miR-146a和miR-155與慢性阻塞性肺疾病炎癥表型的相關(guān)性分析

席卓娜 喬亞紅 程方圓

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種較為常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)性氣流受限為主要特征[1]。目前臨床癥狀和肺功能是COPD診斷與病情分級(jí)的主要依據(jù)，但易受年齡等因素影響，不能全面評(píng)估病情[2]。對(duì)COPD表型的研究是臨床研究熱點(diǎn)之一，明確COPD表型有利于在治療期間選取合適治療手段并提高患者預(yù)后情況。目前COPD表型分類(lèi)方法主要包括臨床表型、生理表型、炎癥表型、影像學(xué)表型等[3]。COPD與有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，因此炎癥表型具有判斷COPD病情程度的天然優(yōu)勢(shì)。同時(shí)有研究表明，miR-146a、miR-155均與炎癥反應(yīng)相關(guān)[4-5]，因此本研究探討miR-146a和miR-155與炎癥表型相關(guān)性，進(jìn)一步完善對(duì)COPD炎癥表型分類(lèi)的認(rèn)識(shí)。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年7月～2019年6月本院收治的COPD患者179例，其中男85例，女94例，年齡30～61歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合COPD診斷中急性加重診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；研究前未接受糖皮質(zhì)、β2受體激動(dòng)劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心肺并發(fā)癥患者；合并肺部腫瘤、支氣管哮喘等慢性疾病患者。根據(jù)誘導(dǎo)痰分析炎癥細(xì)胞比例的不同，COPD分為嗜酸性粒細(xì)胞型(嗜酸性粒細(xì)胞占總細(xì)胞的2.5%以上)、嗜中性粒細(xì)胞型(嗜中性粒細(xì)胞數(shù)為61%以上)、混合粒細(xì)胞性(嗜酸性粒細(xì)胞2.5%以上，嗜中性粒細(xì)胞數(shù)為61%以上)及粒細(xì)胞缺乏型(嗜酸性粒細(xì)胞2.5%以下，嗜中性粒細(xì)胞數(shù)為61%以下)[7]。四組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 四組一般資料比較

二、方法

1 標(biāo)本采集

所有研究對(duì)象均于就診次日清晨抽取肘靜脈血5 mL，3000 r/min、-20℃離心20min，取上清，平均分為兩份，做好標(biāo)記-80℃保存。

2 qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-146a、miR-155水平

參照Trizol說(shuō)明書(shū)提取血清總RNA，應(yīng)用Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，25℃ 5min，42℃30 min，85℃ 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，用去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。進(jìn)行qRT-PCR操作。程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)熱3min，(95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s)循環(huán)35，72℃ 5min終止反應(yīng)。miR-146a、miR-155以U6為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)(見(jiàn)表2)。采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-146a、miR-155相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列

3 各表型特征指標(biāo)檢測(cè)

取1.2.1血清標(biāo)本，采用一氧化氮測(cè)定儀檢測(cè)FeNO水平；采用比色法測(cè)定血清MPO水平，采用722S分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，在460 nm處讀取吸光度(OD)值,試劑為南京建成生物工程研究所的MPO測(cè)試盒；采用免疫熒光定量法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，試劑盒為南京基蛋生物科技有限公司的CRP試劑盒。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、指標(biāo)檢測(cè)

與粒細(xì)胞缺乏型相比，嗜酸性粒細(xì)胞型患者FeNO水平顯著升高(P<0.05)，MPO、CRP水平差異不顯著(P>0.05)，嗜中性粒細(xì)胞型患者M(jìn)PO、CRP水平顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)eNO水平差異不顯著(P>0.05)，混合粒細(xì)胞型患者FeNO、MPO、CRP水平均顯著升高(P<0..05)；與嗜中性粒細(xì)胞型相比，嗜酸性粒細(xì)胞型、混合粒細(xì)胞型患者FeNO水平顯著升高(P<0.05)；與嗜酸性粒細(xì)胞相比，嗜中性粒細(xì)胞型、混合粒細(xì)胞型患者M(jìn)PO、CRP水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組FeNO、MPO、CRP水平檢測(cè)

注：a、b、c分別代表與粒細(xì)胞缺乏型、嗜酸性粒細(xì)胞型、嗜中性粒細(xì)胞型相比，P<0.05。

二、各炎癥表型血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平

與粒細(xì)胞缺乏型相比，嗜酸性粒細(xì)胞型miR-146a水平顯著升高(P<0..05)，嗜中性粒細(xì)胞型MPO、CRP、miR-155水平顯著升高(P<0.05)，混合粒細(xì)胞型miR-146a、miR-155水平均顯著升高(P<0.05)；與嗜中性粒細(xì)胞型相比，嗜酸性粒細(xì)胞型、混合粒細(xì)胞型miR-146a水平顯著升高(P<0.05)；與嗜酸性粒細(xì)胞相比，嗜中性粒細(xì)胞型、混合粒細(xì)胞型miR-155水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各表型血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平比較

注：a、b、c分別代表與粒細(xì)胞缺乏型、嗜酸性粒細(xì)胞型、嗜中性粒細(xì)胞型相比，P<0.05。

三、血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平與炎癥分型相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明，嗜酸性粒細(xì)胞型患者中，miR-146a水平與FeNO、CRP呈正相關(guān)(r=0.659，P<0.05)；嗜中性粒細(xì)胞型患者中，miR-155水平與MPO、CRP水平呈正相關(guān)(r=0.628，0.605，P=0.007)，混合粒細(xì)胞型患者中miR-146a、miR-155水平與FeNO、MPO、CRP水平均呈正相關(guān)(r=0.724，0.514，0.671，0.605，0.525，0.509，P<0.05)，粒細(xì)胞缺乏型患者中，miR-146a、miR-155水平與FeNO、MPO、CRP水平均無(wú)相關(guān)性(r=0.121，0.106，0.210，0.229，0.107，0.213，P>0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 血清miR-146a、miR-155表達(dá)水平與炎癥分型相關(guān)性分析

討 論

COPD是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，是一種常見(jiàn)的慢性疾病。與氣道、肺臟對(duì)有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，致殘率與病死率極高，嚴(yán)重危害患者生存狀態(tài)。目前臨床診斷COPD主要通過(guò)常規(guī)肺功能檢查，但其方法具有一定局限性，同一肺功能水平患者可能有不同臨床表現(xiàn)、生存狀態(tài)，對(duì)同一種治療方法敏感性亦不同。研究不同表型可區(qū)分不同COPD患者，有助于為患者提供臨床個(gè)性化治療方案，更具有針對(duì)性。目前對(duì)COPD表型分類(lèi)方法多種多樣，包括臨床表型、影像學(xué)表型、炎癥表型等。其中炎癥表型能夠精細(xì)明確COPD的致病來(lái)源，可作判斷COPD急性加重并評(píng)估預(yù)后的參考。炎癥反應(yīng)與炎性標(biāo)志物具有密切相關(guān)性，炎性標(biāo)志物能對(duì)炎癥反應(yīng)作出更精確表達(dá)。有研究表明，miR-146a、miR-155與炎癥反應(yīng)均有相關(guān)性，但其在COPD炎癥分型中研究甚少，為此本研究通過(guò)分析COPD患者血清miR-146a、miR-155水平與COPD炎癥分型及其特異性炎性標(biāo)志物相關(guān)性，為COPD的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

以嗜酸性粒細(xì)胞為主的COPD患病者血清炎癥介質(zhì)水平較低，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)良好，Pazdrak等[8]研究表明，COPD患者有35%患者嗜酸性粒細(xì)胞升高，此類(lèi)患者對(duì)糖皮質(zhì)激素較為敏感，取得療效優(yōu)于其他類(lèi)型。Bjermer[9]研究表明，F(xiàn)eNO與呼吸系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Wagener等[10]研究表明FeNO可反映氣道嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥程度，并可準(zhǔn)確量化，不受時(shí)間控制，隨時(shí)檢測(cè)，迅速得結(jié)果。本研究中嗜酸性粒細(xì)胞型患者FeNO水平顯著高于其他類(lèi)型患者，表明FeNO水平可作為COPD患者嗜酸性粒細(xì)胞型分型的指標(biāo)。miR-146a由miR-146加工產(chǎn)生，位于5q34。研究表明，miR-146a在炎癥環(huán)境下高表達(dá)[11]。Yang等[12]研究表明，miR-146a水平可能與嗜酸性粒細(xì)胞密切相關(guān)。本研究中，嗜酸性粒細(xì)胞型患者血清miR-146a水平顯著高于粒細(xì)胞缺乏型及嗜中性粒細(xì)胞患者，且相關(guān)性分析顯示，嗜酸性粒細(xì)胞型患者血清miR-146a水平與FeNO水平正相關(guān)，提示miR-146a水平與嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者密切相關(guān)，嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者可能是由于miR-146a水平升高導(dǎo)致。

中性粒細(xì)胞型患者細(xì)菌感染多，需將強(qiáng)藥物治療，因此住院時(shí)間及康復(fù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)[13]。MPO是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些巨噬細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶，可與中性粒細(xì)胞表面抗體結(jié)合，通過(guò)p38MAKP途徑激活中性粒細(xì)胞樣爆發(fā)、脫顆粒等反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥組織損傷[14]。CRP水平是區(qū)分細(xì)菌感染與病毒感染的敏感指標(biāo)[15]。本研究中，中性粒細(xì)胞型患者M(jìn)PO、CRP水平顯著高于粒細(xì)胞缺乏型、嗜酸性粒細(xì)胞型患者，提示MPO、CRP水平可作為判斷中性粒細(xì)胞的分型標(biāo)準(zhǔn)，二者高表達(dá)顯示COPD患者屬于中性細(xì)胞型。miR-155是一個(gè)典型的多功能microRNA,位于非編碼區(qū)基因Bic內(nèi)，在免疫、炎癥的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16-17]。有研究表明肺炎患者中性粒細(xì)胞活檢中miR-155水平顯著升高[18]。本研究中，嗜中性粒細(xì)胞型患者miR-155水平顯著高于粒細(xì)胞缺乏型、嗜酸性粒細(xì)胞型患者，此外，嗜中性粒細(xì)胞型患者血清miR-155水平與血清MPO、CRP水平正相關(guān)，提示嗜中性粒細(xì)胞型COPD患者可能是由于miR-155水平升高導(dǎo)致。粒細(xì)胞缺乏型患者血清炎癥介質(zhì)較低，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)良好，與miR-146a、miR-155水平均無(wú)相關(guān)性，而混合粒細(xì)胞型患者血清miR-146a、miR-155水平均升高，且二者均與FeNO、MPO、CRP水平正相關(guān)，從另一個(gè)側(cè)面反映miR-146a、miR-155水平與COPD的分型有關(guān)，可能為臨床個(gè)性化、精確化治療提供參考。

綜上所述，血清miR-146a、miR-155水平與COPD患者炎癥分型密切相關(guān)，為臨床個(gè)性化治療提供理論依據(jù)，但本研究病理術(shù)較少，納入可能不全面，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。