HPLC測定蓮不同部位紫云英苷及異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量

裴香萍 李慧峰 杜晨暉 劉海霞 張淑蓉

摘要：目的??建立蓮不同部位中紫云英苷及異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量的HPLC測定方法。方法??采用Diamonsil C₁₈色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.5%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長347 nm，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結(jié)果 ?在上述色譜條件下，紫云英苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷與相鄰色譜峰的分離度良好。紫云英苷在0.100 5～2.01 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r=0.999 6），平均加樣回收率為100.96%（RSD=2.68%）;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在0.026～0.52 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r=0.999 4），平均加樣回收率為98.91%（RSD=2.34%）。結(jié)論 ?本研究建立的方法操作簡便，結(jié)果可靠，可為蓮相關(guān)藥材的質(zhì)量控制及資源開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蓮;紫云英苷;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷;高效液相色譜法;含量測定

中圖分類號：R284.1 ???文獻標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0075-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.016 ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Content Determination of Astragalin and Isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo Nucifera?Gaertn. by HPLC

PEI Xiangping¹， LI Huifeng¹， DU Chenhui¹， LIU Haixia²， ZHANG Shurong¹

1.?Shanxi University of Chinese Medicine， Jinzhong 030600， China; 2. Shanxi Zhendong Ante Biological Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jinzhong 030600， China

????Abstract：?Objective?To establish an HPLC method for content determination of astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo nucifera?Gaertn. Methods?The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C₁₈?column （200 mm × 4.6 mm， 5 μm）; the column temperature was maintained at 30 ℃; the mobile phase was acetonitrile-0.5% formic acid solution as gradient elution; the flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was at 347 nm; the injection volume was 10 μL. Results?Under above chromatographic conditions， astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside with adjacent other peaks were among the good separation. Astragalin had a good linear relationship in the range of 0.1005–2.01 μg?（r=0.999?6）; the average recovery was 100.96% （RSD=2.68%）. Isorhamnetin-3-O-glucoside had a good linear relationship in the range of?0.026–0.52 μg （r=0.999 3）; the average recovery?was 98.57% （RSD=2.34%）. Conclusion?The method is convenient and reliable， which can provide evidence for the quality control and resource development of Nelumbo nucifera?Gaertn. as a related medicine.

????Keywords：?Nelumbo nucifera?Gaertn.; astragalin; isorhamnetin-3-O-glucoside; HPLC; content determination

蓮Nelumbo nucifera?Gaertn.為睡蓮科多年生宿根草本植物，兼具食用和藥用價值，主要含有生物堿類、黃酮類、花青素、揮發(fā)油類、有機酸、甾醇、揮發(fā)油及微量元素等^[1]，具有降脂、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗驚厥、保肝等藥理作用^[2-4]。我國蓮的種植基地主要分布于江西、福建、湖南、湖北、浙江、河北等地，

基金項目：山西省中藥材、中藥飲片地方標(biāo)準(zhǔn)研究（2011007A）;山西中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新團隊（2018TD009）

其中蓮子、蓮藕以食用為主，荷葉、蓮花、蓮梗、蓮房、蓮子心以藥用為主。目前蓮房、蓮須、蓮子、蓮子心、荷葉收載于2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）^[5]，對荷葉中荷葉堿、蓮子心中的蓮心堿成分進行了定量控制，而對蓮花、蓮梗、蓮房的含量測定研究報道相對較少。為控制相關(guān)藥材質(zhì)量，本研究對蓮不同部位（蓮花、蓮梗、蓮房、荷葉）中的紫云英苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷進行含量測定，為其藥食價值利用及資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 ?儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀，Empower工作站，Waters 2998檢測器（美國Waters公司）;ZF-90型暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）;XS205DU電子分析天平（梅特勒?托利多儀器有限公司）。

蓮花共13批，7批為開放的花（購于藥材市場），6批為花蕾（自采）;荷葉6批，蓮房6批，蓮梗6批。經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)杜晨暉副教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciera?Gaertn.。樣品來源信息見表1。紫云英苷對照品（批號MUST-12092001，純度>98.0%），成都曼斯特生物有限公司;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷對照品（批號140917，純度>98.0%），中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?色譜條件

色譜柱為Diamonsil C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相A為乙腈、B為0.5%甲酸溶液，梯度洗脫（見表2），柱溫30℃，流速0.8 mL/min，檢測波長347 nm，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 ?對照品溶液制備

取異鼠李素-3-O-葡萄糖苷2.6 mg，置于5 mL容量瓶中，加乙醇制成每1 mL含0.52 mg的溶液;取紫云英苷對照品適量，加乙醇制成每1 mL含2.01 mg的溶液，備用。

另取異鼠李素-3-O-葡萄糖苷對照品溶液1 mL、紫云英苷對照品溶液1 mL，稀釋至10 mL容量瓶中，得混合對照品溶液（每1 mL含紫云英苷0.201 mg、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.052 mg）。

2.3 ?供試品溶液制備

取樣品，粉碎成粉末（過3號篩），精密稱取蓮花樣品0.5 g，蓮房、荷葉樣品各3 g，置燒瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 ?線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、2.0 mL于2 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 ?L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積積分值。以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。紫云英苷：Y=2 617 223.380 0X+87 318.167 1，r=0.999 6，線性范圍為0.100 5～2.01 ?g;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷：Y=3 795 683.72X+47 996.58，r=0.999 4，線性范圍為0.026～0.52 ?g。

2.5 ?精密度試驗

精密吸取對照品溶液（紫云英苷0.080 4 mg/mL、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.020 8 mg/mL）10 ?L，連續(xù)進樣6次，測定峰面積積分值，計算得RSD分別為1.13%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.6 ?穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液10 ?L，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、8、10、12 h進樣，記錄色譜峰峰面積積分值，計算得紫云英苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷峰面積RSD分別為1.24%、1.73%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 ?重復(fù)性試驗

取同一批蓮花樣品（批號160816），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，精密吸取10 ?L，分別測定峰面積積分值，并計算含量。結(jié)果樣品中紫云英苷元平均含量為0.349%，RSD=2.52%;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均含量為0.064%，RSD=2.34%。表明本法重復(fù)性良好。

2.8 ?加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的蓮花供試品（批號160816）0.25 g，研細(xì)，精密稱取6份，分別精密加入1 mL混合對照品溶液（紫云英苷0.87 mg/mL，含異鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.16 mg/mL），按“2.3”項下方法制備，進樣10 μL測定，計算回收率。結(jié)果紫云英苷平均回收率為100.96%，RSD=2.68%;異鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均回收率為98.91%，RSD=2.34%。見表3、表4。

2.9 ?樣品含量測定

取樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣測定，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表5。

3 ?討論

本試驗蓮花樣品同時收集了花蕾和開放的花。測定結(jié)果表明，于藥材市場購買的蓮花中紫云英苷及異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量較高，其多為已開放的花，主要為花瓣;而自采樣品均為未開放的花蕾，其紫云英苷及異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量相對較低，可能由于花蕾中蓮房、雄蕊、雌蕊占有一定比例。測定結(jié)果也表明，蓮房、蓮梗樣品中2種成分含量最低?？梢姡显朴④铡愂罄钏?3-O-葡萄糖苷等黃酮類成分主要集中于蓮花的花瓣中。這與文獻報道黃酮類化合物主要存在于荷葉及蓮花中^[6-7]一致。因此，臨床用藥及資源開發(fā)中應(yīng)注意對蓮的不同部位區(qū)別應(yīng)用。

蓮花在文獻記載中多以花蕾入藥，《山西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（一九八七年版）》^[8]、《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009年版）》^[9]、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2002年版）》^[10]均以花蕾入藥，《北京市中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)（二OO年版）》^[11]以花蕾或?qū)㈤_放的花入藥，《福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2006年版）》^[12]以花蕾或花入藥。但安徽亳州藥材市場、河北安國藥材市場調(diào)研及所購買的蓮花主要為花瓣，幾乎不含有蓮房部位;樣品采集過程中，種植戶反映夏季采集未開放的花蕾會影響秋冬季節(jié)蓮藕的產(chǎn)量。因此，對于藥食兩用植物蓮的開發(fā)應(yīng)全方位綜合考慮，既要關(guān)注某些部位的藥用價值，也應(yīng)注重更廣泛的食用價值。另外，對于蓮的不同部位，適宜的采收時間是保證其質(zhì)量的主要因素，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)予以明確規(guī)定。

本試驗考察了不同的提取溶劑，分別以甲醇、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，用70%乙醇提取后，紫云英苷及異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量較高，故以70%乙醇作為提取溶劑。試驗還考察了室溫冷浸24 h、超聲提取30 min、超聲提取60 min、回流提取1 h等不同提取方法，結(jié)果表明，回流提取1 h的樣品中紫云英苷含量較高，故提取方法選擇回流提取1 h。

本試驗參考相關(guān)文獻報道^[13]，比較了乙腈-0.2%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例作為流動相，后經(jīng)多次試驗摸索，確定了乙腈-0.5%甲酸水溶液的梯度分離條件，使各色譜峰達到基線分離，與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，紫云英苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷理論塔板數(shù)均大于3000，對稱因子均在0.95～1.05之間。

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（收稿日期：2019-02-15）

（修回日期：2019-03-06;編輯：陳靜）