養(yǎng)殖密度對生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中墨吉明對蝦免疫、生長和水質(zhì)的影響

王 博，秦海鵬，廖栩崢，胡世康，趙吉臣，何子豪，陳兆明，孫成波

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088 )

生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)因具有水處理效果好、蛋白質(zhì)利用效率高、能提高養(yǎng)殖對象的免疫力等特點(diǎn)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1- 2]。Cohen等[3]研究證實(shí)生物絮團(tuán)養(yǎng)殖過程中不僅發(fā)生異養(yǎng)細(xì)菌的同化作用，也發(fā)生自養(yǎng)細(xì)菌的硝化作用，這兩種途徑均能有效地把有毒性的總氨氮轉(zhuǎn)化，使養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境安全可控。但在系統(tǒng)構(gòu)建前期，異養(yǎng)同化作用發(fā)生的時(shí)間遠(yuǎn)比自養(yǎng)硝化作用要早。譚洪新等[4]通過調(diào)整投糖量，在養(yǎng)殖前期建立以異養(yǎng)同化為主、中期轉(zhuǎn)換成以自養(yǎng)硝化為主的水處理途徑應(yīng)用在高密度養(yǎng)殖南美白對蝦的生物絮凝系統(tǒng)。由于不同地域水環(huán)境存在著很大的差異，水體中優(yōu)勢菌相也存在著差異，構(gòu)建適合特定養(yǎng)殖區(qū)域的以自養(yǎng)硝化為主的生物絮團(tuán)進(jìn)行養(yǎng)殖具有重要意義。

墨吉明對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda) 、甲殼綱(Crustacea) 、對蝦科(Penaeidae) 、對蝦屬(Penaeus)，俗稱大明蝦、黃蝦，為廣鹽性、暖水性種類，在南方沿海地區(qū)的捕撈和養(yǎng)殖業(yè)中具有十分重要的經(jīng)濟(jì)地位，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。選擇適合生長的養(yǎng)殖密度對對蝦的養(yǎng)殖至關(guān)重要。近年來國內(nèi)外有關(guān)對蝦養(yǎng)殖密度的報(bào)道很多，錢佳慧等[5]報(bào)道了對墨吉明對蝦工廠化養(yǎng)殖最佳密度的探索；張華軍等[6]報(bào)道了密度脅迫對凡納濱對蝦稚蝦生長及免疫的影響；李玉全等[7]研究了密度脅迫對日本囊對蝦生長和水環(huán)境的影響；Sugathan等[8]報(bào)道了密度對斑節(jié)對蝦存活率和生長的影響；Li等[9]研究了密度對中國對蝦生長及非特異免疫的影響。但是，有關(guān)墨吉明對蝦生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中密度容量的研究尚未見報(bào)道。本文以墨吉對蝦為材料，采用單因素分析方法研究不同養(yǎng)殖密度對生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中墨吉明對蝦生長和水環(huán)境的影響，為生物絮團(tuán)模式下墨吉明對蝦的養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

墨吉明對蝦采自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，自行繁育。選取附肢完整、健康無損傷的活潑個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，平均為(5.85±0.35)cm，體質(zhì)量(2.46±0.39)g。試驗(yàn)前將墨吉明對蝦置于預(yù)先充氧的桶內(nèi)暫養(yǎng)7 d。生物絮團(tuán)來自本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的以本地區(qū)水體中菌群為主的硝化型生物絮團(tuán)，試驗(yàn)前將絮團(tuán)水體用300目濾網(wǎng)濾水濃縮后按照試驗(yàn)要求添加到試驗(yàn)桶中。試驗(yàn)海水為海區(qū)抽取，通過沉淀、砂濾、消毒處理后使用，保持水溫(29.4±0.71)℃，溶氧>5 mg/L，鹽度(28.5±0.26)，水體持續(xù)均勻充氣。試驗(yàn)在容積0.3 m3的桶內(nèi)進(jìn)行，每桶設(shè)置氣石2個(gè)，現(xiàn)場配備溶氧儀、pH計(jì)、鹽度計(jì)及英霍夫錐形管等測量儀器。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)密度梯度設(shè)置為100尾/m3、300尾/m3、700尾/m3，分別標(biāo)記為 A組、B組、C組，每個(gè)密度梯度3個(gè)平行，每個(gè)桶的實(shí)際水體為270 L，桶內(nèi)的生物絮團(tuán)添加量為20 mg/L。投喂人工配合飼料，每天定時(shí)投喂(4餐/d)，試驗(yàn)期間不添加有機(jī)碳源，零換水，周期30 d。

1.3 生長性狀測量

試驗(yàn)開始前隨機(jī)抽取30尾對蝦，通過游標(biāo)卡尺測量體長(精度為0.01 mm)，甩干水后使用電子天平測量體質(zhì)量，取其平均值作為試驗(yàn)初始體長、體質(zhì)量，試驗(yàn)結(jié)束后取各組對蝦分別按下式測定和計(jì)算對蝦體質(zhì)量、質(zhì)量增加率(WGR)和特定生長率(SGR)：

XWGR= 100% × (m1-m0)/m0

(1)

YSGR=100%× ( lnm1-lnm0)/t

(2)

式中：XWGR—質(zhì)量增加率；YSGR—特定生長率，%/d；m1—試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對蝦平均體質(zhì)量，g；m0—試驗(yàn)開始時(shí)對蝦平均體質(zhì)量，g；t—養(yǎng)殖時(shí)間，d。

1.4 水質(zhì)指標(biāo)測定

試驗(yàn)期間每天定時(shí)測量水體水質(zhì)指標(biāo)：總堿度、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮等，取水樣回實(shí)驗(yàn)室測量。用英霍夫錐形管、便攜式pH計(jì)、鹽度計(jì)、溶解氧測量儀日常分別測定絮團(tuán)量、pH、溫度、鹽度、溶氧。硝酸鹽質(zhì)量濃度用鋅- 鎘還原法測定[10]，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度用重氮- 偶氮光度法測定[11]，氨氮質(zhì)量濃度用靛酚藍(lán)法測定[12]。

1.5 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后每個(gè)處理組隨機(jī)取6～8尾墨吉明對蝦在冰盤中取其肝胰臟、肌肉組織，放入離心管中，稱重后迅速投入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)移到-80℃ 冰箱保存。組織樣品置于玻璃勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水勻漿，冷凍離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取上清液按要求稀釋后用于免疫酶活性測定。

1.6 酶活測定

測定對蝦肝胰臟和肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD) 活力、過氧化氫酶(CAT) 活力、堿性磷酸酶( AKP)活力及酸性磷酸酶(ACP) 活力。所有酶活力及蛋白含量的測定均采用南京建成生物研究所試劑盒，蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 17.0和Excel 2010軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對數(shù)據(jù)運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖密度對養(yǎng)殖水環(huán)境的影響

從表1可以看出，不同養(yǎng)殖密度對絮團(tuán)水質(zhì)參數(shù)產(chǎn)生了顯著影響，養(yǎng)殖密度越大，水質(zhì)參數(shù)的變化越明顯，也越不穩(wěn)定。高密度C組的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮質(zhì)量濃度都顯著高于其他密度組(P<0.05)，總堿度和pH高密度C組顯著低于其他密度組(P<0.05)，絮團(tuán)量高密度C組顯著高于低密度A組(P<0.05)；各密度組的溫度和溶解氧無顯著差異(P>0.05)。

2.2 養(yǎng)殖密度對墨吉明對蝦生長的影響

從表2可以看出，在不同密度條件下，墨吉明對蝦生長性狀存在顯著差異(P<0.05)。A組的平均體長、體質(zhì)量分別為(7.31±0.13)cm，(4.86±0.12)g，顯著大于B組和C組(P<0.05)，為生長最快的密度組，增重率、特定生長率分別為97.49±5.07%、2.27±0.08%/d，B組和C組間的生長性狀無顯著差異(P>0.05)。

表1 不同養(yǎng)殖密度生物絮團(tuán)水質(zhì)參數(shù)Tab.1 Water quality parameters at different stocking densities in biofloc

注：數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD，n=3)，最小值(min)，最大值(max)，同一行中不同的上標(biāo)表示顯著性差異(P<0.05)

表2 不同密度墨吉明對蝦在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生長情況Tab.2 Growth of Fenneropenaeus merguiensis cultured under biofloc system at different densities

注：右上角不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 養(yǎng)殖密度對墨吉明對蝦免疫的影響

2.3.1 SOD活力

從圖1可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的升高，肌肉組織的SOD活力呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，高密度C組的活力顯著高于其他處理組(P<0.05)，低、中密度A、B組間差異不顯著(P>0.05)。肝胰臟組織中SOD酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，低、中密度組間差異不顯著(P>0.05)，其他處理間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

圖1 密度脅迫對墨吉明對蝦SOD活力的影響Fig.1 Effect of density stress on SOD activity of Fenneropenaeus merguiensis

2.3.2 CAT活力

從圖2可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的升高，肌肉組織CAT活力呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，處理間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；肝胰臟組織CAT活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，處理間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，低密度A組顯著低于其他處理組(P<0.05)。

圖2 密度脅迫對墨吉明對蝦CAT活力的影響Fig.2 Effect of density stress on CAT activity of Fenneropenaeus merguiensis

2.3.3 ACP活力

從圖3可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的升高，肌肉組織ACP活力無明顯的變化趨勢，低、中密度A、B組差異顯著(P<0.05)，其他處理組間差異均不顯著(P>0.05)；肝胰臟組織ACP活力呈現(xiàn)上升趨勢，低密度A組與其他處理組間差異顯著(P<0.05)，中、高密度B、C組間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 密度脅迫對墨吉明對蝦ACP活力的影響Fig.3 Effect of density stress on ACP activity of Fenneropenaeus merguiensis

2.3.4 AKP活力

從圖4可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的升高，肝胰臟組織AKP活力呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，低、中密度A、B組間差異不顯著(P>0.05)，其他處理間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；肌肉組織AKP活力偏低，產(chǎn)生的影響效果不明顯。

圖4 密度脅迫對墨吉明對蝦AKP活力的影響Fig.4 Effect of density stress on AKP activity of Fenneropenaeus merguiensis

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度與生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中水質(zhì)因子的關(guān)系

關(guān)于養(yǎng)殖密度對對蝦養(yǎng)殖過程中水質(zhì)因子的影響及其規(guī)律研究有很多報(bào)道[13- 15]。養(yǎng)殖密度的增加往往導(dǎo)致水質(zhì)的惡化，從而影響對蝦的生長。生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水體中高蛋白殘餌和高含氮排泄物可以被絮團(tuán)利用，將水質(zhì)維持在穩(wěn)定狀態(tài)，達(dá)到水資源的循環(huán)利用；同樣，養(yǎng)殖密度越大對絮團(tuán)的影響也越大。在本試驗(yàn)中，養(yǎng)殖密度越大，各水質(zhì)指標(biāo)也越不穩(wěn)定，水質(zhì)的變化幅度也越大。

在養(yǎng)殖系統(tǒng)中，含氮化合物積累導(dǎo)致水質(zhì)惡化，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮是影響?zhàn)B殖系統(tǒng)中水生生物健康的一些關(guān)鍵理化因子[16]。依據(jù)對有害氮素的去除類型可以將生物絮團(tuán)分為硝化型和異養(yǎng)型，本試驗(yàn)中的生物絮團(tuán)為硝化型生物絮團(tuán)，水體中的有害氮素去除以硝化細(xì)菌為主。硝化型生物絮團(tuán)可減少碳源添加和DO消耗，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本[4]，硝化細(xì)菌具有較高的氮降解能力，硝化活性比異養(yǎng)菌高103～104倍[17- 18]。本試驗(yàn)不同密度組中氨氮、亞硝酸氮質(zhì)量濃度都處于較低水平，而不同密度組硝酸氮質(zhì)量濃度增高，高密度組顯著高于低密度組(P<0.05)。說明硝化型絮團(tuán)對不同養(yǎng)殖密度的氨氮和亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化效率高，而以硝化作用為主的生物絮團(tuán)系統(tǒng)都會(huì)出現(xiàn)硝酸鹽氮的累積現(xiàn)象。有研究表明，在鹽度23、不換水條件下，177 mg/L的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度飼養(yǎng)凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是可以接受的[19]。Liu等[20]在高密度羅非魚生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)研究中，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽氮的積累量較高，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度較低，生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中不添加碳水化合物可促進(jìn)硝化作用。本試驗(yàn)中，高密度組總堿度和pH降低，顯著低于其他密度組(P<0.05)，低密度組總堿度和pH在養(yǎng)殖期間變化不大。對零換水的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的研究中，不可避免地遇到養(yǎng)殖系統(tǒng)中堿度和pH下降的問題。堿度降低是由于生物絮團(tuán)自養(yǎng)細(xì)菌消耗了無機(jī)碳，pH與堿度之間的關(guān)系密切相關(guān)，堿度的降低將導(dǎo)致養(yǎng)殖水環(huán)境中pH變化增大[21]，此外硝化細(xì)菌的硝化和反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生酸堿[22- 23]。

3.2 養(yǎng)殖密度與對蝦生長的關(guān)系

近年來國內(nèi)外對密度脅迫對對蝦生長影響的研究屢見不鮮，錢佳慧等[8]對墨吉明對蝦，Sookying等[24]，張呂平等[10]和Martin等[25]對南美白對蝦，Allan等[26]和溫為庚等[27]對斑節(jié)對蝦，張?zhí)鞎r(shí)等[28]、秦浩等[29]和 Li 等[9]對中國對蝦養(yǎng)殖密度均開展研究，研究結(jié)果均認(rèn)為隨著對蝦養(yǎng)殖密度的增加，對蝦的生長速度減緩、增重率降低。本試驗(yàn)對生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中墨吉明對蝦適宜養(yǎng)殖密度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)墨吉明對蝦的生長同樣表現(xiàn)為隨養(yǎng)殖密度的增加而降低，這與前人在其他種類對蝦養(yǎng)殖上的研究結(jié)果相一致。對蝦的合理養(yǎng)殖密度取決于多種因素，包括生活習(xí)性、養(yǎng)殖池構(gòu)造、水體溶氧、供水條件和水處理效率等，基于不同的養(yǎng)殖環(huán)境，對蝦的養(yǎng)殖密度也有差異。隨著養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖個(gè)體對空間與餌料的競爭加劇，餌料轉(zhuǎn)化率降低，攝食的餌料更多被分解代謝用于自身的生命活動(dòng)，而不是用于物質(zhì)的積累。

3.3 養(yǎng)殖密度與對蝦免疫的關(guān)系

相關(guān)研究表明，密度脅迫對水生動(dòng)物的抗氧化系統(tǒng)功能具有顯著的影響[30- 34]。T- SOD和CAT活力是衡量機(jī)體內(nèi)自由基的代謝及組織的氧化損傷情況的兩個(gè)重要指標(biāo)，其活性與動(dòng)物體免疫性能和環(huán)境脅迫有關(guān)[33,35- 36]。本試驗(yàn)中，不同組織中的SOD、CAT 活力變化有所不同，其活力峰值基本出現(xiàn)在中低密度組，總體基本上都呈降低趨勢。這說明在一定的密度范圍內(nèi)，密度脅迫會(huì)對墨吉明對蝦機(jī)體抗氧化酶產(chǎn)生激活作用，從而增強(qiáng)了機(jī)體抵抗密度脅迫的能力，然而當(dāng)密度繼續(xù)升高，抗氧化酶能力反而受到了抑制，墨吉明對蝦抗氧化能力顯著下降，說明對蝦的抗氧化能力有限，這與李娜等[37]和趙玉超等[38]的研究結(jié)果一致。ACP 和AKP 是衡量機(jī)體免疫機(jī)能和健康狀況的重要指標(biāo)[39- 40]。本試驗(yàn)中，養(yǎng)殖密度變化對AKP和ACP活力產(chǎn)生顯著影響，不同部位的變化也不相同，不同組織兩種酶活力：肝胰臟>肌肉，說明兩種酶主要在肝胰腺中發(fā)揮作用，這與王庚申等[41]、李娜等[37]的研究結(jié)果相一致。ACP活力隨著密度升高而增強(qiáng)，且增幅較大，說明抵御惡劣環(huán)境、清除體內(nèi)異物的能力增強(qiáng)。AKP活力隨著密度升高而降低，中低密度組間差異不顯著。養(yǎng)殖密度升高酶的活力受到了抑制，活力下降。

4 結(jié)論

通過養(yǎng)殖密度對生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中墨吉明對蝦的試驗(yàn)結(jié)果表明，生物絮團(tuán)可以有效控制養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度，但硝酸鹽氮質(zhì)量濃度呈不斷上升趨勢，且隨養(yǎng)殖密度的增加而顯著增加，密度越高水質(zhì)越不穩(wěn)定。當(dāng)養(yǎng)殖密度達(dá)到700尾/m3時(shí)，墨吉明對蝦生長受到抑制，抗氧化能力減弱和應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生。因此，在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖模式下，推薦墨吉明對蝦養(yǎng)殖密度為300尾/m3左右。