谷氨酰胺對急性肝衰竭大鼠腸上皮細胞線粒體凋亡途徑的調(diào)控作用*

陳 鵬 張文斌 王 瑤 焦方舟 王魯文 龔作炯

武漢大學人民醫(yī)院感染科 (湖北 武漢，430071)

急性肝衰竭是由多種因素引起的肝細胞大量壞死及炎癥細胞浸潤而導致的臨床綜合征，以起病急、并發(fā)癥多、病死率高為主要特征，目前尚缺乏有效的預防和治療措施。肝衰竭患者存在著嚴重的腸道微生態(tài)失衡，保護腸黏膜可能成為治療急性肝衰竭的一個策略。有研究報道谷氨酰胺對腸道黏膜屏障具有保護作用，但該藥對腸道作用的保護機制尚未完全闡述清楚[1，2]。本研究探討了谷氨酰胺對急性肝衰竭大鼠腸上皮細胞凋亡的影響及其相關機制，為急性肝衰竭的治療提供新方法與理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 VICTOR3 1420型酶標儀購自芬蘭 PerkinElmer 公司；日立自動生化分析儀購自日本Hitachi公司; 電泳儀購自北京六一儀器廠 ；蛋白掃描儀購自德國EPSON公司；BX53型生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche Applied Science，DAPI購自武漢碧云天公司，脂多糖(LPS)、D-氨基半乳糖(D-Gal)、L-谷氨酰胺顆粒均購自美國 Sigma Aldrich 公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；10%中性甲醛購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 雄性健康SPF級SD大鼠45只，體質量270～290 g，購自武漢大學動物實驗中心。飼養(yǎng)條件為(25±2)℃，(50±15)%的相對濕度，正常的晝夜節(jié)律(12 h黑暗/12 h光照)。研究方案嚴格按國際公認原則及武漢大學實驗室動物護理和使用原則進行。

1.3 實驗方法 45只大鼠SD雄性隨機分為3組，即正常組、模型組、谷氨酰胺組，每組15只。實驗前，所有大鼠適應喂養(yǎng)1周。模型組和谷氨酰胺組大鼠采用腹腔注射D-Gal 400 mg/kg和 LPS 100 μg/kg的方法制備急性肝衰竭模型。谷氨酰胺組大鼠在造模前3 d給予L-谷氨酰胺0.5 g/kg灌胃處理，1次/d，至造模后24 h。正常組和模型組大鼠每天給予生理鹽水灌胃。在造模后 48 h，觀察記錄各組大鼠生存情況，處死大鼠，收集每只大鼠眼靜脈血液約3 ml。 取15 cm左右小腸腸組織，經(jīng)pH 7.4的PBS清洗后，凍存于-80℃冰箱中，以備熒光染色、提取蛋白，其余腸組織標本經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，用于HE染色。

1.4 檢測指標 ①肝功能：全自動生化分析儀檢測3組大鼠外周靜脈血丙氨酸氨基轉移酶(ALT) 、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST) 和總膽紅素(TBil)的水平，操作均嚴格按試劑盒說明進行。②鏡檢腸組織：分別取各組經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的小腸組織，把修整好的蠟塊進行切片，片厚4μm，將切片依次放入二甲苯、無水乙醇、蒸餾水中清洗。Harris蘇木精染色切片5 min，自來水沖洗后把切片放入伊紅染液中染色2 min。依次將切片放入無水乙醇、二甲苯中脫水至透明，晾干后樹膠封片。光鏡下觀察各組小腸組織病理學變化。③小腸上皮細胞凋亡檢測：分別取3組大鼠小腸組織，酒精脫水、浸蠟、包埋、切片和烤片。切片脫蠟后滴加蛋白酶K工作液10～20 μg/ml制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μl 末端脫氧核酸轉移酶(TdT+450 μl熒光素標記的dUTP液混勻；而對照組標本僅加50 μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組標本先加入100 μl DNase I。在15～25 ℃孵育10 min，吸水紙擦干玻片后加50 μl TUNEL反應混合液于標本上，37 ℃避光孵育60 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min。 滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST 5 min×4次， 用吸水紙吸干玻片上液體，用封片液封片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，采集圖像，隨機選取3個高倍視野(200倍)，觀察陽性細胞數(shù)，計算其標記指數(shù)(各視野陽性細胞數(shù)/視野所有細胞)，并計算凋亡指數(shù)(各視野標記指數(shù)的平均值)。④腸組織線粒體凋亡蛋白檢測：稱取適量腸組織進行勻漿提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE凝膠，每孔加樣50 μg進行電泳，轉膜后5%脫脂奶粉37℃搖床封閉1 h；洗膜，孵一抗，4 ℃搖床過夜，洗膜，室溫下?lián)u床孵二抗1h，洗膜，采用Odyssey系統(tǒng)掃膜，分析Bcl-2、Bax及Cyt-c的蛋白相當表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠生存狀況 正常組15只大鼠全部存活，存活率100%；模型組大鼠死亡8只大鼠，存活7只，存活率46.7%；谷氨酰胺組大鼠死亡4只，存活11只，存活率 73.3%。谷氨酰胺組大鼠的存活率高于模型組，P<0.05。

2.2 實驗結束時3組大鼠血清ALT、AST和TBil檢測結果 見表1。

表1 3組大鼠血清肝功能結果比較

與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.01

2.3 實驗結束時各組大鼠腸黏膜光鏡觀察結果 HE染色結果顯示正常組大鼠腸黏膜上皮完整，上皮細胞排列整齊，無細胞腫脹(見彩插頁圖1a)；模型組大鼠腸黏膜部分上皮細胞脫落，上皮細胞明顯腫脹(見彩插頁圖1b)；谷氨酰胺組大鼠腸黏膜萎縮和細胞腫脹程度均較模型組減輕(見彩插頁圖1c)。

2.4 實驗結束時小腸上皮細胞凋亡檢測情況 正常組大鼠小腸黏膜DAPI染色熒光顯微鏡下可見腸黏膜上皮細胞排列整齊，腸上皮細胞組成的外周藍色熒光帶無缺損，Tunel染色可見少量紅染的腸上皮凋亡細胞；模型組大鼠腸DAPI染色可見腸黏膜上皮細胞排列錯亂，外周藍色熒光帶殘缺，Tunel染色可見大量紅染的腸上皮凋亡細胞；谷氨酰胺組DAPI染色可見腸黏膜上皮細胞欠整齊，外周藍色熒光帶可見微小的殘缺，Tunel染色可見少量紅染腸上皮凋亡細胞；融合圖片提示谷氨酰胺組腸上皮細胞凋亡較模型組顯著減少，但仍高于正常組。

2.5 各組大鼠小腸上皮細胞調(diào)亡指數(shù) 見表2。

表2 各組大鼠小腸腸上皮細胞調(diào)亡指數(shù)比較

與正常組比較，#P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01

2.6 3組大鼠腸組織線粒體凋亡途徑蛋白表達情況 見圖2。Western blot結果顯示與正常組相比，模型組大鼠腸組織中Bax、Cyt-c 蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達較正常組低(P<0.05)，Bcl-2/Bax值較正常組下降；而谷氨酰胺組大鼠Bax、Cyt-c 蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 蛋白表達水平則顯著高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值較模型組也顯著升高。

圖2 3組大鼠腸組織線粒體調(diào)亡途徑蛋白表達情況

3 討論

谷氨酸是人體中最豐富的游離氨基酸，體內(nèi)大部分的谷氨酰胺都會在腸道內(nèi)代謝，是腸道細胞利用的主要營養(yǎng)物質，在維持腸道生理和對抗多種腸道疾病的治療中起著重要的作用[3]。在腸道生理中，谷氨酰胺具有促進腸細胞增殖，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白，抑制促炎癥信號通路，并在正常和病理條件下保護細胞，抵抗細胞的凋亡[2,4]。在一項谷氨酰胺強化的早期腸內(nèi)營養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，補充谷氨酰胺能夠改善肝移植大鼠腸黏膜的血供，降低腸黏膜丙二醛的產(chǎn)生,有助于腸道正常分泌SIgA，抑制腸黏膜巨噬細胞NF-κB活性，減少腫瘤壞死因子-α等炎癥細胞因子的產(chǎn)生，從而改善肝移植腸黏膜損傷情況，抑制腸道細菌和內(nèi)毒素的移位[5]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠谷氨酰胺的缺乏則可增加腸上皮細胞的凋亡[6]。這些研究均表明谷氨酰胺對腸道黏膜具有重要的保護作用。

線粒體凋亡途徑是細胞發(fā)生凋亡的一種重要方式，主要由Bcl-2 家族蛋白調(diào)控，包括抑制凋亡的 Bcl-2 家族蛋白(如 Bcl-2 和 Bcl-xL)和促進凋亡的 Bcl-2 家族蛋白(如BMF、 Bid、Bax 和 Bak)[7]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2表達增加則能夠通過降低線粒體膜的通透性、抑制線粒體去極化及Cyt-C釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則可促進Cyt-C釋放，促進細胞的凋亡作用[8]。Kallweit等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以預防腸上皮細胞在受熱損傷和氧化損傷時細胞的凋亡，一方面是通過增強保護性熱休克蛋白的表達，另一方面是通過降低CC-3(cleaved caspase-3)的表達來實現(xiàn)。他們認為谷氨酰胺并不是直接降低CC-3的表達而直接發(fā)揮預防凋亡的作用，可能存在另外的中間體來發(fā)揮抗凋亡作用。而在線粒體凋亡途徑凋亡途徑中，釋放到細胞質的Cytc在dATP存在的條件下通過一系列的級聯(lián)反應，最終能激活Caspase-3，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應，從而誘發(fā)細胞凋亡[10,11]?；谶@些研究我們推測線粒體凋亡途徑可能參與了腸上皮細胞的凋亡，急性肝衰竭病程中出現(xiàn)的腸道功能障礙，影響急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，谷氨酰胺可能通過線粒體凋亡抑制腸上皮細胞凋亡，改善腸道功能，而進一步減緩急性肝衰竭的進展，為谷氨酰胺治療急性肝衰竭提供新的理論依據(jù)。

我們的研究結果提示，谷氨酰胺可以提高急性肝衰竭大鼠的生存率，可通線粒體凋亡途徑，抑制、減少腸上皮細胞凋亡，減輕急性肝衰竭過程中腸黏膜的損傷，改善肝功能。目前尚未見谷氨酰胺用于急性肝衰竭臨床治療的報道。已經(jīng)有學者將谷氨酰胺作為干預劑改善重度慢性乙型肝炎腸道功能，結果顯示具有較好的腸道保護功能，能明顯改善內(nèi)毒素血癥[12]。我們期待有更多的大樣本的臨床研究資料，提供更充足的證據(jù)證明谷氨酰胺在急性肝衰竭中的治療價值。