)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； Tris、阿拉伯膠、對(duì)硝基苯酚、硝基苯酚棕櫚酸酯(分析純試劑)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

UV- 2204PC紫外可見分光光度儀，上海精密儀器有限公司；GTR16- 2 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；DK- S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QV- 1530蒸煮鍋，浙江愛仕達(dá)電器股份有限公司；FSH- 2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，方科儀器有限公司；HT- 9815熱電偶溫度計(jì)，鴻泰儀表有限公司。

1.2 原材料處理

取冷凍南極磷蝦進(jìn)行常溫流水解凍，解凍完全后在0 ℃冰箱中瀝干水分備用。采用蒸汽加熱與隔水加熱相組合的方式，稱取磷蝦50 g整蝦放置于小燒杯中，將熱電偶溫度計(jì)探頭浸沒在磷蝦中，達(dá)到目標(biāo)溫度后迅速取出，置于恒溫水浴鍋中在同樣溫度保溫加熱；熱加工處理結(jié)束后按蝦與緩沖液的比例為1∶5(g/mL)加入事先預(yù)冷的磷酸緩沖液，在高速勻漿機(jī)中勻漿后于0 ℃冰箱中靜置4 h；將勻漿液于0 ℃下10 000 r/min冷凍離心30 min，離心后取上清液即為粗酶液。

1.3 測定方法

1.3.1 多酚氧化酶活性測定

采用L- 脯氨酸- 兒茶酚分光光度法[12- 14]，以兒茶酚為底物，將2.2 mL、pH 7.2預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液，0.2 mL、0.5 mol/L的L- 脯氨酸和兒茶酚依次加入比色皿中，最后加入0.2 mL酶液，迅速搖勻，37 ℃條件下水浴10 min，在波長530 nm處比色[15- 16]。多酚氧化酶活力定義[17]：在37 ℃、pH 7.2、波長530 nm條件下，以吸光度每分鐘改變0.001為一個(gè)酶活力單位U。

1.3.2 蛋白酶活性測定

參照國標(biāo)SB/T 10317—1999[17]及楊英等[19]的方法略微修改，每管內(nèi)加入1 mL酶液、2 mL預(yù)熱的1 %酪蛋白溶液，在37 ℃恒溫水浴中保溫10 min，取出后立即加入2 mL三氯乙酸，迅速搖勻，靜置使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心(10 000 r/min)15 min，取上清液于另外測定管內(nèi)，每管加入1 mL上清液、5 mL碳酸鈉溶液、1 mL福林試劑，搖勻置于水浴保溫發(fā)色20 min后于660 nm進(jìn)行吸光值測定[19]。蛋白酶活力定義[21]：在37 ℃測定條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位U。

1.3.3 脂肪酶活性測定

參照HUBERT[22]的方法略微修改，稱取3 mg硝基苯酚棕櫚酸酯(p- NPP)溶于1 mL異丙醇中作為底物溶液，用pH 8.0、0.05 mol/L的Tris- HCL緩沖液配制成5%質(zhì)量濃度的阿拉伯膠作為緩沖液；取100 μL底物溶液和2.6 mL緩沖液混合均勻后，加入1 mL、0.05 mol/L、pH 8.0的Tris- HCL溶液，混合均勻，37 ℃恒溫水浴中預(yù)熱2 min；加入300 μL酶液，在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，立即加入95%乙醇終止反應(yīng)，10 000 r/min離心3 min后于410 nm處測定吸光值。脂肪酶活力單位定義：在37 ℃測定條件下，樣品水解硝基苯酚棕櫚酸酯(p- NPP)每分鐘生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量，以U表示。

1.4 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

1.4.1 熱處理?xiàng)l件對(duì)南極磷蝦酶的影響

取整蝦蒸煮，在不同加熱溫度(75 ℃、85 ℃、95 ℃)的加熱條件下，觀察多酚氧化酶、蛋白酶和脂肪酶與加熱時(shí)間的變化規(guī)律。

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)加熱溫度對(duì)南極磷蝦酶的影響。固定加熱時(shí)間為2.5 min，整蝦蒸煮，加熱溫度設(shè)置為35 ℃，45 ℃，55 ℃，65 ℃，75 ℃，85 ℃，95 ℃，探究加熱溫度對(duì)南極磷蝦酶活性的影響。

(2)加熱時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶的影響。固定加熱溫度為85 ℃，整蝦蒸煮，加熱時(shí)間設(shè)置為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5和5 min，探究加熱時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶活性的影響。

(3)顆粒度大小對(duì)南極磷蝦酶的影響。固定加熱溫度為85 ℃，加熱時(shí)間為2.5 min，南極磷蝦顆粒規(guī)格(指圓柱形顆?？v長)設(shè)置為3、2、1、0.8、0.6、0.4和0.2 cm，探究顆粒規(guī)格對(duì)南極磷蝦酶活性的影響。

1.4.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)比單因素試驗(yàn)中的加熱溫度、加熱時(shí)間和顆粒規(guī)格對(duì)南極磷蝦多酚氧化酶、蛋白酶和脂肪酶活性的影響，選擇最優(yōu)水平范圍，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶的影響

由圖1可知，南極磷蝦酶活性在3個(gè)不同加熱溫度下，均隨著加熱時(shí)間的增加而降低，且溫度越高酶活性越低，但3個(gè)溫度在5 min內(nèi)均不能使南極磷蝦酶完全失活，這與向宇[9]研究的溫度對(duì)南極磷蝦酶促反應(yīng)速率的影響結(jié)果相似。由多酚氧化酶的變化曲線可知，熱處理?xiàng)l件為85 ℃、2.5 min和85 ℃、3.5 min時(shí)的多酚氧化酶活性均低于加熱時(shí)間為95 ℃、0.5 min和95 ℃、1.5 min時(shí)的活性。由此可知，85 ℃較長時(shí)間的熱處理?xiàng)l件滅酶效果優(yōu)于95 ℃較短時(shí)間的條件。蛋白酶在85 ℃時(shí)滅酶程度接近于95 ℃時(shí)的滅酶條件。脂肪酶在95 ℃時(shí)呈現(xiàn)出不規(guī)律的變化趨勢，這可能是由于高溫導(dǎo)致脂肪酶的變性。因此，85 ℃的加熱溫度優(yōu)于95 ℃，同時(shí)考慮到高溫對(duì)磷蝦成分的影響，設(shè)置85 ℃的加熱條件較適宜。

圖1 加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)多酚氧化酶、蛋白酶和脂肪酶的影響Fig.1 Effects of heating temperature and heating time on polyphenol oxidase,protease and lipase

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 熱處理過程中加熱溫度對(duì)南極磷蝦酶的影響

由圖2可知，在35 ℃～55 ℃內(nèi)，多酚氧化酶活性隨著加熱溫度的升高而升高，55 ℃時(shí)活性最大，溫度高于55 ℃時(shí)多酚氧化酶與加熱溫度之間呈現(xiàn)連續(xù)下降的關(guān)系。

圖2 加熱溫度對(duì)南極磷蝦酶的影響Fig.2 Effects of heating temperature on Antarctic krill enzyme

蛋白酶活性在35 ℃～ 45 ℃范圍隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃后不斷降低。陳怡炫[11]在南極磷蝦蛋白酶研究中也發(fā)現(xiàn)此趨勢。在整個(gè)加熱溫度變化的影響下，脂肪酶活性變化較小，只有小范圍的波動(dòng)。綜合考慮3種酶受溫度影響的變化，確定正交試驗(yàn)的加熱溫度水平為75 ℃、85 ℃、95 ℃。莊志凱[23]在研究凡納濱對(duì)蝦蝦頭內(nèi)源酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，蝦體內(nèi)脂肪酶在達(dá)到60 ℃之后就會(huì)變性失活，導(dǎo)致酶活力降低。

2.2.2 熱處理過程中加熱時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶的影響

由圖3可知，南極磷蝦酶活性隨著時(shí)間的增加而不斷降低。

圖3 加熱時(shí)間對(duì)南極磷蝦酶的影響Fig.3 Effects of heating time on Antarctic krill enzyme

脂肪酶的活性隨時(shí)間變化的規(guī)律不明顯，呈現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是：南極磷蝦體內(nèi)的脂肪酶含量較少，活性較低，導(dǎo)致加熱時(shí)間的變化對(duì)脂肪酶酶活影響不明顯；隨著加熱時(shí)間的延長，南極磷蝦體內(nèi)的脂肪發(fā)生了氧化分解，此時(shí)脂肪酶的活性并不會(huì)對(duì)脂肪含量產(chǎn)生較大的作用。有研究表明，脂肪酶在較高溫度下酶活性下降緩慢，可能與酶對(duì)溫度的適應(yīng)性有關(guān)[24]。這種適應(yīng)性導(dǎo)致當(dāng)熱處理溫度為85 ℃時(shí)，隨著時(shí)間的增加脂肪酶變化呈現(xiàn)較小波動(dòng)。據(jù)此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的加熱時(shí)間因素水平為2.5 min、3.5 min、4.5 min。

2.2.3 熱處理過程中顆粒規(guī)格對(duì)南極磷蝦酶的影響

由圖4可知，當(dāng)顆粒規(guī)格為0.4 cm時(shí)，多酚氧化酶、蛋白酶和脂肪酶3種酶活性均達(dá)到較低的水平。

圖4 顆粒大小對(duì)南極磷蝦酶的影響Fig.4 Effects of particle size on Antarctic krill enzyme

從圖中可以看出，當(dāng)顆粒規(guī)格小于1 cm時(shí)，南極磷蝦酶的活性低于顆粒規(guī)格大于1 cm時(shí)的活性。此現(xiàn)象說明在熱加工處理中，采用不同程度的切割措施(如刮板式加熱對(duì)磷蝦進(jìn)行破碎)有助于降低南極磷蝦體內(nèi)酶活性。這可能是因?yàn)殡S著顆粒規(guī)格的降低，南極磷蝦蝦肉直接暴露在高溫下的接觸面積不斷擴(kuò)大，含有較多酶活性的部位直接受到高溫的作用，導(dǎo)致其酶活降低。這與馬田田[25]通過增加物料受熱面積來影響南極磷蝦營養(yǎng)成分的結(jié)果相似。綜合考慮，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的顆粒規(guī)格水平設(shè)為0.4 cm、0.6 cm和1 cm。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)包括3個(gè)因素，每個(gè)因素包括3個(gè)水平(表1)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定每種酶高效滅酶的熱處理?xiàng)l件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and levels

由正交試驗(yàn)結(jié)果表1～3顯示，方案A2B1C3為多酚氧化酶正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合，該方案不包含在正交表排出的試驗(yàn)方案中，應(yīng)與正交表中最優(yōu)試驗(yàn)方案A3B1C3作對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)。每組方案設(shè)20個(gè)重復(fù)，得到A2B1C3滅酶效率為(71.32±0.10)%，A3B1C3方案滅酶效率達(dá)到(72.92±0.10)%。兩組試驗(yàn)方案滅酶效率相差較小，在提高效率、降低能耗的綜合考慮下，確定最佳正交方案應(yīng)為A2B1C3。張琥[26]在馬鈴薯滅酶工藝優(yōu)化試驗(yàn)中表明馬鈴薯片中多酚氧化酶相對(duì)活性低于35%時(shí)，基本不會(huì)引起酶促褐變反應(yīng)。同理可得，A1B2C2為蛋白酶正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合，A1B1C3為脂肪酶正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合，方差分析表明A、B、C因素對(duì)脂肪酶滅活均無顯著影響。

2.4 最佳滅酶條件

通過3組正交試驗(yàn)結(jié)果分析(表4)，顆粒規(guī)格對(duì)多酚氧化酶、蛋白酶的酶活性影響均顯著，加熱時(shí)間對(duì)多酚氧化酶的酶活性影響顯著，加熱溫度對(duì)南極磷蝦酶活性的影響均不顯著。因多酚氧化酶活性顯著性大于蛋白酶和脂肪酶的酶活性，在顆粒度0.6 cm與0.4 cm差異較小的情況下，選擇以多酚氧化酶滅酶顆粒度0.4 cm；加熱時(shí)間和加熱溫度在2.5 min與3.5 min、75℃與85℃之間，考慮到對(duì)多酚氧化酶的顯著性以及節(jié)約能耗、提高生產(chǎn)效率等因素，選擇2.5 min、85℃較適宜，得到南極磷蝦酶最佳滅酶條件為加熱溫度85℃、加熱時(shí)間2.5 min、顆粒規(guī)格0.4 cm。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，每組設(shè)20個(gè)重復(fù)，得到多酚氧化酶、蛋白酶和脂肪酶的平均滅酶效率分別為(71.32±0.10)%、(68.42±0.10)%和(65.19±0.10)%，可明顯改善南極磷蝦酶在加工過程中的影響。本文加工中抑制酶活性的方法主要采用物理方法，因化學(xué)抑制劑通常易引起食品安全問題，但也有如杭虞杰[27]等采用大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)南極磷蝦類胰蛋白酶的抑制動(dòng)力學(xué)的研究，未來有望將化學(xué)與物理方法相結(jié)合進(jìn)行研究，會(huì)有較好的前景。

表2 南極磷蝦酶正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of Antarctic krill enzyme

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

注：表中“*”表示具有顯著性；下標(biāo)1表示多酚氧化酶；下標(biāo)2表示蛋白酶；下標(biāo)3表示多酚氧化酶

表4 南極磷蝦酶正交試驗(yàn)分析比較Tab.4 Comparison of orthogonal test analysis of Antarctic krill enzyme

3 結(jié)論

熱處理?xiàng)l件對(duì)多酚氧化酶影響顯著，對(duì)蛋白酶次之，對(duì)脂肪酶影響不顯著。南極磷蝦酶的總體活性隨著加熱溫度的升高，呈現(xiàn)先升高后逐漸下降的趨勢；隨著加熱時(shí)間的增長呈現(xiàn)不斷下降的趨勢；顆粒規(guī)格小于1 cm時(shí)的總體酶活普遍低于顆粒規(guī)格大于1 cm時(shí)的總體酶活。通過正交試驗(yàn)得到南極磷蝦酶的最佳滅酶條件為加熱溫度85 ℃、加熱時(shí)間2.5 min、顆粒規(guī)格0.4 cm，使用此熱處理?xiàng)l件進(jìn)行蒸煮試驗(yàn)，可明顯降低南極磷蝦酶在加工過程中的影響，為南極磷蝦粉加工過程蒸煮階段熱處理?xiàng)l件的設(shè)置提供參考。