復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血栓前狀態(tài)分析及其與MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性研究

宋金龍 陳萍萍 王鵬鯤 賴毛華 馬紅霞 李 娟

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州 510120

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），一般是指與同一配偶連續(xù)發(fā)生3 次或以上的自然流產(chǎn)，在妊娠女性中發(fā)生率為1%～5%[1-2]。也有國外和部分中國學(xué)者將連續(xù)2 次及以上妊娠物或胎兒丟失定義為RSA[3]。RSA 病因主要包括染色體異常、女性生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常、凝血功能異常、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫因素、感染因素以及男性因素等，臨床上仍有30%～40%的患者流產(chǎn)原因未明確[4]。有研究顯示[5]，50%～65% RSA 婦女中至少存有一種遺傳性或獲得性血液高凝狀態(tài)，而這種血液高凝狀態(tài)又稱為血栓前狀態(tài)（pre-thrombotic state，PTS）。RSA 與母體內(nèi)凝血功能異常的相關(guān)性仍沒有受到足夠的重視，且RSA 患者沒有明顯的臨床表現(xiàn)，其診斷較為困難，血栓前狀態(tài)的診斷標(biāo)準(zhǔn)正處于探索階段。此外，國內(nèi)外對于亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 基因C677T 位點(diǎn)突變與RSA 相關(guān)性結(jié)論仍存在爭議。因此，本研究主要從PTS 及MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)突變兩方面進(jìn)行研究，探討其與RSA 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年9 月—2019 年3 月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的77 例RSA患者作為RSA 組，年齡21～40 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)診斷確診為RSA，28 周以前發(fā)生流產(chǎn)史連續(xù)3 次或以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過系統(tǒng)流產(chǎn)的病因篩查，排除自然流產(chǎn)明確病因，包括夫婦染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染以及抗磷脂綜合征；②排除靜脈栓塞病史；③排除急、慢性肝臟及腎臟疾病，全身惡性腫瘤，自身免疫性疾病。選擇同期在我院進(jìn)行孕前檢查的健康女性41 名作為正常對照組，年齡23～40 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有正常生育史的健康婦女。排除標(biāo)準(zhǔn)：有任何原因?qū)е碌牧鳟a(chǎn)史。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標(biāo)及樣本采集 統(tǒng)計(jì)兩組凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）、蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）缺陷發(fā)生率等指標(biāo)，并比較兩組MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)的基因多態(tài)性。AT-Ⅲ活性參考值：80～120，＜80 為AT-Ⅲ缺陷；PC 活性參考值：70～130，＜70 為PC 缺陷；PS 活性參考值：55～140，＜55 為PS 缺陷。采用靜脈穿刺抽取法抽取5 mL，全血樣本2 mL，凝血管3 mL。凝血管抽取后30 min 內(nèi)，經(jīng)3000 r/min 離心15 min，上儀器檢測凝血4 項(xiàng)；剩余血漿標(biāo)本放入-80℃冰箱儲(chǔ)存，3 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行易栓癥3 項(xiàng)檢測；全血標(biāo)本1 個(gè)星期內(nèi)進(jìn)行血液基因組提取。

1.2.2 主要試劑與儀器 血液基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP349]；Premix ExTaq酶體系（大連寶生物工程有限公司，貨號：RR320A）；標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker DL2000（天根生物科技有限公司，貨號：MD114）；PS 活性測定試劑盒（法國思達(dá)高公司，貨號：00746）；PC 活性測定試劑盒（法國思達(dá)高公司，貨號：00671）；AT-Ⅲ活性檢測試劑盒（法國思達(dá)高公司，貨號：00672）。全自動(dòng)立式凝血分析儀（法國思達(dá)高公司，STA-R Max）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，ABI9700 型）；微量紫外分光光度儀（賽默飛世爾科技公司，NanoDrop2000）；電泳儀和BioRAD 凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，SYSTEM GelDoc XR+）。

1.2.3 血液基因組DNA 的提取以及濃度測定 依照血液基因組提取試劑盒的說明書進(jìn)行DNA 提取，采用Nano Drop 2000 微量紫外分光光度儀對DNA 質(zhì)量及濃度進(jìn)行檢測，用提取盒中洗脫液進(jìn)行調(diào)零，吸取提取好的核酸2 μL 進(jìn)行濃度和純度測定。

1.2.4 MTHFR 基因片段擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳 引物參考文獻(xiàn)[6]，由生工生物工程股份有限公司合成，PCR 反應(yīng)體系為20 μL：Premix ExTaq Mix 為10 μL，引物各為1 μL（10 pmol/μL），DNA 模板為2 μL，補(bǔ)充去離子水至20 μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃45 s，60℃30 s，72℃45 s，共進(jìn)行32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；配置3%瓊脂糖，PCR 產(chǎn)物5 μL 與1 μL 6×Loading buffer 混勻后點(diǎn)樣，設(shè)置電泳參數(shù)，電壓110 V，電流300 mA，時(shí)間30 min；生工生物工程股份有限公司將對含有目的條帶的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以ROC 曲線方法判斷易栓癥在RSA 發(fā)生時(shí)AT-Ⅲ、PC、PS 活性的最佳臨界值。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群一般資料比較

兩組人群年齡、體重、血壓和血紅蛋白比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 兩組人群PT、FIB、APTT、TT 水平比較

兩組人群PT、APTT、TT 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。RSA 組FIB 水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

2.3 兩組人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷發(fā)生率比較

兩組人群AT-Ⅲ、PC 缺陷率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。RSA 組PS 缺陷發(fā)生率高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表1 兩組一般資料比較[M（P25，P75）]

表2 兩組人群PT、FIB、APTT、TT 水平比較

表3 兩組人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷發(fā)生率比較[例（%）]

2.4 易栓癥三項(xiàng)AT-III、PC、PS 診斷RSA 的ROC 曲線

僅PS 指標(biāo)具有篩查意義（P ＜0.01），以PS 判斷RSA 患者存在PTS 的最佳臨界值為45%，曲線下面積為0.701（95%CI：0.611～0.791，P<0.01），靈敏度為95.1%，特異度為42.9%。見圖1。

圖1 易栓癥三項(xiàng)AT-Ⅲ、PC、PS 診斷RSA 的ROC 曲線

2.5 MTHFR 基因PCR 擴(kuò)增電泳

RSA 組與正常對照組MTHFR 基因經(jīng)PCR 反應(yīng)后都能擴(kuò)增出目的基因條帶，長度為198 bp，以其中15 個(gè)標(biāo)本電泳結(jié)果為例。見圖2。

2.6 MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較

經(jīng)Hardy-Wenberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)，所有基因型在兩組中均符合遺傳平衡，具有群體代表性。兩組人群中基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩組人群等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

圖2 MTHFR 基因PCR 擴(kuò)增電泳

表4 MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[例（%）]

3 討論

RSA 的原因非常復(fù)雜，在孕婦妊娠的過程中，胚胎生長發(fā)育環(huán)境的平衡一旦遭到破壞，就可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)等不良的妊娠結(jié)局[3]。已有的臨床研究發(fā)現(xiàn)許多有不良妊娠結(jié)局的婦女都存在血栓形成的傾向，包括胎兒生長受限、妊娠高血壓、稽留流產(chǎn)、胎盤早剝以及不明原因的RSA 等。這種因血液持續(xù)高凝狀態(tài)以致血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加稱為易栓癥，也稱為PTS[7]。

作為PTS 的一種獨(dú)立危險(xiǎn)形成因素，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，Hhcy）可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成胎盤部位或者子宮螺旋動(dòng)脈血栓，從而導(dǎo)致胎兒的供血不足，甚至可導(dǎo)致流產(chǎn)[8]。Hhcy 為血管粥樣硬化和動(dòng)靜脈血栓疾病常見的強(qiáng)烈的高危因素[9]，遺傳性Hhcy 主要由MTHFR 基因突變導(dǎo)致。在DNA 甲基化過程中，MTHFR 作為調(diào)節(jié)半胱氨酸和四氫葉酸代謝的關(guān)鍵酶也起到了關(guān)鍵的作用，該基因位于染色體1p36.3 的位置，全長19.3 kb，mRNA 全長7105 bp，共有12 個(gè)外顯子，為常染色體顯性遺傳[10]，該基因的突變可能會(huì)引起不良妊娠結(jié)局[11-12]。

FIB 是血栓形成的重要參與成分[13-14]，為一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，其作為血漿黏滯度的主要決定因素，在血小板的聚集過程中起重要作用。RSA 患者血小板和凝血功能較正常妊娠明顯增強(qiáng)[15]，本研究中RSA 組FIB 高于正常對照組，提示RSA 組相對于正常對照組而言，更容易形成高凝易栓狀態(tài)。

PTS 是指抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等的遺傳性或獲得性缺陷[16]，包括PC 缺乏癥、PS 缺乏癥、抗凝血酶缺乏癥等[17]。主要標(biāo)志物包括AT-Ⅲ、PC 和PS，其中PS 是PC 的輔助因子[18]，PS 是維生素K 依賴性單鏈糖蛋白，主要在肝臟中合成[19]。隨著凝血因子增加、抗凝血成分減少以及纖溶活性降低，在妊娠晚期孕婦會(huì)出現(xiàn)生理性的易栓狀態(tài)，雖然這將有利于孕婦在生產(chǎn)后高效率、快速止血，但同時(shí)產(chǎn)婦患PTS 的可能性也大大增加[20-21]。本研究中RSA 組PS 缺陷率高于正常對照組，且僅PS 活性指標(biāo)有篩查意義，提示PS 活性可以作為PTS 引起RSA 發(fā)生的篩查指標(biāo)。兩組PC 的缺陷發(fā)生率無明顯區(qū)別，提示PC 缺陷者在RSA 患者中并不多見，可能是本研究樣本量有限，但也有可能提示PC 缺陷與RSA 相關(guān)性并不高，這需要繼續(xù)加大樣本量進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

MTHFR 參與了葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[22-23]，而某些基因位點(diǎn)（677 位點(diǎn)C→T）可引起MTHFR 酶活性的降低，引起葉酸代謝異常，使葉酸水平降低及Hhcy 的形成，從而增加了血液高凝易栓的風(fēng)險(xiǎn)，造成不良妊娠結(jié)局。677 位點(diǎn)C 突變?yōu)門 的孕婦會(huì)增加RSA 的風(fēng)險(xiǎn)[24-25]，還可能與C 基因位點(diǎn)可能對Hhcy 水平有抑制作用，而T 基因位點(diǎn)有促進(jìn)Hhcy 水平增高的作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示RSA 組CT、TT 基因型分布頻率均高于正常對照組，且RSA 組T 等位基因分布頻率高于正常對照組，證實(shí)了MTHFR C677T 基因突變與RSA 的發(fā)病具有一定相關(guān)性。

綜上，本研究初步證實(shí)了PTS 與RSA 的發(fā)生存在明顯的相關(guān)性，是引起流產(chǎn)的重要因素之一。同時(shí)證明了RSA 與MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)多態(tài)性有一定的相關(guān)性，但是本研究存在樣品量不足以及未檢測葉酸和Hhcy 水平等問題。在臨床實(shí)踐中應(yīng)重視RSA 患者的PTS 評估，有利于在孕前發(fā)現(xiàn)遺傳性RSA患者，從而開始早期抗凝治療，改善妊娠結(jié)局以及并發(fā)癥。