NCOA1和RBP4基因多態(tài)性與大白豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

王斌虎，邱梅玉，趙玉強(qiáng)，謝蘇，孫曉梅，來紅霞，黃濤*

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2 新疆正大食品有限公司,新疆 五家渠 831301)

我國是生豬養(yǎng)殖和豬肉消費(fèi)第一大國。在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，母豬繁殖性能是決定豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。大量的研究表明，豬的繁殖性狀是受主效基因和微效多基因的共同調(diào)控的低遺傳力經(jīng)濟(jì)性狀，采用常規(guī)育種進(jìn)展緩慢。而運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇可以提高選種的準(zhǔn)確性，并加快選育進(jìn)程。

NCOA1(核受體輔激活因子1)，又稱為類固醇受體輔激活蛋白1基因，能夠影響黃體的產(chǎn)生，為影響繁殖性能的“關(guān)鍵因子”，其轉(zhuǎn)錄活性可調(diào)控雄激素受體和雌激素受體的表達(dá)[1]。NCOA1基因在卵巢、垂體、肝臟和肺中高表達(dá)，而在背最長肌中低表達(dá)[2]，并調(diào)控子宮的發(fā)育過程[3-4]。王珊等[5]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘與綿羊繁殖性狀顯著相關(guān)SNPs,其中部分SNP位于NCOA1基因內(nèi)部。豬的NCOA1基因位于3號(hào)染色體上，大量研究表明該基因存在三種形式的單核苷酸(TT、TC、CC)，并且其多態(tài)性可能對(duì)母豬的繁殖性能產(chǎn)生影響。

RBP4(視黃醇結(jié)合蛋白4)是孕期母體分泌的重要蛋白之一,其含量在囊胚擴(kuò)張時(shí)期迅速升高,對(duì)胚胎的存活至關(guān)重要，其基因的多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)密切相關(guān)[6-7]。RBP4基因能夠影響精子和卵子產(chǎn)生、胚胎著床、胎盤發(fā)育、胎兒生長與發(fā)育,對(duì)子宮腔相應(yīng)組織靶細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用[8]。翟騰蛟等[9]對(duì)大白豬和長白豬群體的RBP4基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此基因存在多態(tài)性，且對(duì)產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重等性狀具有顯著影響。

大白豬是世界范圍內(nèi)使用最為廣泛的純種母豬，其繁殖性能對(duì)養(yǎng)豬業(yè)極其重要。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)NCOA1和RBP4基因可能對(duì)母豬繁殖性能產(chǎn)生影響[10]，但由于以往研究報(bào)道結(jié)果不盡相同，同時(shí)缺乏針對(duì)大白母豬的相關(guān)研究，因此本試驗(yàn)探究了NCOA1和RBP4對(duì)大白母豬繁殖性能的影響，以期為大白豬的遺傳選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

耳組織樣和繁殖數(shù)據(jù)均來自新疆正大，包括在2014—2016年期間685頭母豬(大白)的分娩日期數(shù)據(jù)、胎次數(shù)據(jù)、繁殖性狀數(shù)據(jù)。繁殖性狀的主要指標(biāo)有總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)、總活仔數(shù)(NBA)、健仔數(shù)(NHB)、死胎、木乃伊胎以及其初生窩重，其中初產(chǎn)685胎，經(jīng)產(chǎn)2 164胎，共計(jì)2 849胎。

1.2 主要試劑、儀器

試驗(yàn)儀器包括TC-4000 PCR儀、微波爐、水平電泳槽、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、GelDocTM XR電泳凝膠成像系統(tǒng)。試劑包括組織基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN)、瓊脂糖、DNA限制性內(nèi)切酶RsaⅠ、DNA 限制性內(nèi)切酶MspⅠ(TaKaRa)、Marker DL500。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取

切取豬耳組織樣少許，于透明EP管中剪碎，遵循DNA提取試劑盒內(nèi)提供的使用說明書進(jìn)行提取，分別利用瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其DNA的純度和濃度，稀釋至50 ng/μL于-20 ℃保存，用于后續(xù)研究。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

通過Premier5設(shè)計(jì)所需目標(biāo)基因片段的上下游引物，由上海生工技術(shù)公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.3.3 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系(20 μL)：2×Es TaqMaster Mix 10 μL，去離子水7.4 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL。NCOA1目的片段擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)35次(94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s)，72 ℃ 延伸 5 min，4 ℃保存1 h；RBP4僅退火溫度變?yōu)?6 ℃，其余反應(yīng)條件同NCOA1。

1.3.4 PCR-RFLP檢測(cè)

分別用RsaⅠ、MspⅠ對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)。RFLP反應(yīng)體系：DNA擴(kuò)增產(chǎn)物12 μL，10×Buffer 1.5 μL，限制性內(nèi)切酶0.5 μL，37 ℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物分別采用4.0 %、2.0 % 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)片段形態(tài)判斷基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)NCOA1、RBP4的基因型，計(jì)算其相應(yīng)的基因型頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(NE)，并進(jìn)行H-W檢驗(yàn)。

本試驗(yàn)建立的統(tǒng)計(jì)分析模型(最小二乘法分析)：yijkl=μ+Bi+Sj+Gk+eijkl。其中y為繁殖性狀(TNB、NBA、NHB)的觀察值，μ為群體的均值，Bi為胎次效應(yīng)(初產(chǎn)、經(jīng)產(chǎn)分別作為胎次效應(yīng)1、2)，Sj為季節(jié)效應(yīng)(年度的1～3月份、4～6月份、7～9月份、10～12月份分別作為季節(jié)效應(yīng)1、2、3、4)，Gk為年度效應(yīng)(2014、2015、2016分別作為年度效應(yīng)1、2、3)，eijkl為隨機(jī)殘差。利用SAS(Version 9.2)軟件分別對(duì)試驗(yàn)豬群多態(tài)位點(diǎn)的單基因型、合并基因型與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCOA1和RBP4基因基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

NCOA1的多態(tài)性位點(diǎn)位于該基因DNA正鏈的1 863 bp～2 302 bp處，長度為440 bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切反應(yīng)后，用基因型檢測(cè)凝膠電泳(2.0 % 的瓊脂糖)得到3種帶型(圖1)：440 bp(AA型)、440/282/158 bp(AB型)、282/158 bp(BB型)。

M：DNA Marker；1/3/4/5/6/8/9/10/12/13：AA基因型；2/7：AB基因型；11：BB基因型圖1 NCOA1基因擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR-RFLP 電泳圖Fig.1 NCOA1gene amplification product PCR-RFLP electropherogram

RBP4的多態(tài)性位點(diǎn)位于該基因DNA正鏈的600 bp～1 164 bp處，長度為565 bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切反應(yīng)后，用基因型檢測(cè)凝膠電泳(4.0 % 的瓊脂糖)得到3種帶型(圖2)：190/154/136 bp AA型)、190/154/136/125/29 bp(AB型)、190/136/125/29 bp(BB型)。

M：DNA Marker；9/11：AA基因型；5/6/7/13:AB基因型；1-4/8/10/12：BB基因型圖2 RBP4基因擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR-RFLP 電泳圖Fig.2 RBP4gene amplification product PCR-RFLP electropherogram

2.2 NCOA1和RBP4基因多態(tài)性頻率分布

在試驗(yàn)?zāi)肛i群體中，NCOA1檢測(cè)到AA、AB和BB 3種基因型，其中AA型為優(yōu)勢(shì)基因型,A為優(yōu)勢(shì)等位基因，群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(表2)。RBP4檢測(cè)到AA、AB和BB 3種基因型，BB型為優(yōu)勢(shì)基因型，B為優(yōu)勢(shì)基因，其群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，其原因可能是在育種過程中對(duì)RBP4基因進(jìn)行了選擇。

表2 群體遺傳學(xué)分析Tab.2 Population genetic analysis

注：Ho為純合度，He為雜合度，NE為有效等位基因，PIC為多態(tài)性信息含量；PIC>0.5為高度多態(tài)，0.25

2.3 NCOA1和RBP4基因的遺傳效應(yīng)

分別計(jì)算了NCOA1基因和RBP4基因的顯性效應(yīng)、加性效應(yīng)、顯性度，以及每個(gè)等位基因的效應(yīng)(表3)。

NCOA1基因的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、健仔數(shù)的顯性效應(yīng)和加性效應(yīng)在經(jīng)產(chǎn)豬中均為正值，RBP4基因相反；RBP4基因在經(jīng)產(chǎn)豬群中A基因效應(yīng)均表現(xiàn)為正值，B基因效應(yīng)均表現(xiàn)為負(fù)值。

由表可知，NCOA1基因的加性效應(yīng)在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)和健仔數(shù)性狀中均表現(xiàn)為正值，但是顯性效應(yīng)卻在初產(chǎn)母豬的總活仔數(shù)和健仔數(shù)性狀中表現(xiàn)為負(fù)值；RBP4基因的顯性效應(yīng)在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)和健仔數(shù)性狀中均表現(xiàn)為負(fù)值，但是加性效應(yīng)卻在初產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)和總活仔數(shù)中表現(xiàn)為正值；基因效應(yīng)的整體數(shù)據(jù)說明NCOA1基因具有雜合優(yōu)勢(shì)，而RBP4基因具有純合優(yōu)勢(shì)，其部分反常表現(xiàn)均集中在初產(chǎn)母豬群體，可能與母豬的首次分娩的生理體征有關(guān)。

表3 NCOA1和RBP4的基因效應(yīng)Tab.3 Gene effects of NCOA1and RBP4

注：TNB為總產(chǎn)仔數(shù)、NBA為總活仔數(shù)、NHB為健仔數(shù)，a為加性效應(yīng)，d為顯性效應(yīng)，D為顯性度，下同。

2.4 NCOA1和RBP4基因型對(duì)初產(chǎn)大白豬繁殖性能的影響

根據(jù)GLM(廣義線性模型)的最小二乘法，計(jì)算了不同基因型以及組合基因型對(duì)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎、木乃伊、初生窩重的大小，并對(duì)其做了差異顯著性檢驗(yàn)(表4)。由于NCOA1基因BB型個(gè)體只有1個(gè)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)該舍棄該基因型。

在初產(chǎn)母豬群體中，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：NCOA1基因的總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)和初生窩重都為AB型>AA型，而木乃伊數(shù)結(jié)果相反；RBP4基因在總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)方面均表現(xiàn)為BB型>AA型>AB型,且在BB型總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AB型0.57頭(P<0.05)。對(duì)于NCOA1和RBP4的合并基因型，AABB型的總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AAAB型(P<0.05)，總產(chǎn)仔數(shù)的優(yōu)勢(shì)組合ABBB型比AAAB型總產(chǎn)仔數(shù)高出0.85頭；ABAB型在活仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重方面均表現(xiàn)為最優(yōu)合并基因型，而AAAB型相反；ABBB型的死胎數(shù)比AAAB型高出0.34頭(P<0.05)。

表4 NCOA1和RBP4基因型對(duì)初產(chǎn)母豬繁殖的影響Tab.4 Effect of NCOA1and RBP4genotypes on reproduction of primiparous sows

注：表格中的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；肩標(biāo)有相同字母或無字母代表差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不相同代表差異顯著(0.01

2.5 NCOA1和RBP4基因型對(duì)經(jīng)產(chǎn)大白豬繁殖性能的影響

在經(jīng)產(chǎn)母豬群體中，NCOA1基因的總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、健仔數(shù)、木乃伊數(shù)、死胎數(shù)和初生窩重都為AB型>AA型；RBP4基因在總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重方面均表現(xiàn)為AA型>BB型>AB型,且AA型健仔數(shù)極顯著高于AB型0.43頭(P<0.01),AA型初生窩重極顯著高于AB型0.67千克(P<0.01)。對(duì)于NCOA1和RBP4的合并基因型，ABBB型的總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、死胎數(shù)均高于AAAB型且分別達(dá)到極顯著、顯著和極顯著水平(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，總產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、死胎數(shù)分別高出0.85頭、0.72頭、0.19頭；ABBB型的死胎數(shù)與極顯著高于AAAA、AAAB、AABB型(P<0.01)；AAAA型個(gè)體的初生窩重比AAAB型高0.82千克(P<0.01)(表5)。

3 討 論

3.1 NCOA1基因?qū)Υ蟀啄肛i繁殖性能的影響

在本研究中以685頭初經(jīng)產(chǎn)母豬為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)母豬中AA型590胎、AB型94胎、BB型僅有1胎；在2164胎經(jīng)產(chǎn)母豬中AA型1852胎、AB型308胎、BB型僅有4胎。與本文類似的是，李永輝等[11]在試驗(yàn)豬群中未檢出BB型個(gè)體，吳華莉等[12]在試驗(yàn)豬群中檢測(cè)出BB型個(gè)體數(shù)極少。以上結(jié)果提示NOCA1基因的BB型個(gè)體可能在胚胎期致死、流產(chǎn)，也可能已經(jīng)在現(xiàn)代豬育種過程中對(duì)優(yōu)勢(shì)基因的選擇、劣勢(shì)基因的淘汰選擇壓的人為影響，但還需要進(jìn)一步證實(shí)。

李永輝等[11]發(fā)現(xiàn)在長白豬和大白豬中總仔數(shù)和健仔數(shù)都呈現(xiàn)AA型>AB型>BB型，吳華莉等[12]發(fā)現(xiàn)杜洛克和大白群體內(nèi)總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)和初生窩重都表現(xiàn)AA型>AB型>BB型的趨勢(shì)。但在本試驗(yàn)?zāi)肛i群體中發(fā)現(xiàn)NCOA1基因型對(duì)初產(chǎn)母豬的繁殖性能沒有顯著影響，在經(jīng)產(chǎn)母豬中AB型總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA型，其原因可能是其研究受母豬群體影響。而在水貂的研究中，霍自雙等[13]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCOA1基因的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)上呈現(xiàn)為BB型>AB型>AA型的趨勢(shì),AB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均極顯著高于AA基因型(P<0.01)。

上述結(jié)果表明NCOA1對(duì)多個(gè)物種的繁殖均有影響，但在不同的物種和群體之間結(jié)果存在差異，而針對(duì)特定群體的遺傳改良可能需要對(duì)特定群體進(jìn)行研究。

3.2 RBP4基因?qū)Υ蟀啄肛i繁殖性能的影響

在本研究中，RBP4基因經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)、初生窩重均表現(xiàn)為AA型>BB型>AB型，且AA型個(gè)體的健仔數(shù)、初生窩重極顯著高于AB型(P<0.01)，與翟騰蛟等[9]以及朱朋等[14]研究結(jié)果相一致。但是，胡閃耀等[15]研究發(fā)現(xiàn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)均表現(xiàn)為BB型個(gè)體高于AA型個(gè)體，與本研究結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)榄h(huán)境效應(yīng)或群體遺傳背景的差異等因素造成。昌文林等[16]研究發(fā)現(xiàn)RBP4在在大白豬群體中,AA基因型母豬比BB基因型母體每窩次平均多產(chǎn)0.94頭仔豬,與本試驗(yàn)的經(jīng)產(chǎn)結(jié)果相符，但是初產(chǎn)的總仔數(shù)和活仔數(shù)存在差異，這一結(jié)果可能受初產(chǎn)母豬繁殖生理特征有關(guān)。上述結(jié)果提示RBP4在不同豬群體中的影響也表現(xiàn)出差異。

3.3 NCOA1和RBP4合并基因分析對(duì)大白母豬繁殖性能的影響

關(guān)于NCOA1和RBP4的合并分析尚未見報(bào)道，在初產(chǎn)母豬中，總產(chǎn)仔數(shù)最優(yōu)組合基因型為ABBB，活仔數(shù)、健仔數(shù)和出生窩重最優(yōu)組合基因型為ABAB，而AAAB型在上述4個(gè)性狀中均表現(xiàn)最差；在本文中發(fā)現(xiàn)ABBB型在經(jīng)產(chǎn)母豬中的總仔數(shù)、活仔數(shù)、健仔數(shù)和出生窩重上也是最優(yōu)基因組合，而AAAB型的經(jīng)產(chǎn)母豬則最差。

綜上所述，在此大白豬群體中：ABBB型為初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬最優(yōu)合并基因組合，AAAB型為初、經(jīng)產(chǎn)母豬最劣基因組合，在此群體的選育和實(shí)際生產(chǎn)中可利用NCOA1和RBP4作為分子標(biāo)記進(jìn)行淘汰或選配，提高豬群整體繁殖性能。