小兒開胃增食合劑對厭食癥幼齡大鼠胃竇組織生長素、血管活性腸肽及其受體表達(dá)的影響

李玉霞 史正剛 祁輝

摘要：目的 ?觀察小兒開胃增食合劑對厭食癥幼齡大鼠胃竇組織生長素（Ghrelin）、血管活性腸肽（VIP）及其受體表達(dá)的影響，探討其治療小兒厭食癥的相關(guān)機(jī)制。方法??將60只幼齡SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組和小兒開胃增食合劑低、高劑量組，每組12只，采用病因模擬法建立厭食大鼠模型。各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，6周后采用熒光定量PCR及Western blot分別檢測大鼠胃竇組織Ghrelin、VIP及其受體mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果??與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組、小兒開胃增食合劑高劑量組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論??小兒開胃增食合劑通過影響模型大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2表達(dá)，進(jìn)而改善胃的容受性舒張和緊張性收縮，調(diào)整胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)功能，發(fā)揮治療小兒厭食癥的作用。

關(guān)鍵詞：小兒開胃增食合劑;厭食癥;生長素;血管活性腸肽;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0050-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.012 ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Xiaoer Kaiwei Zengshi?Mixture on Expressions of Ghrelin， VIP and Its Receptors in Gastric Antrum Tissues of Juvenile Rats with Anorexia

LI Yuxia^1，2， SHI Zhenggang¹， QI Hui¹

1. TCM Clinical College in Gansu?University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China;2. Affiliated?Hospital of Gansu?University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China

Abstract： Objective?To observe the effects of Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture?on the expressions of Ghrelin， VIP and its receptors in gastric antrum tissues of juvenile rats with anorexia; To explore the relevant mechanism for treating anorexia in children.?Methods?Totally sixty juvenile SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive control group， Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture low-， and high-dosage groups， with 12 rats in each group. Juvenile rat model with anorexia was established by imitating the major cause of infantile anorexia.?Each administration group was given relevant medicine for intervention. After 6 weeks， the mRNA and protein?expressions of Ghrelin， VIP and its receptors in rat gastric antrum tissue were detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot. Results?Compared with the blank group，?the mRNA?and protein expressions of Ghrelin and its receptors GHSR， VIP and VPAC2?in the model group were significantly down-regulated （P<0.05）; Compared with the model group， the mRNA and protein?expressions of Ghrelin and GHSR， VIP and VPAC2 in the positive control group and?Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture?high-dosage groups were significantly up-regulated （P<0.05）.?Conclusion?Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture?can improve the gastric receptive relaxation and tension contraction，?regulate the gastric mechanical function by affecting the expressions of Ghrelin and its receptors GHSR， VIP and VPAC2?in gastric antrum tissues，?so as to?play a role in the treatment of anorexia in children.

Keywords： Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture; anorexia;?Ghrelin; VIP; rats

小兒厭食癥是指小兒長期見食不貪、食欲不振、甚至拒食的一種慢性食欲障礙性疾病。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，嬰兒和學(xué)齡前兒童厭惡進(jìn)食發(fā)生率為12%～34%^?[1]。近年來，隨著物質(zhì)生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢，長期厭食可導(dǎo)致營養(yǎng)不良、免疫力下降、反復(fù)呼吸道感染，嚴(yán)重影響小兒生長發(fā)育、智力及身心健康。厭食癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙和胃腸肽分泌異常是最為重要的影響因素。在眾多胃腸肽中，雙重分布于腦組織和胃腸道的生長素（Ghrelin）和血管活性腸肽（VIP）與胃的容受性舒張與緊張性收縮直接相關(guān)，在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能方面發(fā)揮著非常重要的作用。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用心理治療、補(bǔ)鋅和促進(jìn)胃腸動(dòng)力藥等對癥治療，但促進(jìn)胃腸動(dòng)力藥明顯的不良反應(yīng)及療效不確定性限制了其臨床應(yīng)用，而中醫(yī)藥治療本病方法眾多，具有明顯優(yōu)勢。小兒開胃增食合劑是全國名中醫(yī)張士卿教授通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，將厭食癥根本病機(jī)——“脾運(yùn)失健、胃納失?！迸c“脾健不在補(bǔ)貴在運(yùn)”的指導(dǎo)思想相結(jié)合，融合現(xiàn)代制劑工藝研制而成。課題組前期研究表明，小兒開胃增食合劑在改善胃腸運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)消化酶分泌、調(diào)整胃腸激素分泌、影響食欲調(diào)節(jié)因子等方面均有顯著的效應(yīng)^[2-6]。本研究觀察小兒開胃增食合劑對厭食癥幼齡大鼠胃竇組織Ghrelin、VIP及其受體表達(dá)的影響，探討其治療小兒厭食癥的相關(guān)機(jī)制。

1 ?材料與方法

1.1 ?動(dòng)物

1周齡健康SD大鼠60只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量（80±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SYXK（甘）2015-0005。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～26 ℃、日溫差≤4 ℃、相對濕度40%～70%，最小換氣量15～20次/h，日光燈采光，12 h/12 h明暗交替。普通飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）經(jīng)高溫高壓滅菌，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

小兒開胃增食合劑（蒼術(shù)、茯苓、檳榔、雞內(nèi)金、烏梅、胡黃連、炙甘草），甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，240 mL/瓶，批號170210;江中健胃消食片，江中藥業(yè)股份有限公司，批號17031001。

1.3 ?主要試劑與儀器

目標(biāo)引物（Takara合成，LZD18070），Trizol（Invitrogen公司15596-018），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR037A），擴(kuò)增試劑盒（Takara Code No.D310），組織裂解液（RIPA，索萊寶科技公司，20180419），PMSF（索萊寶科技公司，P0100），BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶科技公司，PC0020），SDS-Page凝膠試劑盒（索萊寶科技公司，20180223），GAPDH（YM3445）、Ghrelin（ab57222）、生長激素釋放激素受體（GHSR，ab95250）、VIP（ab8556）、VPAC2（ab28624）和辣根過氧化酶兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，133599），ECL發(fā)光液（索萊寶科技公司，PE0020）。倒置顯微鏡（CKX41，日本Olympus），電泳儀（北京六一儀器廠，DYCZ-40D），蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（北京六一儀器廠，DYCZ-40D），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（BioSpectrum510，美國UVP），CFX real-time PCR system（Bio-Rad，CA 1854095）。

1.4 ?造模、分組和給藥

將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組12只、造模組48只。空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組采用病因模擬法制備厭食大鼠模型^[7]，即用特制飼料（魚松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2比例混勻，捏成餅狀，晾干，4 ℃冷藏備用）喂養(yǎng)，共飼養(yǎng)28 d，每日記錄大鼠攝食量及體質(zhì)量。以造模組大鼠攝食量較空白組平均降低30%～60%，或體質(zhì)量低于空白組10%～15%，為模型成功評定標(biāo)準(zhǔn)^[7]。待造模成功后，再隨機(jī)將造模組分為模型組、陽性對照組、小兒開胃增食合劑低劑量組（中藥低劑量組）、小兒開胃增食合劑高劑量組（中藥高劑量組），每組12只。同時(shí)開始灌胃給藥，灌胃劑量按人與大鼠換算系數(shù)^[8]折算成大鼠等效劑量。中藥高、低劑量組分別給予小兒開胃增食合劑（0.3 g原藥材/mL）1.4、5.7g/（kg·d）灌胃，陽性對照組給予健胃消食片水溶液0.45 g/（kg·d）灌胃，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)42 d。

1.5 ?標(biāo)本采集

于末次給藥后禁食不禁水，次日采集標(biāo)本，大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，脫臼處死，取胃竇部組織置于液氮中，-80 ℃冰箱保存，分別留待熒光定量PCR和Western blot檢測。

1.6 ?熒光定量PCR檢測大鼠胃竇組織生長素、血管活性腸肽及其受體mRNA表達(dá)

取大鼠胃竇組織0.1 g，采用Trizol法提取總RNA，每份樣品取2 ?L，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA，分別加入Ghrelin、GHSR、VIP，VAPC2和GAPDH的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 ?L。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s和60 ℃變性30 s，40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)見表1。

1.7 ?Western blot檢測大鼠胃竇組織生長素、血管活性腸肽及其受體蛋白表達(dá)

取大鼠胃竇組織，加1 mL蛋白裂解液RIPA，提取總蛋白。收集含有裂解液細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，每孔加40 ?g目的蛋白;加入電泳液，并進(jìn)行組織蛋白電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，根據(jù)目的蛋白選擇相應(yīng)的條帶，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后，加入稀釋后的一抗4 ℃孵育，過夜;再加二抗室溫孵育2 h，曝光，所得圖片采用ImagePro Plus 6.0軟件進(jìn)行掃描，利用GAPDH校準(zhǔn)后計(jì)算其灰度值。

1.8 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊用Games-Howell檢驗(yàn)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?模型評定標(biāo)準(zhǔn)

2.1.1 ?大鼠攝食量變化

造模第1日，與空白組比較，造模組大鼠攝食量無明顯差異（P>0.05）;第7日，造模組較空白組攝食量平均降低37.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;至第28日，造模組大鼠較空白組攝食量平均降低40.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。符合厭食癥模型攝食量評定標(biāo)準(zhǔn)^[7]，提示模型制作成功。

2.1.2 ?大鼠體質(zhì)量變化

造模第1日，與空白組比較，造模組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P>0.05）;第7日，造模組大鼠較空白組體質(zhì)量平均降低19.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;至第28日，造模組大鼠較空白組體質(zhì)量平均降低30.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。符合厭食癥模型體質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)^[7]，提示模型制作成功。

2.2 ?小兒開胃增食合劑對模型大鼠攝食量及體質(zhì)量的影響

干預(yù)第7～42日，與空白組比較，模型組大鼠攝食量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，中藥低劑量組攝食量變化趨勢與其相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;第21日，與模型組比較，陽性對照組和中藥高劑量組大鼠攝食量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。干預(yù)第7～42日，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，中藥低劑量組大鼠體質(zhì)量變化趨勢始終未見明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而陽性對照組和中藥高劑量組大鼠體質(zhì)量則表現(xiàn)出逐漸增加趨勢，且從第28日起，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

2.3 ?小兒開胃增食合劑對模型大鼠胃竇組織生長素、血管活性腸肽及其受體mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組、中藥低劑量組和中藥高劑量組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與陽性對照組比較，中藥高劑量組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），VIP及其受體VPAC2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表6。

2.4 ?小兒開胃增食合劑對模型大鼠胃竇組織生長素、血管活性腸肽及其受體蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組、中藥高劑量組大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05），中藥低劑量組大鼠胃竇組織Ghrelin受體GHSR蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）;與陽性對照組比較，中藥高劑量組大鼠胃竇組織GHSR、VIP及其受體VPAC2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表7、圖1。

3 ?討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，小兒厭食癥病因多與先天不足、喂養(yǎng)不當(dāng)、久病等因素有關(guān)^[9]。但無論何種因素所致，其根本病機(jī)為脾運(yùn)失健、胃納失常。張士卿教授認(rèn)為，本病病位在中焦，不僅責(zé)之脾胃虛弱，脾運(yùn)失健，同時(shí)還存在胃有食積，中焦氣滯，濕困熱郁，兼或蟲證內(nèi)擾等，以致胃失和降的病理變化。治當(dāng)以調(diào)理脾胃，啟復(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)之機(jī)為基本原則，脾以運(yùn)為健，胃以和為貴，調(diào)理脾胃應(yīng)遵《幼科發(fā)揮》“重在助運(yùn)，貴在中和”之旨，予以運(yùn)脾開胃，消食化積之法。小兒開胃增食合劑方中蒼術(shù)味微苦，芳香悅胃，功能醒脾助運(yùn)，開郁寬中，疏化水濕，通陽泄?jié)?，與脾喜燥惡濕、得陽則運(yùn)的習(xí)性相符，可疏脾濕之蘊(yùn)，散脾經(jīng)之寒，舒脾經(jīng)之滯，能就脾之所喜而去脾之所惡，使脾氣舒展，運(yùn)化之機(jī)恢復(fù)而達(dá)健旺;茯苓性平，作用和緩，可健脾補(bǔ)中，與蒼術(shù)相配燥濕而不傷脾，補(bǔ)脾而不斂濕，又補(bǔ)中有運(yùn)，補(bǔ)運(yùn)結(jié)合，共為君藥。檳榔味辛，入胃腸，功擅行胃腸之氣，消積導(dǎo)滯;雞內(nèi)金性平，有較強(qiáng)消食化積作用，并能健運(yùn)脾胃。兩藥合用可行氣和胃，運(yùn)脾化積，是謂臣藥。脾虛致水濕內(nèi)生，加之小兒體稟“純陽”，且飲食停積胃腸而化熱，因此濕熱內(nèi)生，阻于胃腸，鑒于此，故選用胡黃連。胡黃連味苦寒，入胃腸，善清胃腸濕熱;烏梅酸收，可益氣開胃，與胡黃連配伍可助其除疳清熱之功，與檳榔相合可助其安蛔，合甘草又可化陰，故能生津而護(hù)胃;炙甘草益氣補(bǔ)中，調(diào)和諸藥，三藥共為佐使。諸藥合用，可謂消補(bǔ)并舉，動(dòng)靜相和，標(biāo)本同治，補(bǔ)而不滯，消導(dǎo)而不傷正，共奏運(yùn)脾開胃、消食化積、行氣補(bǔ)中之功，正合小兒厭食癥之病機(jī)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，小兒厭食癥以胃進(jìn)食功能失常最為關(guān)鍵，主要表現(xiàn)為胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)失常。這與中醫(yī)學(xué)所認(rèn)識(shí)的“胃納失常”病機(jī)相一致。胃的3種運(yùn)動(dòng)形式（容受性舒張、緊張性收縮及蠕動(dòng)）共同參與完成胃容納食物、混合食糜以及胃排空功能，從而保證正常的進(jìn)食與消化^[10]。而調(diào)控和維持胃腸道正常運(yùn)動(dòng)興奮和抑制的平衡，主要由中樞和胃腸神經(jīng)系統(tǒng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，作用于相應(yīng)的受體所完成，因而其對胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)極為關(guān)鍵^[11-13]。而胃腸運(yùn)動(dòng)功能的異常又會(huì)反饋性對大腦中樞神經(jīng)的調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響，從而調(diào)控相關(guān)胃腸肽的表達(dá)，因此，胃動(dòng)力改變后，胃排空時(shí)間與胃腸肽激素水平異常存在因果關(guān)系^[14]。

Ghrelin是由胃竇泌酸細(xì)胞分泌的內(nèi)源性胃腸肽， GHSR mRNA在全消化道平滑肌和下丘腦中均有表達(dá)^[15]。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin與GHSR結(jié)合后，可調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)和能量代謝平衡^[16]。對胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，大鼠體內(nèi)Ghrelin水平與胃竇部Ⅲ相收縮運(yùn)動(dòng)存在高度一致性^[17-18]，并可顯著加快大鼠胃排空，減少胃內(nèi)食物殘留量。當(dāng)體內(nèi)碳水化合物含量過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Ghrelin的mRNA表達(dá)下調(diào)^[19]，引起胃腸運(yùn)動(dòng)障礙。

VIP是一種能顯著且持續(xù)松弛胃腸道平滑肌的多肽類激素。VIP在胃腸道的分布最為廣泛，通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮生理功能。在胃腸道平滑肌中，VIP與其受體VPAC2相互作用，刺激cAMP濃度增加以松弛平滑肌，這一作用通過迷走-迷走反射而引起胃的容受性舒張^[8]。研究發(fā)現(xiàn)，飲食積滯因素能通過影響VIP表達(dá)進(jìn)而造成胃腸道生理功能紊亂，且通過調(diào)節(jié)體內(nèi)VIP水平可改善胃腸道蠕動(dòng)^[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)攝食量下降，體質(zhì)量不增等厭食癥狀的同時(shí)，胃竇組織中胃腸肽Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2既表現(xiàn)出基因表達(dá)顯著下調(diào)，也出現(xiàn)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。經(jīng)藥物干預(yù)后，陽性對照組和中藥高劑量組攝食量表現(xiàn)出逐漸增加趨勢，并在給藥第21日，與模型組比較有顯著差異;給藥第28日，與模型組比較，在體質(zhì)量方面，陽性對照組和中藥高劑量組表現(xiàn)出顯著差異，與胃竇組織Ghrelin、VIP水平及GHSR、VPAC2 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)的變化趨勢相一致，表明小兒厭食癥的發(fā)生與Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2表達(dá)變化密切相關(guān)，而小兒開胃增食合劑可通過上調(diào)其基因和蛋白表達(dá)水平，起到增加攝食量、促進(jìn)胃排空而治療小兒厭食癥。因此，小兒開胃增食合劑可通過影響胃腸肽Ghrelin及其受體GHSR、VIP及其受體VPAC2表達(dá)，進(jìn)而改善胃的容受性舒張和緊張性收縮，調(diào)整胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)功能，使其恢復(fù)平衡狀態(tài)，起到治療小兒厭食癥的作用。

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（收稿日期：2019-04-01）

（修回日期：2019-05-21;編輯：華強(qiáng)）