轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品CaMV 35S啟動(dòng)子基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中引物探針序列特征及影響

楊杰　李蘭　戴莉　張江國(guó)　莫善明　徐新龍

摘要? [目的]分析不同標(biāo)準(zhǔn)方法中CaMV 35S啟動(dòng)子基因篩查方法中引物探針位置關(guān)系，討論以引物探針序列重組為陽(yáng)性對(duì)照樣品的可行性。[方法]收集國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法中CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)引物探針序列與CaMV參考序列比較，確定其引物探針位置特點(diǎn)。設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度間隔序列的串聯(lián)引物探針重組序列，檢測(cè)其結(jié)果差別。[結(jié)果]CaMV 35S啟動(dòng)子基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中引物與探針區(qū)間隔序列對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響甚微。[結(jié)論]通過將引物探針序列順序串聯(lián)合成重組序列可以作為特定實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性對(duì)照。

關(guān)鍵詞? 轉(zhuǎn)基因;CaMV 35S啟動(dòng)子;實(shí)時(shí)熒光PCR;陽(yáng)性樣品

中圖分類號(hào)? Q785??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào)? 0517-6611（2019）24-0192-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.058

Characteristics and Effects of Primer Probe Sequences in Real-time Fluorescent PCR Detection Method for GMO Products CaMV 35S Promoter Gene

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al? （Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract? [Objective]The research aimed to analyze the position relationship of primer probe in different standard methods for CaMV 35S promoter gene screening detection method，and discuss the feasibility of using primer probe sequence recombination as positive control sample.[Method]The primer and probe sequence of CaMV 35S promoter gene detection in domestic standard methods was compared with the CaMV genome reference sequence，to determine the position characteristics of the primer and probe.[Result]The interval sequence between primers and probes in real-time PCR detection of CaMV 35S promoter gene had little effect on amplification results.[Conclusion]By combining primer probe sequences into recombinant sequences，it can be used as a positive control for specific real-time PCR detection methods.

Key words? GMO;CaMV 35s promoter;Real-time fluorescent PCR;Positive control sample

基金項(xiàng)目? 新疆維吾爾自治區(qū)國(guó)際合作項(xiàng)目（20166012）。

作者簡(jiǎn)介?? 楊杰（1986—），男，新疆烏魯木齊人，助理工程師，從事轉(zhuǎn)基因及微生物檢測(cè)工作。*通信作者，高級(jí)農(nóng)藝師，從事實(shí)驗(yàn)室管理及出入境植物檢疫工作。

收稿日期? 2019-06-04

隨著基因工程技術(shù)在遺傳育種方面相關(guān)的研究中不斷加深，轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)日漸成熟，其在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用和種植越來越廣泛，在國(guó)際農(nóng)業(yè)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易過程中都起到了舉足輕重的作用。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（internarional service for the acquisition of afri-bio-tech applications，ISAAA）官方數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2019年4月，全球各國(guó)總計(jì)批準(zhǔn)了31個(gè)物種共計(jì)517個(gè)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因事件的加工或種植，并且這個(gè)數(shù)量每年仍有數(shù)以十計(jì)的數(shù)量在不斷增長(zhǎng)[1]。

在一個(gè)轉(zhuǎn)化事件的開發(fā)過程中，插入基因片段的構(gòu)建是工作的核心，插入片段大都是以一個(gè)或多個(gè)由啟動(dòng)子-目的基因-終止子構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄單元串聯(lián)而成。目前在世界各國(guó)已經(jīng)通過審批允許貿(mào)易、加工和種植的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物中，花椰菜花病毒（簡(jiǎn)稱CaMV）35S啟動(dòng)子是使用最為成熟的外源啟動(dòng)子序列之一。完整的CaMV 35S啟動(dòng)子具有在多數(shù)植物及部分真菌中均能高效轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)，這使其能夠被廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、土豆等各種主要糧食及經(jīng)濟(jì)作物的基因工程改造工作中[2]，目前根據(jù)國(guó)際生物安全信息交換所（biosafety clearing-house，BCH）中的信息記錄，插入基因片段的結(jié)構(gòu)中涉及CaMV 35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化事件已經(jīng)多達(dá)368個(gè)[3]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展的過程中，轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品的安全性一直是世界范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。為了保障各個(gè)國(guó)家生態(tài)環(huán)保及社會(huì)政治經(jīng)濟(jì)等方面的需求，各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的種植貿(mào)易加工都有著不同程度的管理規(guī)定，而是否具備成熟的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法體系就成為這些監(jiān)管政策是否可以順利實(shí)施的先決條件。由于CaMV 35S啟動(dòng)子基因在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)，通過對(duì)食品農(nóng)產(chǎn)品中CaMV 35S啟動(dòng)子基因的篩查成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)方法中應(yīng)用最為常用的手段，不同國(guó)家和地區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)基因成分中CaMV 35S啟動(dòng)子基因篩查大多建立了國(guó)家、地區(qū)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

然而不同產(chǎn)品不同范圍的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中，CaMV 35S啟動(dòng)子的檢測(cè)所采用的引物探針序列不盡相同。對(duì)于Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)而言，其檢測(cè)的特異性取決于引物探針序列，與引物探針結(jié)合區(qū)域之間的序列無(wú)關(guān)。該研究旨在通過對(duì)目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)行有效的13個(gè)不同對(duì)象轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法[5-17]中CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)片段的序列特點(diǎn)進(jìn)行分析，建立在人工合成引物及探針序列中插入不同長(zhǎng)度間隔序列作為比較對(duì)象的模型，通過將這些不同長(zhǎng)度的重組序列與陽(yáng)性物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，比較引物與探針序列之間不同長(zhǎng)度插入片段對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果是否產(chǎn)生明確影響，從而確定僅用引物及探針序列信息進(jìn)行重組構(gòu)建的序列作為特定轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法陽(yáng)性對(duì)照模板的可行性。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 陽(yáng)性物質(zhì)。試驗(yàn)采用 2016年由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的糧食轉(zhuǎn)基因檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃（計(jì)劃編號(hào)：ACAS-PT215）中檢出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因玉米粉作為陽(yáng)性物質(zhì)。

1.1.2? 重組序列及引物、探針。試驗(yàn)所用重組序列片段、引物序列及水解探針均由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3? 主要試劑。植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;FastStart Essential DNA Probes Master預(yù)混液購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;瓊脂糖凝膠及DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.4? 主要儀器。Roche LightCycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，ABI 9700 型PCR儀。

1.2? 方法

1.2.1? CaMV 35S啟動(dòng)子基因不同檢測(cè)片段特征分析。

通過NCBI檢索獲得花椰菜花葉病毒全基因組參考序列（編號(hào)：NC_001497），使用DNAMAN軟件分析對(duì)SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》、 GB/T 19495.4—2018 《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法》、農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)調(diào)控元件CaMV 35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》等13個(gè)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)引物及探針序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)檢測(cè)片段在基因中的位置，從而分析不同標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中實(shí)時(shí)熒光PCR的上下游引物及探針之間的間隔序列的長(zhǎng)度特征。

1.2.2? 不同長(zhǎng)度插入片段的CaMV 35S檢測(cè)陽(yáng)性重組序列設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)5條插入片段長(zhǎng)度不同的陽(yáng)性重組序列，序列信息詳見表1。

1.2.3? 陽(yáng)性重組序列的熒光定量PCR檢測(cè)。

陽(yáng)性物質(zhì)基因組的提取按照植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明進(jìn)行操作，將合成好的陽(yáng)性重組序列梯度稀釋，選擇濃度為10-9μmol/L作為模板與陽(yáng)性物質(zhì)基因組一同檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系及程序按照SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》中要求進(jìn)行配置。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)引物探針結(jié)合序列的特點(diǎn)

13個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中CaMV35S 啟動(dòng)子基因檢測(cè)的上下游引物及探針序列信息如表2，由表2可見13個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中共有3個(gè)檢測(cè)片段的選擇，分別將農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012等9個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中位于參考序列7 249～7 322 bp的檢測(cè)片段記為CaMV1，SN/T 1198—2013中位于參考序列7 191～7 385 bp 的檢測(cè)片段為CaMV2，GB/T 19495.4—2018等3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中位于參考序列7 241～7 322 bp的檢測(cè)片段標(biāo)記為CaMV3。

經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)3條檢測(cè)片段有如下特征：①3條檢測(cè)片段上游引物與探針序列均在同鏈，下游引物在互補(bǔ)鏈;②3個(gè)檢測(cè)片段區(qū)域范圍有重合，CaMV1、CaMV3全長(zhǎng)位于CaMV2上游引物與探針序列之間;③CaMV1上游較CaMV3短8 bp，且兩者下游引物區(qū)相同;④CaMV1上游引物與探針序列間直接相連，無(wú)間隔序列;⑤CaMV2上游引物與探針序列間插入片段較長(zhǎng)，達(dá)到138 bp;⑥CaMV2 探針序列3端與其下游引物3端有7個(gè)bp的堿基互補(bǔ)狀況，即探針結(jié)合區(qū)與下游引物結(jié)合區(qū)的互補(bǔ)鏈有部分重合。序列特征情況參見圖1。

由以上特征可以發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增片段中熒光探針的位置選擇條件較為寬泛，與同側(cè)引物間最近可直接相連不插入間隔序列，與異側(cè)引物影響更小甚至可以有部分重疊而不影響擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)片段上引物與探針序列間隔序列對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。因此在設(shè)計(jì)陽(yáng)性重組序列時(shí)，設(shè)立了將SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法》上游拼接下游重疊序列的重組片段和上下游引物與探針序列間分別間隔0、1、3、5 bp的共5組陽(yáng)性重組序列，與陽(yáng)性物質(zhì)進(jìn)行比較插入堿基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2.2? 重組序列CaMV 35S啟動(dòng)子實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，C、C0、C1、C3、C5不同插入片段的5條重組陽(yáng)性與陽(yáng)性物質(zhì)中CaMV 35S啟動(dòng)子基因均能有效地?cái)U(kuò)增，無(wú)明顯差異，擴(kuò)增曲線見圖2。

3? 討論

3.1? 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)方法可能存在的問題

比對(duì)過程中發(fā)現(xiàn)SN/T 2135—2008《蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法 普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法》CaMV 35S啟動(dòng)子基因?qū)崟r(shí)熒光檢測(cè)方法上游引物3端與熒光探針5端有一個(gè)重疊的堿基T，由于上游引物與探針均結(jié)合同側(cè)鏈，重疊堿基兩者結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，降低擴(kuò)增效率，但推測(cè)由于僅重疊一個(gè)堿基，對(duì)結(jié)果影響尚小。

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.甜菜中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法：SN/T 3959—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.飼料中轉(zhuǎn)基因植物成分PCR檢測(cè)方法：SN/T 1201—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[11]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法：SN/T 1196—2018[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[12]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)調(diào)控元件CaMV35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV35S終止子定性PCR方法：農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3—2012[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[13]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法 普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法：SN/T 2135—2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[14]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法：GB/T 19495.4—2018[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[15]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法：SN/T 1204—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[16]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 馬鈴薯檢測(cè)方法：SN/T 1198—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[17]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.油菜中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法：SN/T 1197—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[18]GIULIETTI A，OVERBERGH L，VALCKX D，et al.An Overview of real-time quantitative PCR： Applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods，2001，25（4）：386-401.