CellaVision自動(dòng)化血細(xì)胞數(shù)字圖像分析系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀

楊 迪, 張 俊, 韋俊杰, 李華玲

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

在疾病篩查與診治的過程中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析是臨床實(shí)驗(yàn)室必不可少的檢測(cè)技術(shù)，其在血液細(xì)胞分析后復(fù)檢中的應(yīng)用最為突出。血液細(xì)胞分析包括2個(gè)階段，第1個(gè)階段是人工血細(xì)胞計(jì)數(shù)與白細(xì)胞鏡檢分類以及血紅蛋白比色測(cè)定，使用手動(dòng)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)是形態(tài)學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但卻是一個(gè)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的過程；第2個(gè)階段是各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀，應(yīng)用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)前不需要稀釋血液標(biāo)本，可減少檢測(cè)用品的消耗，降低檢測(cè)的費(fèi)用。全自動(dòng)血細(xì)胞五分類分析儀操作簡(jiǎn)單，能夠快速得到結(jié)果，但血細(xì)胞分析儀也存在缺陷，如無法有效提供紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板形態(tài)學(xué)資料，不能有效分析出非典型性淋巴細(xì)胞以及異常細(xì)胞[1]。此外，部分工作人員對(duì)血細(xì)胞分析儀過度依賴，忽視了血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的重要性。因此，專家呼吁重視細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，并且國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ISCI)[2]也制定了41條血細(xì)胞檢測(cè)復(fù)檢規(guī)則。

近年來，全自動(dòng)推片機(jī)(以日本SYSMEX公司生產(chǎn)的SP-1000i為代表)和全自動(dòng)血細(xì)胞數(shù)字圖像系統(tǒng)(以瑞典CellaVision公司生產(chǎn)的CellaVision自動(dòng)化血細(xì)胞數(shù)字圖像分析系統(tǒng)為代表)相繼問世[3]。CellaVision全自動(dòng)血細(xì)胞形態(tài)分析儀器包含了2個(gè)基本系統(tǒng): 一個(gè)系統(tǒng)是全自動(dòng)的圖像分析系統(tǒng)，可用于瀏覽、采集、儲(chǔ)存和細(xì)胞圖像的顯示；另一個(gè)系統(tǒng)是CellaVision組織圖像軟件，該軟件的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)技術(shù)(以數(shù)學(xué)模型模擬神經(jīng)元活動(dòng)，是基于模仿大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能而建立的一種信息處理系統(tǒng))專用于WBC的預(yù)分類, RBC的形態(tài)學(xué)特征預(yù)分析。該軟件可以同時(shí)進(jìn)行包括骨髓在內(nèi)的多種類型的組織樣本的圖像捕獲、儲(chǔ)存、分析[4]。CellaVision系統(tǒng)可在單個(gè)實(shí)驗(yàn)室單元內(nèi)創(chuàng)建一個(gè)精簡(jiǎn)的工作流程，或者在網(wǎng)絡(luò)中連接多個(gè)實(shí)驗(yàn)室，在其中可以獨(dú)立處理和檢查所有實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞圖像。

1 CellaVision系統(tǒng)在紅細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1 CellaVision系統(tǒng)在瘧疾篩查中的應(yīng)用

目前，瘧疾診斷中的常用技術(shù)是瘧疾快速診斷測(cè)試(RDT)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測(cè)試。RDT易于使用，可以縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間，并且能夠區(qū)分惡性瘧原蟲和非惡性瘧原蟲物種，但是其檢測(cè)方法的靈敏度有限。PCR則存在價(jià)格昂貴、被污染的產(chǎn)物易致假陽性、PCR擴(kuò)增后期出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”而難以準(zhǔn)確定量[5-6]。此外，RDT和PCR測(cè)試都不能反映寄生蟲密度。因此，瘧疾診斷中微觀審查仍然是必要的。CellaVision系統(tǒng)通過CellaVision Advanced RBC應(yīng)用程序，可在每次外周血涂片上掃描1 500～3 000個(gè) RBC, 對(duì)每個(gè)RBC進(jìn)行拍照，識(shí)別感染了寄生蟲(包括瘧疾)的紅細(xì)胞，并且能夠計(jì)算感染的RBC的百分比。Yoon J等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CellaVision系統(tǒng)檢測(cè)到惡性瘧原蟲的敏感性高于間日瘧原蟲，正確診斷的大多數(shù)載玻片具有環(huán)形滋養(yǎng)體。被惡性瘧原蟲寄生的紅細(xì)胞有粗大的紫褐色茂氏點(diǎn)，這有利于CellaVision系統(tǒng)對(duì)惡性瘧原蟲感染的診斷。從總體水平來看，F(xiàn)lorin L等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CellaVision自動(dòng)檢測(cè)瘧疾的靈敏度較低，瘧疾寄生蟲經(jīng)常錯(cuò)誤分類為Howell-Jolly體、Pappenheimer體或嗜堿性點(diǎn)狀體。原因?yàn)? ① 只有在滋養(yǎng)體階段的紅細(xì)胞才被軟件判定為陽性細(xì)胞，感染配子體的紅細(xì)胞不被軟件識(shí)別，被誤認(rèn)為白細(xì)胞或巨大血小板。② CellaVision系統(tǒng)對(duì)血小板聚集RBC照片的分辨率低。CellaVision ARBCA對(duì)瘧疾寄生蟲的診斷篩查存在局限性，用于自動(dòng)檢測(cè)瘧疾的CellaVision預(yù)分類系統(tǒng)需要進(jìn)一步改進(jìn)。

1.2 CellaVision系統(tǒng)在網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用

研究[9]發(fā)現(xiàn), CellaVision系統(tǒng)聯(lián)合SP-1000i 全自動(dòng)推片染色儀可排除因手工推片而造成的血涂片薄厚不均、細(xì)胞分布不均勻、煌焦油藍(lán)染色時(shí)間長(zhǎng)等問題。傳統(tǒng)手工顯微鏡法計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞需要在血涂片中抽檢1 000個(gè)紅細(xì)胞，CellaVision系統(tǒng)紅細(xì)胞分析模塊所檢測(cè)分析的紅細(xì)胞數(shù)量大于2 000個(gè)，與人工抽樣檢測(cè)相比準(zhǔn)確性更好。與LH750全自動(dòng)血液分析儀相比, CellaVision系統(tǒng)可以避免瘧原蟲、大血小板、紅細(xì)胞聚集、冷凝集素或藥物等直接干擾，準(zhǔn)確性更優(yōu)。

1.3 CellaVision系統(tǒng)在異常紅細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)中的應(yīng)用

在異常紅細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)方面，系統(tǒng)掃描并拍攝對(duì)應(yīng)于8個(gè)顯微視野區(qū)域的圖片并自動(dòng)定位單個(gè)紅細(xì)胞，并將每個(gè)紅細(xì)胞分類到對(duì)應(yīng)類別的紅細(xì)胞形態(tài)中。每張血涂片分析的紅細(xì)胞數(shù)量設(shè)定為約2 000個(gè)。每種紅細(xì)胞形態(tài)分類的結(jié)果都是半定量的，以紅細(xì)胞的百分比來定量，分為4個(gè)等級(jí)[缺少(-)、罕見(+)、中度()和多()][10]。Criel M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)在檢測(cè)一種異常紅細(xì)胞形態(tài)達(dá)到中度時(shí)就會(huì)報(bào)警顯示陽性，但是結(jié)合臨床實(shí)際考量來看，半定量分界線仍有待進(jìn)一步精確。CellaVision DM96在檢測(cè)關(guān)鍵紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)類別方面(如多核細(xì)胞增多、靶細(xì)胞、鐮刀細(xì)胞、球形細(xì)胞、橢圓形細(xì)胞、卵圓形細(xì)胞、淚珠細(xì)胞)具有高靈敏性(約80.0%), 通過結(jié)合圖像結(jié)果來手動(dòng)調(diào)整陽性結(jié)果，會(huì)減少假陰性結(jié)果并使診斷標(biāo)準(zhǔn)化[12-13]。

2 CellaVision在體液細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)中的應(yīng)用

迄今為止，只有少量的技術(shù)手段能夠進(jìn)行體液的分類分析。Sysmex XE-5000等儀器能夠通過側(cè)向散射與核酸含量對(duì)體液中的有核細(xì)胞進(jìn)行分析。采用流式細(xì)胞術(shù)或免疫表型分析也可對(duì)腦脊液(CSF)等體液標(biāo)本進(jìn)行分析，但其具有操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，在常規(guī)體液細(xì)胞形態(tài)檢查中應(yīng)用受限。CellaVision體液檢測(cè)軟件通過細(xì)胞離心涂片進(jìn)行分析，對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)化識(shí)別與分類，所有其他細(xì)胞歸為“其他”。Riedl JA等[14]對(duì)CellaVision體液檢測(cè)軟件的預(yù)分類準(zhǔn)確率、批內(nèi)精密度、時(shí)間效率等進(jìn)行了研究，與人工鏡檢相比，CellaVision體液檢測(cè)軟件對(duì)除腦脊液以外的其他標(biāo)本、腦脊液標(biāo)本以及所有體液標(biāo)本的總體準(zhǔn)確率分別為83.0%、90.0%、86.0%。同時(shí)，細(xì)胞密度較低的標(biāo)本會(huì)延長(zhǎng)人工分析的時(shí)間，而細(xì)胞密度較高的標(biāo)本則會(huì)延長(zhǎng)自動(dòng)化分析的時(shí)間，原因是對(duì)于細(xì)胞密度較高的標(biāo)本，系統(tǒng)區(qū)分單個(gè)細(xì)胞以供分類的難度較大。張彥平等[15]研究表明，應(yīng)用CellaVision體液檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，漿膜腔積液中的細(xì)胞數(shù)目和蛋白含量均會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生消極影響。當(dāng)漿膜腔積液細(xì)胞數(shù)量過少或者蛋白含量過高時(shí)，都會(huì)使?jié){膜腔積液產(chǎn)生凝塊，導(dǎo)致CellaVision體液檢測(cè)系統(tǒng)無法正確識(shí)別分類。

總之，在缺乏專業(yè)技能的情況下，可以考慮將CellaVision體液檢測(cè)預(yù)分類結(jié)果作為初步報(bào)告。需要注意的是, CellaVision體液檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞預(yù)分類的準(zhǔn)確率較低，考慮與該類型細(xì)胞數(shù)量在體液標(biāo)本中含量較少有關(guān)。

3 CellaVision系統(tǒng)在白細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 CellaVision系統(tǒng)在外周血涂片白細(xì)胞常規(guī)分析中的應(yīng)用

CellaVision系統(tǒng)在外周血涂片白細(xì)胞樣本常規(guī)分析中涉及6個(gè)常規(guī)項(xiàng)目，即桿狀核中性粒細(xì)胞、分葉核中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。有研究[16-17]比較CellaVision系統(tǒng)預(yù)分類的結(jié)果與人工顯微鏡分類計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在6個(gè)常規(guī)項(xiàng)目的分析中，嗜堿性粒細(xì)胞相關(guān)性較差, CellaVision系統(tǒng)不能有效檢測(cè)出嗜堿性粒細(xì)胞，其原因是正常血涂片中嗜堿性粒細(xì)胞含量少且嗜堿性粒細(xì)胞的臨床意義只在很少情況下才會(huì)具有相關(guān)性。CellaVision系統(tǒng)還可對(duì)具有臨床重要意義的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。國內(nèi)認(rèn)同的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：早幼粒細(xì)胞+中性中幼粒細(xì)胞>1%，中性晚幼粒細(xì)胞>2%, 原始細(xì)胞>1%, 異型淋巴細(xì)胞>5%, 漿細(xì)胞>1%, 100個(gè)白細(xì)胞中有核紅細(xì)胞>1個(gè)。我們可以采取如下方法來系統(tǒng)地提高陽性預(yù)測(cè)值: 在剛開始使用系統(tǒng)時(shí)，要不斷充實(shí)參考細(xì)胞庫內(nèi)的參考細(xì)胞，每類參考細(xì)胞數(shù)量由最初的10個(gè)增加到約50個(gè)[18]。CellaVision系統(tǒng)在檢測(cè)定性異常情況中的敏感性和特異性較高，尤其在兒童群體中, CellaVision系統(tǒng)對(duì)母細(xì)胞的鑒別具有很好的陽性預(yù)測(cè)值和敏感性。

3.2 CellaVision系統(tǒng)在惡性血液病細(xì)胞形態(tài)分析中的應(yīng)用

準(zhǔn)確鑒別急性惡性血液病涉及多個(gè)學(xué)科，包括免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子研究。形態(tài)學(xué)與細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)于急性惡性血液病的診斷與分類是必不可少的[19]。近年來，CellaVision系統(tǒng)在急性髓系白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的診斷中廣泛應(yīng)用。研究[20]發(fā)現(xiàn)，盡管系統(tǒng)得到的原始細(xì)胞數(shù)量偏低，但經(jīng)過人工驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)結(jié)果與顯微鏡觀察結(jié)果具有很好的相關(guān)性。對(duì)于急性髓系白血病，系統(tǒng)能夠檢出原始細(xì)胞，并能鑒別骨髓母細(xì)胞和成熟細(xì)胞。Eilertsen H等[21]研究表明, CellaVision系統(tǒng)不適用于對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行分析。對(duì)于B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞增生性疾病患者而言，CellaVision系統(tǒng)能夠?qū)Ξ惓Ａ馨图?xì)胞進(jìn)行快捷、準(zhǔn)確的篩選，但不能對(duì)大顆粒淋巴細(xì)胞、雙核樣淋巴細(xì)胞以及毛細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確分類，因此不能明確地鑒別出確切疾病。任穎佳等[22]研究結(jié)果顯示, CellaVision系統(tǒng)未能有效識(shí)別原始淋巴細(xì)胞。CellaVision系統(tǒng)所采集的細(xì)胞圖像與顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)仍存在一定差距，尤其在對(duì)細(xì)胞核染色質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)與質(zhì)地的顯示上, CellaVision系統(tǒng)采集的細(xì)胞圖像缺乏立體感，清晰度欠佳[23-25]。診斷惡性血液病患者樣本中幼稚細(xì)胞是困難的，CellaVision系統(tǒng)把幼稚細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞圖像的形式展示出來，聯(lián)網(wǎng)共享，有利于專家、學(xué)者的討論。針對(duì)骨髓造血功能下降導(dǎo)致白細(xì)胞總數(shù)嚴(yán)重減低的標(biāo)本，需要增加系統(tǒng)檢測(cè)白細(xì)胞的個(gè)數(shù)，避免具有臨床意義的病變細(xì)胞漏檢[26-27]。

4 CellaVision在血小板檢測(cè)中的應(yīng)用

血小板(PLT)計(jì)數(shù)在彌散性血管內(nèi)凝血、出血性疾病的篩查診斷中具有重要作用。目前，利用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)仍占主導(dǎo)地位。當(dāng)標(biāo)本中出現(xiàn)紅細(xì)胞碎片、血液微凝塊、血小板聚集、“血小板衛(wèi)星”現(xiàn)象等異常情況時(shí)，血細(xì)胞分析儀檢測(cè)PLT計(jì)數(shù)會(huì)出現(xiàn)假性偏高或減低的情況，而CellaVision系統(tǒng)則可以憑借直觀的圖像來有效規(guī)避這一問題。宋蓓等[24]將115例患者標(biāo)本的CellaVision DM96、XE-2100血細(xì)胞分析儀PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，采用CellaVision DM96檢測(cè)PLT計(jì)數(shù)與人工鏡檢具有更好的線性相關(guān)性，當(dāng)血細(xì)胞分析儀有報(bào)警信息提示時(shí)，CellaVision DM96與人工鏡檢PLT計(jì)數(shù)結(jié)果一致性更好。李光友[25]研究顯示, CellaVision系統(tǒng)檢測(cè)血小板聚集的靈敏度為83.3%, 特異度為75.6%，陽性預(yù)測(cè)值為59.8%, 陰性預(yù)測(cè)值為91.2%, 說明系統(tǒng)對(duì)血小板聚集的判斷準(zhǔn)確性較好。CellaVision系統(tǒng)也具有局限性，此系統(tǒng)易將染料沉積、破碎細(xì)胞甚至小淋巴細(xì)胞判斷為血小板聚集，在審核時(shí)需要特別注意。

綜上所述, CellaVision系統(tǒng)在日常檢驗(yàn)工作中的意義有: ① 簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)室人工分類的程序; ② 提高形態(tài)學(xué)檢查報(bào)告結(jié)果一致性和標(biāo)準(zhǔn)化; ③ 降低特殊樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間。CellaVision系統(tǒng)需要改進(jìn)的地方: 相關(guān)檢驗(yàn)師還可將該系統(tǒng)運(yùn)用到本科教學(xué)中[26], 與傳統(tǒng)的顯微鏡下結(jié)合圖片講義的教學(xué)模式相比, CellaVision系統(tǒng)把特定的細(xì)胞與同系細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別比較，也可以將細(xì)胞不同發(fā)育階段的時(shí)期特點(diǎn)進(jìn)行區(qū)別比較，有利于培養(yǎng)學(xué)生外周血整體判定的思維模式。CellaVision系統(tǒng)存在的不足: ① 在篩查被瘧原蟲感染的的紅細(xì)胞時(shí), CellaVision系統(tǒng)對(duì)小于0.05%的陽性細(xì)胞百分比會(huì)四舍五入后報(bào)告為0%，因此需要加強(qiáng)對(duì)間日瘧原蟲的篩查、診斷，提高分辨率。② 當(dāng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)非常低時(shí), CellaVision系統(tǒng)無法產(chǎn)生差異計(jì)數(shù)，需要制備血沉棕黃層才能獲得差異計(jì)數(shù)。