Skp2 高表達與骨肉瘤患者新輔助化療耐藥之間的聯(lián)系

許多輝 丁 路 余 偉 宋正南 白靖平

1.新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院骨軟科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院骨一科，新疆烏魯木齊 830000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是好發(fā)于兒童和青少年的骨惡性腫瘤[1-2]。新輔助化療使骨肉瘤5 年生存率大幅度提高[3-4]，近幾十年5 年生存率進入了平臺期，化療耐藥是主要因素之一[5-6]。因此，探索骨肉瘤化療耐藥的分子機制，是改善預后的關鍵。

S 期激酶相關蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可識別和降解細胞周期素依賴性激酶抑制劑（CKI），如p21、p27 等[7]。前期體外實驗發(fā)現(xiàn)[8-10]，Skp2 可抑制細胞凋亡，增加侵襲能力，促進上皮間充質轉化（EMT），敲除Skp2 可逆轉上皮間質轉化（EMT）特征。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫和骨肉瘤樣本探討Skp2 在患者中的表達。

1 對象與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和分析

GSE126209 含6 例骨肉瘤樣本和5 例癌旁組織。GSE16089 含甲氨蝶呤敏感的Saos-2 骨肉瘤細胞和甲氨蝶呤耐藥的Saos-2 細胞各3 株。TCGA 數(shù)據(jù)含87 例附生存信息的骨肉瘤樣本。

limma 軟件包計算GSE126209 和GSE16089 中的差異表達基因（DEGs）。篩選條件為logFC＞1 且P ＜0.05。clusterProfiler 軟件包對DEGs 進行富集分析，篩選閾值P ＜0.05。

1.2 研究對象

收集2018 年2 月—2019 年6 月新疆醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院（以下簡稱“我院”）骨軟科按標準方案收治的OS 患者所有患者均采用新輔助化療方案：甲氨喋呤：8～12 g/m2、阿霉素：60～90 mg/m2、順鉑：120～150 mg/m2、異環(huán)磷酰胺15 g/m2。共2 個循環(huán)（10 d）。經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批及患者、家屬同意后獲取腫瘤及癌旁組織各17 例。見表1。按腫瘤細胞壞死率（TCNR）≥90%為非耐藥，TCNR＜90%為耐藥分組[11]：非耐藥腫瘤組織（A 組）11 例和耐藥腫瘤組織（B 組）6 例；非耐藥癌旁組織（C 組）11 例和耐藥癌旁組織（D組）6 例。

表1 耐藥與非耐藥患者一般資料比較

1.3 腫瘤細胞壞死率的測定

沿最大徑做縱切面后分區(qū)。每個分區(qū)按上、中、下取材、制片后鏡檢。見圖1。

圖1 標本取材

1.4 RT-qPCR

Trizol（Ambion，15596-026）提取樣本RNA，HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）（VAZYME，R101-01/02）反轉錄。SYBR Green Master Mix（VAZYME，Q111-02）獲得RT-PCR 產(chǎn)物。結果以GAPDH 為內(nèi)參基因進行2-△△Ct分析。

1.5 Western-blot

單去污劑裂解（含PMSF）樣本，BCA 試劑盒（Solarbio）測上清蛋白濃度。WB 檢測Skp2（Ab183039）、AKT（Ab18785）、p21（Ab109520）、p27（Ab32034）、FOXO1（Ab52857）、E-cadherin（Ab40772）蛋白表達。分別計算與GAPDH（Bioswamp，PAB36269）的灰度比值（%）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。骨肉瘤預后的風險因素采用Cox 回歸分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Skp2 與OS 耐藥相關

Skp2 在OS 和耐藥腫瘤中均上調（P ＜0.05）（圖2A、2B）。富集分析示Skp2 在耐藥腫瘤中參與細胞周期和FOXO 通路等（圖2C）。String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）示Skp2 與AKT，F(xiàn)OXO 通路和細胞凋亡基因間具有互作關系（圖2D）。

2.2 mRNA 表達差異

圖2 Skp2 與耐藥相關

RT-qPCR 結果示，與A 組比較，B 組Skp2 和AKT顯著上調，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著下調，C 組Skp2、AKT、E-cadherin 顯著下調，P21、P27、FOXO1 顯著上調（P ＜0.05）；與B 組比較，D 組Skp2、p21、AKT 下調，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著上調。見圖3。

圖3 Skp2、AKT、p21、p27、FOXO1、E-cadherin 在不同分組中的mRNA 表達差異

2.3 蛋白表達差異

Western-blot 結果示，與A 組比較，B 組Skp2 和AKT 顯著上調，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著下調，C組Skp2、AKT、E-cadherin 顯著下調，P21、P27、FOXO1顯著上調（P ＜0.05）；與B 組比較，D 組Skp2、p21、AKT 下調，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著上調。見圖4。

2.4 骨肉瘤預后的風險因素

Cox 回歸分析結果示，Skp2、AKT 和p27 的風險比均＞1，且P <0.05 可能是OS 患者預后的風險因素。見表2。

3 討論

化療可殺滅微小轉移灶，但常伴有耐藥的發(fā)生[12-13]。Skp2 與多種腫瘤耐藥相關，如前列腺癌、乳腺癌、OS等[14-15,8]。本研究首先識別了Skp2 在OS 和耐藥OS 中表達上調，且Skp2 高表達是預后較差的預測因素，表達下調對侵襲、肺轉移具有抑制作用[16]。

Skp2 泛素化促進AKT 活化，與預后不良有關[17]。在食管鱗癌中，抑制AKT 磷酸化，可抑制Skp2 的表達，減緩細胞增殖[18]。AKT-Skp2 通路可能是改善OS化療效果的靶通路。另外，Skp2 抑制OS 細胞中E-cadherin、FOXO1、p21 和p27 表達，抑制細胞凋亡[10,19]。然而，分子檢測示p21 在耐藥腫瘤組與非耐藥組間無明顯差異，提示p21 的生成和降解不僅受Skp2 的調節(jié)[20]。Skp2 通過對p27 的降解，在OS 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是OS 的重要預后指標[21-22]。研究表明Skp2 通過降解E-cadherin 促進細胞遷移[23]。E-cadherin 與EMT 誘導的轉錄抑制因子相互作用，并與腫瘤細胞化療耐藥間存在著緊密聯(lián)系[24-25]。同時，Cox 分析結果顯示，性別、Skp2、AKT、p21 和p27 可能是OS 患者生存時間的風險因素，需要進一步研究和探討。

圖4 Skp2、AKT、p21、p27、FOXO1、E-cadherin 在不同分組中的蛋白表達

表2 Cox 回歸分析

綜上所述，Skp2 的高表達與OS 新輔助化療耐藥密切相關，Skp2 可能是改善化療療效的潛在靶點。