姜黃素對小鼠膽汁淤積性肝纖維化的改善作用及其機制研究*

吳 晨， 邱玉保， 孫雪倩， 陳 丹， 吳亞先， 龐慶豐

(江南大學無錫醫(yī)學院， 江蘇 無錫 214122)

許多肝臟疾病，如膽結石，阻塞性黃疸，急性肝炎，原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化等都會常導致肝臟膽汁淤積[1]。 膽汁從肝細胞到腸道的阻塞導致肝臟組織中的膽汁酸積累，導致氧化應激，炎癥，細胞凋亡和纖維化，最終發(fā)展為肝硬化。然而，熊去氧膽酸(UDCA)與巴替酸(OCA)聯(lián)合用藥是迄今為止唯一批準的臨床慢性膽汁淤積性肝病治療方法[2]。但OCA的價格昂貴，費用-療效比不盡樂觀，因此，盡快開發(fā)出大部分患者都可以承擔的膽汁淤積治療藥物極為重要。姜黃素是一種天然黃色多酚，價格適中，因其抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌性質而被認為是一種藥用植物[3]，一些研究報道姜黃素可以上調血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)并抑制各種肝臟疾病，如急性肝損傷[4]，酒精性肝病[5]和肝纖維化[6]，但尚不清楚姜黃素是否對膽汁淤積性肝損傷有保護作用。本研究通過模擬小鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，探討姜黃素對小鼠膽管結扎所致的膽汁淤積性肝纖維化是否具有保護作用及其作用機制，為肝纖維化治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及抗體

姜黃素(Cat#C1386)，鋅原卟啉IX(ZnPP，Cat#282820)，P450還原酶(Cat#C8113)，β-NADPH(Cat#N5130)均購自美國Sigma-Aldrich公司。 天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所。HO-1(Cat#ab13248)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)(Cat#ab9535)的一抗購自美國Abcam公司。小鼠含生長因子樣模體粘液樣激素樣受體(EMR1, 又稱F4 / 80)(Cat#MCA497GA)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗動物分組及模型建立

所有動物實驗均按照相關法律和機構指南進行，并經(jīng)江南大學實驗動物使用倫理委員會批準。BALB/c小鼠(6～8周，體重20～25 g)隨機分為5組：假手術組(n=6)，假手術組+姜黃素組(n=6)，BDL(n=10)，BDL +姜黃素(n=10)和BDL +姜黃素+ ZnPP(n=10)。使所有動物適應適當?shù)沫h(huán)境7 d。BDL組、BDL+姜黃素組以及BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠如文獻所述進行了BDL手術[7]：對小鼠進行開腹后，輕輕剝開肝臟，找到與肝門靜脈伴行的一條透明膽管，用4-0手術線進行兩次結扎，將肝臟復位后，縫合小鼠。假手術組的小鼠如造模組一樣接受剖腹手術并分離了膽管但不進行結扎。BDL手術7 d后，假手術+姜黃素組以及BDL+姜黃素組小鼠每日進行一次姜黃素(30 mg/kg)[8-9]腹腔注射；BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠每日腹腔注射姜黃素(30 mg/kg)以及ZnPP(50 μmol/kg)[10]一次，；假手術組和BDL組，小鼠每日腹腔注射等體積的生理鹽水一次，所有給藥過程持續(xù)7 d。BDL手術14 d后，各組小鼠摘眼球取血，收集肝臟組織，取部分肝組織用4%多聚甲醛固定，進行組織學檢查。另一部分立即儲存在-80℃，用于qRT-PCR、WB、HO-1活性檢測。

1.3 血清生化分析

BDL手術14 d后，各組小鼠摘眼球取血，在4℃冰箱中靜置過夜后，得到血清。

1.3.1 血清谷草轉氨酶 (aspartate aminotransferase, AST) 檢測 采用南京建成生物研究所購買的AST試劑盒進行檢測，簡要操作步驟如下：在測定孔與對照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及天門冬氨酸組成的基質液及5 μl待測血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測定孔與對照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對照孔中加入5 μl待測血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測定孔和對照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標儀510 nm處測各孔OD值。絕對PD值=測定孔OD值-對照孔OD值, 查提前做好的標準曲線得各組相應AST活力單位。

1.3.2 血清谷丙轉氨酶 (alanine aminotransferase, ALT) 檢測 采用南京建成生物研究所購買的AST試劑盒進行檢測，簡要操作步驟如下：在測定孔與對照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及丙氨酸組成的基質液及5 μl待測血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測定孔與對照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對照孔中加入5 μl待測血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測定孔和對照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標儀510 nm處測各孔OD值。絕對PD值=測定孔OD值-對照孔OD值, 查提前做好的標準曲線得各組相應AST活力單位。

1.4 肝臟組織形態(tài)學觀察肝纖維化

將剪成合適大小的肝組織在4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋后切成4 μm切片。根據(jù)標準程序進行HE染色和天狼星紅染色。

1.5 免疫組化檢測肝組織F4 / 80及MPO

取小鼠肝臟組織進行4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)梯度酒精脫水及二甲苯透明處理后，石蠟包埋并用組織切片機進行組織切片。將肝組織切片與HO-1(1∶200稀釋)，F(xiàn)4 / 80(1∶100稀釋)，MPO(1∶50稀釋)一抗和生物素化二抗(1∶200稀釋)孵育適當時間，DAB顯色，在德國卡爾蔡司LAM 510光學顯微鏡下觀察所有切片，使用Image J軟件對免疫組化染色陽性細胞進行統(tǒng)計。

1.6 Western blot檢測肝組織HO-1蛋白表達

參照文獻[11]，稱取各組樣品30 mg，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上勻漿30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，然后收集上清液，BCA法定量。取20 μg蛋白樣品依次經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜、5%脫脂牛奶封閉、HO-1一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h、ECL顯色。GAPDH(1∶10 000)作為內參。

1.7 肝組織HO-1活性檢測

參照文獻[12]，簡要步驟如下：稱取小鼠肝臟組織約30 mg，加入預冷的400 μl含有PMSF的RIPA裂解液，將EP管插放在冰上進行手動勻漿，勻漿完成后以200 s一次的頻率于渦旋儀上渦旋10 s，20 min后，在提前4℃預冷好的離心機中，12 000 r/min離心10 min，收集含有蛋白的上清，并用BCA法測量蛋白濃度。HO-1活性檢測的反應體系為200 μl：25 μmol/L hemin、1 mmol/L NADPH、5 mmol/L去鐵胺、0.6 U細胞色素C、80 μl小鼠肝膽綠素還原酶提取液、200 μg細胞全蛋白、剩余用PBS補足。

1.8 RT-PCRt檢測小鼠肝組織中HO-1 mRNA表達水平

取15 mg各組小鼠肝臟組織，使用RNA prep Pure Tissue Kit制備總RNA。通過260和280 nm處的吸光度比評估樣品的RNA產(chǎn)率和純度。使用PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。 根據(jù)系統(tǒng)方案SYBR Premix Ex Taq(Takara，Japan)進行qPCR。 本研究中的所有引物均由Sangon Biotech (中國上海)合成。定量使用GAPDH作為參照基因的2-ΔΔCt方法。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 姜黃素對BDL誘導的小鼠肝組織形態(tài)學的影響

假手術的小鼠肝臟在14 d時表面光滑，而BDL小鼠顯示出結構改變，肝臟表面出現(xiàn)水腫和纖維化結節(jié)(圖1A)。在組織學檢測中也證實由BDL手術誘導的肝臟特征性形態(tài)學改變，如膽管增生，炎性細胞浸潤，肝小葉被分割、肝細胞腫脹形成不規(guī)則形狀且細胞核被擠壓至邊緣(圖1C)。與假手術組小鼠相比，BDL處理的小鼠肝細胞損傷標記物ALT(P<0.01)和AST(P<0.01)顯著升高(圖1B);另外，BDL小鼠的肝臟重量與體重比與假手術組小鼠相比也出現(xiàn)升高(圖1A)。 補充姜黃素后，這些情況均得到改善，表明姜黃素減弱了BDL誘導的肝損傷。

Fig.1Curcumin attenuated BDL-induced liver injury

(A) BALB/c mice were randomly divided into sham group (n=6), sham+ curcumin group (n=6)，BDL group (n=10) and BDL+ curcumin group (n=10). After two weeks the visceral cavity was opened and the liver to body weight ratio was measured. (B) Serum levels of AST and ALT in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin group (n=10).(C) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.Values represent mean±SD.

2.2 姜黃素對BDL誘導的肝纖維化和炎癥的影響

天狼星紅染色結果(圖2A)顯示，姜黃素+BDL組與BDL組相比，肝組織中膠原蛋白沉積減少，促肝纖維化標志物的mRNA含量也明顯下降(圖2B，2C)，表明連續(xù)7 d以30 mg/kg劑量用姜黃素治療減少BDL導致的肝纖維化。同時，免疫組化染色結果(圖2D,2E)顯示，與BDL組相比，補充姜黃素可顯著減少巨噬細胞標記物F4/80以及中性粒細胞標記物MPO的表達，減輕BDL誘導的炎癥細胞浸潤。這些結果表明，姜黃素對BDL誘導的肝纖維化和炎癥具有減弱作用。

Fig.2Curcumin attenuated BDL-induced liver fibrosis and inflammation

(A) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.mRNA expression levels of collagen type I (B) and TGF-β1 (C) in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. Values represent mean±SD. The obtained liver sections were subjected to immunohistochemical examination with antibody against F4/80 (D) and MPO (E), Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of F4/80-positive cells and MPO-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed.

2.3 姜黃素對肝組織中HO-1表達水平的影響

與假手術組相比，BDL造模14 d后，小鼠肝組織中的HO-1蛋白表達量(圖3A,3C)及mRNA含量(圖3B)均有所上升(P<0.01),在補充姜黃素后，小鼠肝臟HO-1表達量進一步顯著上升。根據(jù)以上實驗結果，我們猜測，姜黃素對小鼠BDL所致的肝纖維化的保護作用可能是通過誘導HO-1表達實現(xiàn)的。

Fig.3Curcumin enhanced mRNA and proteins expression levels of HO-1

(A) The obtained liver sections were subjected toimmunohistochemical examination with antibody against HO-1. Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of ho-1-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed. (B) mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. Values represent mean±SD.

2.4 HO-1抑制劑ZnPP加重BDL誘導的肝損傷

為了進一步驗證我們的假設，我們在補充姜黃素的同時連續(xù)7 d對姜黃素給藥小鼠進行50 μmol/ kg的鋅原卟啉(ZnPP)腹腔注射。ZnPP是血紅素降解途徑中的限速酶，具有特異性抑制HO-1酶活性的能力(圖4A)，而對HO-1的mRNA水平(圖4B)或蛋白質表達(圖4C)沒有影響。在ZnPP處理后的BDL小鼠中，仍然發(fā)現(xiàn)了實質壞死，以及大量新形成的膽管(圖4D)和I型膠原沉積(圖4E)，提示姜黃素對BDL小鼠的保護作用被逆轉。I型膠原蛋白的mRNA水平升高(圖4F)，提示ZnPP消除了姜黃素對BDL小鼠肝纖維化的保護作用。因此我們得出結論，姜黃素對小鼠BDL所致的肝纖維化的保護作用是通過誘導HO-1表達實現(xiàn)的。

3 討論

膽汁淤積性肝損傷是慢性肝病患者肝纖維化和肝硬化發(fā)展的主要致病因素之一，同時臨床上的治療藥物十分有限。為了評估姜黃素對膽汁淤積性肝損傷的影響，我們使用BDL作為實驗模型，發(fā)現(xiàn)補充姜黃素可以改善BDL誘導的肝纖維化和炎癥等肝損傷，其機制可能與HO-1調控有關。

Fig.4HO-1 inhibitor, ZnPP, aggravated BDL-induced liver damage

(A) HO-1 activity was determined in liver. (B)mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. (D) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.(E) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.(F) mRNA expression levels of collagen type I in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+ curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. Values represent mean±SD.

姜黃素是一種黃色多酚類物質，存在于香料姜黃的根莖中，具有抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌作用。近年來，已報道了姜黃素的保肝作用。Anggakusuma[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過影響膜流動性從而抑制病毒結合和融合，從而獨立于基因型和原代人肝細胞抑制HCV進入，Eshaghian等[14]報道姜黃素可減輕BDL大鼠的肝纖維化和胰島素抵抗。在我們的研究中，補充姜黃素可降低血清中ALT和AST的水平，抑制細胞外基質的沉積并減少炎癥細胞浸潤。這些結果與其他研究結果一致，表明姜黃素在肝臟保護中的廣泛應用前景。

核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通過與抗氧化反應元件結合在氧化應激中起關鍵作用[15]，可穩(wěn)定機體內氧化-抗氧化平衡。蔡月琴等[16]發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝炎中，Nrf2及其下游調控因子(HO-1及NQP1等)可對抗氧化應激導致的炎癥反應，減緩疾病進程。HO-1是受Nrf2調節(jié)的主要應激反應因子。之前的研究表明，姜黃素可通過調節(jié)Nrf2 / HO-1途徑直接激活Nrf2表達并減輕肝損傷[17-18]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，可催化游離血紅素代謝產(chǎn)生膽綠素、游離鐵離子和一氧化碳，具有突出的抗炎和抗氧化作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素通過提高HO-1的表達來改善實驗性肝臟膽汁淤積，當我們使用HO-1抑制劑ZnPP時，保護效果大大減弱。ZnPP是血紅蛋白合成時形成的一種微量正常代謝產(chǎn)物，是臨床上治療高膽紅素血癥的潛在藥物，藥效溫和，因此，我們有理由推測，ZnPP逆轉姜黃素對于實驗性肝臟膽汁淤積的保護作用是由于其特異性抑制了HO-1的活性，而非對機體造成了損害[19]。

綜上所述，本研究建立了模擬臨床狀態(tài)下小鼠肝纖維化模型，采用HO-1活性抑制劑ZnPP進行干預，顯示姜黃素可通過提高HO-1表達來減輕BDL所致的小鼠膽汁淤積性肝硬化，為臨床上有效地治療肝纖維化提供新的分子靶點和治療策略。