p38 MAPK在腹瀉型腸易激綜合征大鼠中的變化及其免疫調(diào)控作用

郭軍雄，汪斌，馬麗，康萬榮，許小敏，徐生剛

(1. 河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河西學(xué)院絲綢之路中醫(yī)藥研究中心，河西學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 張掖 734000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適并常伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯穆阅c功能紊亂性疾患，胃腸動(dòng)力和內(nèi)臟感知異常是IBS發(fā)病的主要病理生理學(xué)特征，迄今具體發(fā)病機(jī)制尚無完全定論[1-2]。近年來，隨著生活節(jié)奏增快和壓力增大，發(fā)病率有上升的趨勢[3]。而免疫系統(tǒng)作為D-IBS精神-腸道因素互動(dòng)的關(guān)鍵紐帶，其平衡對D-IBS內(nèi)臟敏感性有重要影響[4]。前期研究表明[5]：慢性束縛(S)聯(lián)合番瀉葉(F)灌服法復(fù)建的大鼠Th1促炎因子IL-12的含量升高，Th2 抑炎因子IL-10的含量降低，可能存在Th1/Th2平衡漂移。p38 MAPK是MAPK家族中最重要的成員之一，其作為細(xì)胞信號傳遞的交匯點(diǎn)，能被應(yīng)激、氧化反應(yīng)以及炎性細(xì)胞因子等多種因素所激活。有研究表明[6-7]：p38 MAPK信號通路系統(tǒng)在疼痛感知、胃腸動(dòng)力紊亂和免疫炎癥異常激活中均有重要作用。本研究旨在通過觀察D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織中p38 MAPK蛋白的表達(dá)和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的變化及其相關(guān)性，探討p38 MAPK通路在S+F灌服法誘發(fā)的D-IBS“肝郁脾虛證”大鼠模型中的免疫作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠40只(雌雄各半)，8～10周齡，體重(180±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(甘)2015-0002)】。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級環(huán)境中【SYXK(甘)2015-0005)】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有操作取得了甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號：2016-025)。

1.1.2 主要試劑和儀器

大鼠 IL-1β ELISA檢測試劑盒(貨號：MM-0047R1)、大鼠 IL-6 ELISA 檢測試劑盒(貨號：MM-0190R1)，大鼠 TNF-α ELISA 檢測試劑盒(貨號：MM-0180R1)，均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。p38MAPK抗體試劑盒(批號：40100)，購自 GeneTex 公司；SP-9001生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG免疫組化檢測試劑盒(批號：K186613C)，DNA顯色試劑盒(批號：K186916P)。以上測試盒均購自北京中杉金橋公司。番瀉葉中藥飲片，由康美藥業(yè)股份有限公司(批號：170302511)。

酶標(biāo)儀(iMark，Bio-Rad，美國)；臺式高速離心機(jī)(18R，Dynamica Velocity，德國)；顯微鏡(BX43，Olympus，日本)；自動(dòng)真空組織脫水機(jī)(ASP200S，Leica，德國)；圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybemetics，美國)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)建D-IBS“肝郁脾虛證”大鼠模型

實(shí)驗(yàn)時(shí)先將番瀉葉水浸泡5 h，煎煮8 min、紗布兩層過濾取上清液，常規(guī)濃縮，最終濃度相當(dāng)于含生藥0.4 g/mL藥液，待用。

40只雌雄各半SPF級Wistar大鼠稱重后，隨機(jī)分為D-IBS模型I(造模7 d)、II(造模14 d)、III(造模21 d)組及空白對照組，每組10只。參考文獻(xiàn)方法[8-9]，采用慢性束縛應(yīng)激加番瀉葉水煎劑灌服二因素法復(fù)建D-IBS“肝郁脾虛證”大鼠模型。模型各組大鼠實(shí)驗(yàn)前10 h禁食不禁水，予以番瀉葉水煎劑4 g/(kg·d)灌服，每日1次，灌服番瀉葉水煎劑后用寬透明膠帶束縛大鼠肩部及前肢和胸腹部，使大鼠無法用前肢抓搔頭面，每天定時(shí)約1 h，分別連續(xù)建模7、14、21 d?？瞻讓φ战M大鼠予等體積蒸餾水灌服21 d。

1.2.2 血清/結(jié)腸組織的處理

分別于建模結(jié)束后第2天，大鼠稱重麻醉，仰臥并鋪巾，沿大鼠腋窩下皺襞做一垂直于左腋前線與前正中線的連線，在連線中點(diǎn)處行心臟采血約5 mL，室溫靜置20 min，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，-80℃保存；剖腹截取距肛門5～8 cm 處結(jié)腸組織，生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物，4%多聚甲醛固定，常規(guī)切片染色，并行免疫組化檢測?？瞻讓φ战M和模型Ⅲ組同時(shí)取材。

1.2.3 ELISA法檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平

取原倍標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣、37℃溫育30 min、洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃溫育30 min，洗板5次，加入顯色液，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min內(nèi)讀OD值。

1.2.4 免疫組化法觀察大鼠結(jié)腸 p38 MAPK蛋白表達(dá)

常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，10 min × 2 次，(梯度乙醇脫水)而后依次置于無水乙醇I、II、95%、80%酒精中各5 min，置于H2O2室溫20 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗3 min × 3次，枸櫞酸鈉高壓鍋熱修復(fù)后冷卻，PBS 洗3 min × 3次。滴加一抗p38 MAPK (1∶100) 于濕盒中4℃過夜，37℃復(fù)溫1 h；PBS洗3 min × 3次后加二抗，室溫30 min；PBS洗3 min × 3次。滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶)，37℃孵育20 min；PBS洗3 min × 3次，滴加DAB顯色劑；自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片。每組選取8張切片，在顯微鏡高倍視野(10×20 倍)下每張切片選取6個(gè)視野，采用Imagine-Pro-Plus分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和定量分析，計(jì)算所選擇區(qū)域內(nèi)的平均吸光度，平均吸光度=累積吸光度/有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域面積，并取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)觀察

空白對照組結(jié)腸黏膜上皮較完整，細(xì)胞排列規(guī)整，未見腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，固有層腺體亦無萎縮，黏膜下層未見明顯改變。模型I、II組黏膜上皮細(xì)胞部分壞死脫落，固有層腺體萎縮，可見血管充血，間質(zhì)水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤；模型 III 組黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，固有層腺體萎縮減少，黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松水腫充血，有較多炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織p38 MAPK免疫組化染色

顯微鏡下觀察結(jié)腸中p38 MAPK蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)棕黃色者為陽性表達(dá)，無著色則為陰性表達(dá)。研究結(jié)果表明，p38 MAPK蛋白在肌層、黏膜層、黏膜下層均有不同程度的表達(dá)。與空白對照組相比，模型各組大鼠結(jié)腸p38 MAPK蛋白表達(dá)IOD值顯著升高(P<0.05)，尤以造模14 d和21 d最為顯著(P<0.01)，見圖2和圖3。

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的檢測結(jié)果

與空白對照組比較，模型I組、模型II組、模型III組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見表1，圖4。

2.4 各組大鼠p38 MAPK與IL-1β、IL-6和TNF-α相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)系數(shù)均為正值，提示p38 MAPK與IL-1β、IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，尤以D-IBS大鼠模型 II、 III組最為顯著(P<0.05)，見表2，圖5。

3 討論

IBS 臨床癥狀多樣，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。但應(yīng)激在IBS發(fā)病發(fā)展中的作用越來越受到人們的重視。應(yīng)激可通過塑造內(nèi)臟高敏感性、促進(jìn)腸道低度炎癥等參與IBS的發(fā)生與發(fā)展[10]。有文獻(xiàn)證實(shí)[11]，

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化(HE染色，標(biāo)尺=50 μm)Figure 1 Pathological changes of colon tissue in the rats of each group (HE staining, Bar=50 μm)

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中p38 MAPK的表達(dá)(免疫組化染色，標(biāo)尺=50 μm)Figure 2 p38 MAPK expression in colon tissue of the rats in each group (Immumohistochemical staining, Bar=50 μm)

表 1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的含量Table 1 Changes of serum expression of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the rats of each s)

注：與空白對照組對比，☆P<0.05，★P<0.01；與模型Ⅰ組對比，△P<0.05，▲P<0.01；#造模第17天大鼠死亡1只。

Note. Compared with the control group,☆P<0.05，★P<0.01. Compared with the model group I,△P<0.05,▲P<0.01.#One rat died on the 17th day.

注：A：空白對照組；B：模型Ⅰ組；C：模型Ⅱ組；D：模型Ⅲ組。與空白對照組相比，☆P<0.05，★P<0.01；與模型Ⅰ組相比，△P<0.05，▲P<0.01。下圖同。圖3 各組大鼠結(jié)腸組織中p38 MAPK表達(dá)OD值Note. A, Control group; B, Model group I; C, Model group II; D, Model group III. Compared with the control group,☆P<0.05,★P<0.01. Compared with the model group I,△P<0.05， ▲P<0.01.The same in the following figures.Figure 3 OD value of p38 MAPK expression in colon tissues of the rats in each group

圖4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量Figure 4 Contents of IL-1β, IL-6 and TNF-α expression in the serum of each group

表2 各組大鼠p38 MAPK與IL-1β、IL-6和TNF-α 的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between p38 MAPK and IL-1β, IL-6, TNF-α in the rats

注：與同組p38 MAPK的相關(guān)性，☆P<0.05。

Note. Correlation with p38 MAPK in the same group,☆P<0.05.

圖5 p38 MAPK與IL-1β、IL-6和TNF-α的相關(guān)性Figure 5 Correlation of p38 MAPK with IL-1β, IL-6 and TNF-α

IBS患者存在著腸道低度炎癥，而多種腸道黏膜炎癥又可以致使胃腸動(dòng)力和內(nèi)臟感覺異常。而p38 MAPK通路是目前已鑒定出的經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑之一，是細(xì)胞外信號引起細(xì)胞反應(yīng)的一個(gè)共同通路，它幾乎參與了機(jī)體內(nèi)所有的生理及病理過程，而它在介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激等細(xì)胞反應(yīng)中的作用尤其引人關(guān)注[12]。p38 MAPK主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，其活性在生理情況下是很低的。一旦被特定因素如細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、細(xì)菌病原體及其產(chǎn)物、紫外線照射、細(xì)胞外高滲等刺激均可激活p38 MAPK，所有被激活的p38 MAPK成員都具有蘇氨-甘氨酸-酪氨酸(Thr-Gly-Tyr，TGY)雙位點(diǎn)磷酸化模塊，即p38 MAPK需在Thr180和酪氨酸182兩個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過兩步磷酸化實(shí)現(xiàn)激活?；罨髉38 MAPK調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，釋放炎性因子，而炎性因子又對細(xì)胞形成新的刺激，導(dǎo)致MAPK信號通路的再次激活，從而形成正反饋調(diào)節(jié),最終導(dǎo)致炎癥因子的過量表達(dá)。研究表明[13-16]，用細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖刺激大鼠巨噬細(xì)胞后，可致巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化，而抑制此階段的p38 MAPK磷酸化可減輕甚至完全阻斷巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α的產(chǎn)生，說明炎性反應(yīng)中TNF-α的產(chǎn)生與p38 MAPK 激活密切相關(guān)，而且p38 MAPK的激活除能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子，影響炎癥進(jìn)程。所以，在調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制中，p38 MAPK 起著類似“開關(guān)”的作用。IL-1β是由激活的單核巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，可引發(fā)一系列的腸道炎癥和黏膜損傷。IL-1β還能增加腸上皮細(xì)胞緊密結(jié)合部的通透性，抑制鈉-鉀-ATP酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致水、鈉的吸收障礙，產(chǎn)生腹瀉及腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂[17]。IL-6是一種多功能復(fù)雜的細(xì)胞因子，在炎癥過程中，IL-6 可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在炎癥及感染部位的聚集，防止組織的過度損傷，IL-6還可通過神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用于腸道神經(jīng)元和平滑肌細(xì)胞，導(dǎo)致胃腸道動(dòng)力系統(tǒng)的變化，引起腸道運(yùn)動(dòng)和感知的改變[18-19]。TNF-α具有廣譜生理和病理效應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，被認(rèn)為是腸黏膜屏障損傷的重要啟動(dòng)因子[20]。已有研究闡明[21-22]，TNF-α一方面可改變腸道組織緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)和分布、重組肌動(dòng)蛋白骨架；另一方面可通過激活 NF-κB，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性因子如IL-1β、IL-6等，進(jìn)而加重對腸黏膜屏障的損傷。

制備符合人類D-IBS發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型是研究D-IBS發(fā)病機(jī)制、病理生理和探索新型治療策略的工作基礎(chǔ)，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道的造模方法中，新生母子分離聯(lián)合慢性束縛加番瀉葉灌胃模型耗費(fèi)時(shí)間長，死亡率高，乙酸灌腸合并束縛模型腸道黏膜損傷，基因模型技術(shù)高，費(fèi)用貴，且不易獲得。唯有番瀉葉聯(lián)合傳統(tǒng)束縛應(yīng)激法能更好得模擬人的D-IBS發(fā)病，番瀉葉提取物灌服小鼠后無可見的光鏡變化，慢性束縛應(yīng)激過程為非損傷刺激且更接近人的心理應(yīng)激[5,23]，符合D-IBS的發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，以番瀉葉聯(lián)合傳統(tǒng)束縛應(yīng)激法復(fù)建的D-IBS“肝郁脾虛證”大鼠模型結(jié)腸組織中p38 MAPK蛋白表達(dá)和血清IL-1β、IL-6、TNF-α的顯著含量升高(P<0.05，P<0.01)，尤以模型Ⅱ、Ⅲ組最為顯著(P<0.01)，表明番瀉葉灌胃聯(lián)合傳統(tǒng)束縛應(yīng)激法復(fù)建 D-IBS“肝郁脾虛證”大鼠模型存在一定的時(shí)效關(guān)系。HE染色表明各組大鼠結(jié)腸組織黏膜未見糜爛或潰瘍，結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)無明顯病理變化，符合D-IBS屬于功能性腸紊亂性疾病的特征。本研究進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，D-IBS大鼠中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量與p38 MAPK的表達(dá)呈正相關(guān)性，且以模型Ⅱ、Ⅲ組尤為顯著(P<0.05)，從一定程度上說明這些免疫指標(biāo)異常與p38 MAPK通路有關(guān)，這將對于探索D-IBS發(fā)生的作用機(jī)制具有一定的意義。然由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本研究僅選擇了免疫組化測定結(jié)腸組織中p38 MAPK的蛋白陽性表達(dá)，未能結(jié)合real-time PCR和Westem blot方法對p38 MAPK的基因和蛋白作進(jìn)一步細(xì)致評估，這是本研究的局限之處，p38 MAPK從哪一個(gè)上游靶點(diǎn)，促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放都尚待進(jìn)一步研究探索。