慢性光照聯(lián)合氫醌誘導(dǎo)小鼠年齡相關(guān)性黃斑變性模型

張晶，許凱，梁潔，陳強，馬群英，梁麗娜

(中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是55歲以上人群主要的致盲眼病之一。隨著中國老齡化問題的日益嚴(yán)重，其患病率逐年升高，其發(fā)病機制和防治成為研究的熱點，合適的動物模型是相關(guān)研究工作的重要工具。近年來國內(nèi)外建立了各種AMD動物模型[1]，不同的動物模型各有其優(yōu)缺點，理想的動物模型應(yīng)該更經(jīng)濟和更接近于人類AMD自然病程。AMD的病因和發(fā)病機制仍然存在很大的爭議，目前得到公認(rèn)的是受年齡、基因和環(huán)境的影響，其中吸煙和光暴露是AMD發(fā)生的重要環(huán)境危險因素，既往大量報道以吸煙、光照誘導(dǎo)出部分AMD病理改變動物模型[2-3]，而人類AMD是一個多因素作用、光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管之間相互影響形成的復(fù)雜“系統(tǒng)”的表現(xiàn)。因此，聯(lián)合多種發(fā)病誘因，盡可能模擬AMD發(fā)生的環(huán)境因素，可能會建立更接近人AMD發(fā)病機制的動物模型。本研究，我們采用慢性光照聯(lián)合氫醌飼料喂養(yǎng)的方法誘導(dǎo)出類似晚期AMD病變模型，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4月齡健康雄性SPF級C57BL/6小鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。實驗動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院實驗動物中心屏障級動物房內(nèi)【SYXK(京)2014-0019】。溫度(22±5)℃，濕度(50±5)%。所有實驗操作遵循眼科技視覺研究動物ARVO宣言，并按實驗動物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 試劑與儀器

氫醌(Sigma-Aldrich，H9003)；TUNEL細(xì)胞原位凋亡試劑盒(Roche Life Science，12156792910)； HE染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C02-04004)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，BD PharmingenTM，564907)；抗熒光淬滅劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C-101)； DNA酶I(大連TaKaRa公司，D2270 A)；冰凍包埋劑(optimal cutting temperature compound，O.C.T，美國Sakura公司，4583)； 4%多聚甲醛(北京Unique生物科技有限公司，P1110)；VEGF(Abcam，ab52917)；CD31(Abcam，ab28364)；羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AE042337)；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, 北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2315)。光學(xué)顯微鏡(DM2500，Leica，德國), 透射電子顯微鏡(JEM-1400，日本電子株式會社，日本), 冰凍切片機(CM1850，Leica，德國)，光照度計(北京師范大學(xué)光電儀器廠，ST-85，中國)，大鼠SPF級生長繁育飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立

動物按照隨機數(shù)字表法分為模型組10只，正常對照組10只。模型組小鼠置于自主設(shè)計的LED光照裝置中(專利號：2017210439226)波長400～750 nm，光照度計測量，保證在動物頭部水平測量光照強度可達2500 lx，每日接受12 h光照；同時被喂以基于基礎(chǔ)純凈合成的含8 g/(kg·bw)的飲食；正常組小鼠被喂以不含氫醌的同配方飲食，正常晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。兩組動物飼養(yǎng)3.5個月后進行模型評價。

1.2.2 視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測

各組小鼠于檢測前暗適應(yīng)24 h，復(fù)方托吡卡胺滴眼液點雙眼常規(guī)散瞳20 min；采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉劑(v∶v=1∶7)肌注(0.01 mL/kg)麻醉小鼠。檢測操作全程均在弱紅光燈下進行操作。將參考電極和接地電極分別置于小鼠正中頭皮下及雙下肢皮下。將雙側(cè)角膜電極置于大鼠雙側(cè)眼瞼內(nèi)，保持各電極間阻抗始終<5 kΩ。以Ganzfeld全視野刺激器進行刺激，根據(jù)國際臨床視覺電生理協(xié)會(ISCEV)制定的最新國際標(biāo)準(zhǔn)[4]，依次選定暗適應(yīng)0.01 ERG，暗適應(yīng)3.0 ERG，暗適應(yīng)3.0 震蕩電位，(自動明適應(yīng) 10 min)明適應(yīng)3.0 ERG，閃爍光反應(yīng)進行檢測。依次記錄各組a波、b波的峰時值(ms)和振幅值(μV)。

1.2.3 視網(wǎng)膜光鏡觀察

頸椎脫臼法處死小鼠，快速摘取眼球，1 mL注射器角膜穿刺置于4%多聚甲醛固定20 min，解剖顯微鏡下小心去除眼前節(jié)和部分玻璃體，余下組織繼續(xù)固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋。連續(xù)4 μm切片，切片常規(guī)脫蠟至水后行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察視網(wǎng)膜各層病理改變。

1.2.4 視網(wǎng)膜透射電鏡檢測

頸椎脫臼法處死小鼠，快速摘取眼球，立刻置于4℃，2.5%戊二醛中固定0.5 h，顯微鏡下去除眼前節(jié)組織及部分玻璃體，保留視杯，解剖顯微鏡下切取視乳頭顳側(cè)1 mm上方全層眼球壁，大小1 mm× 1 mm × 2 mm。鋨酸固定、梯度酒精脫水、環(huán)氧丙烷樹脂浸透包埋組織，制作900 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛避光染色、風(fēng)干，透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 TUNEL檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡

動物眼球取材固定同HE染色，4%多聚甲醛液中4℃固定24 h后，冰凍包埋劑OCT包埋后液氮冷凍。冰凍切片機-23℃下行垂直視網(wǎng)膜的8 μm冰凍切片。冰凍切片磷酸緩沖液(PBS)室溫15 min ×3次洗脫包埋劑，進行TUNEL檢測，具體操作參見試劑盒說明，完成后進行DAPI復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每組隨機選取10張片子，每張切片計數(shù)一個高倍視野下凋亡的感光細(xì)胞數(shù)及感光細(xì)胞總數(shù)，計算凋亡率。

1.2.6 免疫熒光檢測VEGF及CD31表達

將冰凍切片置于磷酸緩沖液(PBS)室溫10 min × 3次，然后置于1% Triton X-100 溶液30 min，2%牛血清白蛋白的室溫封閉 2 h后依組別分別滴加一抗VEGF，CD31，4℃孵育過夜。PBS溶液室溫洗滌10 min × 3次，滴加羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,室溫下孵育 1 h，PBS清洗10 min × 3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測

暗適應(yīng)0.01 ERG正常組視網(wǎng)膜b波振幅(234.00±20.95)μV，模型組b波振幅(113.00±16.13)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暗適應(yīng)3.0 ERG正常組b波振幅(355.50±61.08)μV，模型組(129.00+18.05)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。暗適應(yīng)3.0 震蕩電位正常組b波振幅(575.00±115.11)μV，模型組(284.25±55.25)μV，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；明適應(yīng)3.0 ERG正常組b波振幅(138.00±17.53)μV，模型組(44.50±7.59)μV，較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；閃爍光反應(yīng)正常組b波振幅(163.00±30.27)，模型組(50.50±11.03)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；見表1。

表1 正常組及模型組視網(wǎng)膜電圖檢測結(jié)果比較Table 1 Electroretinogram (ERG) test between the normal and model groups ± s，n=10)

注：A：正常組,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，細(xì)胞形態(tài)均一，視網(wǎng)膜色素上皮層連續(xù)整齊。B：模型組,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列較為疏松，感光細(xì)胞較正常組減少，視網(wǎng)膜色素上皮層呈現(xiàn)萎縮樣改變，Bruch膜可見中斷，血管樣組織長入(白色箭頭)。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖1 正常組及模型組視網(wǎng)膜病理圖像(HE染色，×400)Note.A, Normal group, the retina layers were arranged regularly, the cell morphology was uniform, and the retinal pigment epithelium layers were continuous and orderly. B, Model group, the arrangement of retinal layers was looser, the number of photoreceptor cells was less than which in normal group, the RPE layer showed atrophic changes, Bruch membrane was interrupted, and vascular-like tissue grew into (white arrow). RGCs：Retinal ganglion cells. INL：Inner nuclear layer. ONL:Outter nuclear layer. RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 1 Pathological changes of the retinas in the normal and model groups(HE staining,×400)

2.2 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)光鏡觀察

正常組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，細(xì)胞形態(tài)均一，視網(wǎng)膜色素上皮層連續(xù)整齊，與正常組相比，模型組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列較為疏松，感光細(xì)胞較正常組減少，視網(wǎng)膜色素上皮層呈現(xiàn)萎縮樣改變，Bruch膜結(jié)構(gòu)破壞，可見血管樣組織長入，部分區(qū)域增厚，部分區(qū)域變薄，感光細(xì)胞計數(shù)正常組為(243.33±15.231)，模型組(164.67±34.37)，模型組感光細(xì)胞數(shù)目明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-9.77,P<0.05)，見圖1。

2.3 視網(wǎng)膜電鏡觀察

正常組小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，色素上皮細(xì)胞線粒體豐富，頂部微絨毛數(shù)量多而且長，Bruch膜結(jié)構(gòu)規(guī)整，厚度均勻。模型組小鼠感光細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)松散變形，出現(xiàn)分離、碎解，固縮等改變。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)色素粒減少，頂部微絨毛較正常組稀疏變短，RPE下可見沉積物，Bruch膜結(jié)構(gòu)不規(guī)整，厚度不均勻，部分出現(xiàn)中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長入，見圖2。

注： A、B正常組，A圖示膜盤結(jié)構(gòu)，B圖示Bruch膜及周圍結(jié)構(gòu)。C-F模型組，C圖可見盤膜結(jié)構(gòu)散亂變形，D-F圖色素上皮細(xì)胞頂部微絨毛稀疏變短，RPE下沉積物(箭頭)，Bruch膜不規(guī)則，可見中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長入(黑色箭頭)。圖2 小鼠視網(wǎng)膜透射電子顯微鏡圖Note. A,B. Normal group. A, Structure of the rod outer segment. B, Bruch membrane and its surrounding structures.C-F. Model groups. C. The disc membrane structure was disorganized and deformed. D-F. the microvilli at the top of the pigment epithelial cells were sparse and shorter, the deposits under RPE (arrow), the Bruch membrane was irregular, and the endothelial cells grew in (black arrow).Figure 2 Transmission electron micrographs of the mouse retinas

注：A:正常組，未見凋亡細(xì)胞；B:模型組，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層可見大量凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈紅色，藍(lán)色為DAPI復(fù)染細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖3 TUNEL檢測正常組及模型組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況Note. A, Normal group, showing no apoptotic cells. B, Model group, showing a large amount of apoptotic cells (red) in the photoreceptor layer of the retina. The cell nuclei were stained as blue by DAPI.(RGCs：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer)Figure 3 Apoptosis in photoreceptor cells of the normal and model groups(TUNEL staining)

2.4 視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況

正常組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞核排列規(guī)整，幾乎未見凋亡細(xì)胞，模型組感光細(xì)胞層細(xì)胞核較正常組減少，可發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，感光細(xì)胞凋亡率(43.00±2.73)%。見圖3。

2.5 視網(wǎng)膜VEGF表達情況

正常組視網(wǎng)膜未見明確的VEGF表達，模型組視網(wǎng)膜色素上皮層及內(nèi)核細(xì)胞層可見較強的VEGF陽性染色。見圖4。

2.6 視網(wǎng)膜CD31表達情況

正常組視網(wǎng)膜未見明確的CD31表達，模型組視網(wǎng)膜色素上皮層可見較強的CD31陽性染色。見圖5。

注：A:正常組，未見明確VEGF染色；B:模型組，視網(wǎng)膜色素上皮層及內(nèi)核層可見VEGF陽性染色呈紅色(白箭)，藍(lán)色信號為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖4 免疫熒光檢測正常組及模型組視網(wǎng)膜VEGF表達情況Note. A， Normal group, showing no VEGF-stained cells. B, Model group, showing VEGF-positive cells in both RPE layer and the inner nuclear layer (white arrow)，and all the cell nuclei were stained as blue by DAPI. RGCs：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 4 VEGF expression in the retina tissues of normal and model groups(Immunofluorescence staining)

注：A:正常組，未見明確CD31染色；B:模型組，視網(wǎng)膜色素上皮層可見CD31陽性染色呈紅色(白箭)，藍(lán)色信號為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖5 免疫熒光檢測正常組及模型組視網(wǎng)膜CD31表達情況Note. A， Normal group, showing no significant CD31-stained cells. B, Model group, showing numerous CD31-positive cells in the retinal pigment epithelium (white Arrows)，and all the cell nuclei were stained as blue by DAPI. RGCS：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 5 CD31 expression in the retinas of the normal and model groups(Immunofluorescence staining)

3 討論

目前用于AMD研究的動物模型種類較多，如AMD易感基因工程動物模型[5]；激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)模型，玻璃體腔注射生長因子誘發(fā)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜新生血管模型，靜脈注射碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型，光致視網(wǎng)膜損傷模型等[6]。模型各有特點，但大多偏重于AMD某種病理特征。部分基因工程小鼠模型雖可以呈現(xiàn)人類AMD的特征性變化，但模型建立費用高昂，動物因免疫缺陷及代謝異常存活率低，不易于普及利用。理想動物模型應(yīng)更近似于臨床AMD發(fā)病過程，大量研究證實衰老、吸煙[7-8]及持續(xù)可見光暴露[9-11]與AMD發(fā)生的關(guān)系密切。故本研究選擇氫醌飼料喂養(yǎng)及慢性可見光暴露模擬AMD發(fā)病的環(huán)境危險因素。氫醌是香煙中的主要有害物質(zhì)，具有極強的氧化性，既往研究證實，置于吸煙環(huán)境中的小鼠可出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮層下沉積物、Bruch膜變薄及RPE細(xì)胞凋亡等改變，與人AMD早期改變類玻璃膜疣形成相似[12]。體外實驗證實，氫醌處理體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞系，可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)過氧化損傷，大量親電子化合物細(xì)胞內(nèi)蓄積并誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞系列損傷[13-16]。本課題組前期實驗利用含0.8 g/(kg·bw)氫醌飼料喂養(yǎng)小鼠3.5月后，觀察到視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜下出現(xiàn)類玻璃膜疣狀物沉積，但光感受器細(xì)胞病變并不明顯[3]。光損傷是AMD另一個重要的環(huán)境危險因素，AMD 發(fā)病與長期低強度光損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)可見光通過光毒性和化學(xué)毒性導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及RPE損傷[17]，實驗證實，應(yīng)用光照強度為2500 lx 的白色光源照射2月齡小型豬3個月后，視網(wǎng)膜發(fā)生慢性損傷，以視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞及感光細(xì)胞凋亡為特點，內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜厚度降低[18-19]。此外研究證實，吸煙與可見光暴露對于視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷還存在交互作用，Zinflou 等[20]實驗發(fā)現(xiàn)香煙煙霧成分可導(dǎo)致RPE細(xì)胞對于藍(lán)光呈現(xiàn)較高的吸收率，導(dǎo)致RPE細(xì)胞光損傷加劇。因此，將吸煙與光照兩種AMD發(fā)病誘因相聯(lián)合，有可能建立與AMD自然病程及病理特點更接近的動物模型。

人類AMD是涉及光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞以及脈絡(luò)膜血管病變的復(fù)雜病理過程。早期病變?yōu)橐暰W(wǎng)膜黃斑區(qū)出現(xiàn)玻璃膜疣狀沉積物drusen，直徑65～125 μm，RPE細(xì)胞無異常改變；進入中期，黃斑區(qū)可見直徑125 μm以上drusen形成，同時伴有RPE細(xì)胞色素紊亂；隨著病情進展，視網(wǎng)膜RPE局灶性脫離，內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞萎縮；晚期可見脈絡(luò)膜新生血管長入Bruch膜或視網(wǎng)膜地圖狀萎縮，前者又被稱為濕性AMD，后者為干性AMD[21]。本實驗選擇C57BL/6近交系小鼠為觀察對象，盡管小鼠視網(wǎng)膜缺乏確切的黃斑結(jié)構(gòu)，但其視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞、Bruch膜及脈絡(luò)膜血管等結(jié)構(gòu)與人類視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)極為類似，因此觀察小鼠視網(wǎng)膜各結(jié)構(gòu)在AMD重要發(fā)病因素作用下的病理變化，可為研究人類AMD的發(fā)生提供客觀的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本實驗將AMD發(fā)病的重要危險因素相聯(lián)合，4月齡C57BL/6小鼠依據(jù)發(fā)育周期已屬于中年[22]，歷經(jīng)3.5個月實驗周期恰好進入老年期；每日以含有0.8 g/(kg·bw)氫醌飼料喂養(yǎng)小鼠模擬吸煙環(huán)境；采用自主設(shè)計的LED冷光源燈架，光源波長范圍為400～750 nm模擬人眼可感知的光波范圍，以光照強度2500 lx每日光照小鼠12 h，進行慢性光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷，既保持動物正常的晝夜節(jié)律，又模擬人類隨著時間進展視網(wǎng)膜細(xì)胞不斷發(fā)生變化的特點，進而對模型組動物視網(wǎng)膜進行功能學(xué)和形態(tài)學(xué)評價。模型組動物ERG結(jié)果暗適應(yīng)0.01 ERG，暗適應(yīng)3.0 ERG以及明適應(yīng)3.0 ERG的b波振幅降低，提示視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞以及內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生損傷，與人類視網(wǎng)膜變性類疾病ERG呈現(xiàn)類似的變化趨勢；電鏡觀察到模型組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞膜盤結(jié)構(gòu)松散變形，碎解，RPE細(xì)胞內(nèi)色素粒減少，下方可見沉積物；上述變化與本課題組前期實驗單純氫醌喂養(yǎng)小鼠結(jié)果一致[3]，此外視網(wǎng)膜還出現(xiàn)Bruch膜結(jié)構(gòu)及厚度均欠規(guī)整，部分出現(xiàn)中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長入等變化。光鏡下不但觀察到模型組視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層細(xì)胞數(shù)量顯著減少(t=-9.77,P<0.05)，RPE細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，還可見血管樣組織由脈絡(luò)膜層向內(nèi)長入，破壞Bruch膜結(jié)構(gòu)，經(jīng)免疫熒光檢測該區(qū)域內(nèi)與血管生長密切相關(guān)的因子VEGF、CD31呈陽性表達，提示病變向中晚期進展。

本研究選擇AMD發(fā)病的高危因素：衰老、吸煙以及持續(xù)可見光暴露建立動物模型，實驗動物不但出現(xiàn)類似于玻璃膜疣的視網(wǎng)膜下沉積物，還可觀察到Bruch膜破壞，血管樣結(jié)構(gòu)由脈絡(luò)膜向內(nèi)長入等更類似于臨床晚期AMD的病理特征。實驗動物選擇遺傳背景清晰的近交系小鼠，個體差異小，模型建立過程操作難度適中，可重復(fù)性高，為進一步研究AMD發(fā)病、預(yù)防及治療提供了較好的研究工具。本次研究未發(fā)現(xiàn)突破RPE層的典型脈絡(luò)膜新生血管組織，可能與觀察時間較短有關(guān)，在今后的研究中延長造模時間，同時增加脈絡(luò)膜鋪片等觀察方法進一步明確CNV的生長和發(fā)展。