保健灸關(guān)元穴對(duì)老年大鼠血清和腸道氧化及炎癥反應(yīng)的影響

歐陽(yáng)夏荔 段浩茹 金 琪 趙百孝 韓 麗 羅 雪 趙思雨 張高鈺 張楊旖旎 程元元

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院內(nèi)障眼病科，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

衰老通常是指在正常情況下生物體發(fā)育成熟后，隨著年齡增長(zhǎng)機(jī)體發(fā)生的功能性和器官性衰退的漸進(jìn)過(guò)程[1]。由于免疫系統(tǒng)功能顯著下降，機(jī)體對(duì)內(nèi)、外環(huán)境的適應(yīng)能力減弱，人體在結(jié)構(gòu)和功能上可出現(xiàn)多種退行性變化，尤其對(duì)腸道免疫功能的影響較大。腸道作為機(jī)體抵御病原體的第一道防線，在多種急慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體衰老常出現(xiàn)腸道功能障礙及慢性炎癥，可能是由腸道菌群種類(lèi)減少、滲透性增強(qiáng)所致[3]。因此抗腸道衰老也逐漸成為老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。艾灸療法在抗衰老方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。研究其作用機(jī)制對(duì)于提高艾灸抗衰老的臨床療效和推廣應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)選用6 只清潔級(jí)12 周齡青年Wistar 雌性大鼠，體重（283.47±15.77）g，12 只清潔級(jí)36 周齡老年Wistar 雌性大鼠，體重（357.92±27.93）g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境：采用人工控制的室內(nèi)照明，保持12 h 光照（8:00～20:00）和黑暗（20:00～次日8:00）交替循環(huán)。室溫（22±2）℃，室內(nèi)濕度50%～60%。所有動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)飼料、清潔飲用水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將12 只正常老化雌性Wistar 大鼠分為老年組（n=6）和保健灸組（n=6），6 只青年雌性Wistar 大鼠為青年組。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

特制細(xì)艾條（三年陳艾條，規(guī)格0.5 cm×12.0 cm，河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司）；特制大鼠固定器（呈圓柱形，底面直徑8 cm，高20 cm）；ZK380 低溫離心機(jī)（產(chǎn)地：德國(guó)）；Thermo Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（產(chǎn)地：芬蘭）；Peri Flux 5000 激光多普勒血流儀（產(chǎn)地：瑞典）；Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron 全自動(dòng)生化分析儀（產(chǎn)地：美國(guó)）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（Lot：20180711）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（Lot：20180710）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（瑞格博，rgb-60013r）；大鼠IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（瑞格博，rgb-60023r）；大鼠IL-10 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（瑞格博，rgb-60026r）；大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（瑞格博，rgb-60080r）。

1.3 干預(yù)方法

將三組大鼠腹部關(guān)元穴穴區(qū)直徑約1.0 cm 的鼠毛剃干凈。青年組和老年組：抓取大鼠放入特制固定器中，不施加其他干預(yù)手段，20 min/d，連續(xù)40 d；保健灸組：抓取大鼠放進(jìn)特制固定器中，使其腹部對(duì)準(zhǔn)固定器底部的開(kāi)口，開(kāi)口下方放置點(diǎn)燃的艾條，對(duì)準(zhǔn)大鼠關(guān)元穴（圖1），艾條距離穴位皮膚（30±5）mm，通過(guò)調(diào)節(jié)插進(jìn)艾條底部的釘座高度，及時(shí)調(diào)整艾條與大鼠的距離，使艾灸時(shí)的溫度基本保持恒定。艾灸干預(yù)20 min/d，連續(xù)40 d。

1.4 觀察指標(biāo)

圖1 保健灸組大鼠艾灸操作圖

干預(yù)40 d 后，各組大鼠禁食不禁水24 h，測(cè)量體重后，將各組大鼠用3%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，股動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h，以3500 r/min（半徑72 mm）在低溫環(huán)境下（4℃）離心15 min，取上清液于-80℃低溫冰箱保存，待測(cè)；取血后，迅速沿腹正中線開(kāi)腹，快速剪取大鼠結(jié)腸道，采用縱向剖開(kāi)后生理鹽水沖洗3 遍，迅速液氮冰凍保存?zhèn)溆?。根?jù)SOD 檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清及腸道SOD、MDA 水平；根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腸道中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平；采用激光多普勒血流儀檢測(cè)關(guān)元穴微循環(huán)血流灌注量，配用Probe407 小型光導(dǎo)纖維直探頭，輸出激光波長(zhǎng)780 nm，最大輸出功率1 mW，反射時(shí)間設(shè)定為0.2 s。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。依次對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若兩者均符合，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD 方法。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清及腸道SOD、MDA 水平比較

圖2 各組大鼠腸道炎癥因子表達(dá)水平比較

與青年組比較，老年組血清及腸道SOD 水平降低（P <0.05 或P <0.01），MDA 水平升高（P <0.05 或P<0.01）；與老年組比較，保健灸組腸道SOD 水平明顯升高（P<0.01），MDA 水平明顯降低（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清及腸道SOD、MDA 水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清及腸道SOD、MDA 水平比較（±s）

注：與青年組比較，*P <0.05，**P <0.01；與老年組比較，△△P <0.01。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.2 各組大鼠腸道炎癥因子表達(dá)水平比較

與青年組比較，老年組腸道促炎因子IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10 表達(dá)水平升高（P <0.05）；與老年組比較，保健灸組腸道IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平顯著降低（P <0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 關(guān)元穴微循環(huán)血流灌注量

青年大鼠關(guān)元穴的血流灌注量多在140～250 PU，而老年大鼠多為50～80 PU。與青年組比較，老年組關(guān)元穴微循環(huán)波峰降低，波幅變小，血流灌注量大幅下降；與老年組比較，保健灸組關(guān)元穴微循環(huán)波峰上升，波幅變大，血流灌注量明顯上升。見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠關(guān)元穴血流灌注量

3 討論

隨著年齡增長(zhǎng)、外界因素變化，人體內(nèi)抗氧化物質(zhì)減少，防護(hù)功能減退或發(fā)生障礙，自由基累積性增加[4]。活性氧自由基可侵害細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而引起一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終形成代謝產(chǎn)物MDA，導(dǎo)致機(jī)體的病變和衰老[5]。因此，MDA 不僅是間接評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，同時(shí)能反映機(jī)體的衰老程度。SOD 是一種存在于細(xì)胞液中的抗氧化酶，可清除人體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，保護(hù)組織免受自由基的損傷，因而SOD 活性可以反映組織抗氧化的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然衰老大鼠局部組織和全身都顯示出衰老跡象，并伴有明顯的抗氧化能力的減弱，艾灸老年大鼠關(guān)元穴，首先引起腹部局部組織器官效應(yīng)[6]，緩解局部組織大腸的細(xì)胞損傷情況并提升其抗氧化能力。

眾所周知，氧化應(yīng)激可影響腸道屏障，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，增加腸道的通透性。促炎因子通過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，伴隨著炎癥細(xì)胞因子的長(zhǎng)期失調(diào)，局部組織和機(jī)體將處于持續(xù)性的慢性、低度的炎癥狀態(tài)[7-8]。這種在自然衰老進(jìn)程中發(fā)生的狀態(tài)，有學(xué)者稱(chēng)之為炎癥衰老[9-10]。隊(duì)列研究也表明，IL-6 和TNF-α 水平是機(jī)體衰弱的標(biāo)志[11]。此外，許多與老年有關(guān)的慢性疾病，例如糖尿病和心血管、腎、肺和骨骼肌疾病也與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)直接相關(guān)[5，12-14]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)知道，自然衰老大鼠腸黏膜處于炎癥狀態(tài)，促炎因子IL-6、TNF-α 表達(dá)水平升高，而長(zhǎng)期持續(xù)性的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致抑炎因子IL-10 表達(dá)水平隨之升高，通過(guò)艾灸老年大鼠的關(guān)元穴，腸道促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β 的表達(dá)水平顯著降低，其炎癥狀態(tài)明顯改善。

鑒于上述氧化應(yīng)激、炎癥兩者與衰老的密切關(guān)系，De la Fuente 等[15]提出氧化-炎癥衰老學(xué)說(shuō)。研究認(rèn)為，促炎因子增多使腸道黏膜蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化，是腸道屏障功能障礙的主要機(jī)制[16]。促炎細(xì)胞因子又可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，并使其分泌生長(zhǎng)因子、蛋白酶、化學(xué)因子和細(xì)胞因子等[17]，引起組織損傷，使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[18]。促炎細(xì)胞因子與細(xì)胞衰老兩者間可能產(chǎn)生互為因果的惡性循環(huán)，進(jìn)而又加速了炎癥衰老的進(jìn)程[19]。

綜上，從艾灸自然衰老大鼠關(guān)元穴對(duì)其血清和腸道氧化及炎癥反應(yīng)的影響來(lái)看，艾灸關(guān)元穴不僅可以提高局部組織器官的抗氧化能力，還能減輕其炎癥反應(yīng)。自古就有灸關(guān)元以治病養(yǎng)生和“針必取三里，灸必加關(guān)元”之說(shuō)。關(guān)元穴位于任脈上，是人體元陰元陽(yáng)的交關(guān)之處，能補(bǔ)益人體真火，強(qiáng)壯補(bǔ)腎[20]，治療各種虛損性疾病，從而起到延緩衰老的作用。艾灸的一個(gè)十分重要的治療因素是熱效應(yīng)，穴位處組織的溫度升高可以提高血液的流動(dòng)速度。流動(dòng)的血細(xì)胞反射出的光在頻率上產(chǎn)生頻移，當(dāng)激光多普勒血流儀通過(guò)光纖發(fā)出激光束，到達(dá)測(cè)定組織表面時(shí)發(fā)生反射從而測(cè)得穴位組織血流灌注量，其大小與血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的速度成正比。老年大鼠皮膚微循環(huán)血流量減少，艾灸關(guān)元穴可以增加穴位血流灌注量，從而減少局部組織代謝物的堆積和炎癥浸潤(rùn)。