外泌體microRNA在動脈粥樣硬化性腦梗死中的研究進展

吳玉芬 王金宇 王少洲

[摘要] 外泌體是分泌到細胞外的一種小囊泡，是近年來醫(yī)學(xué)研究中的一大熱點，其構(gòu)成為脂質(zhì)雙分子層，含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及RNA等物質(zhì)，可結(jié)合某些靶細胞受體，作為細胞間通信的橋梁，是一種重要的細胞與細胞之間交流的方式，參與神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的組成，其在腦梗死的診治上具有極大的潛能。本文在其作為生物學(xué)標志物及其microRNA功能等方面，對外泌體在動脈粥樣硬化性腦梗死的研究進展作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 外泌體;動脈粥樣硬化;腦梗死;腦卒中

[中圖分類號] R543.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）31-0164-05

Research advances of exosome microRNA in atherosclerotic cerebral infarction

WU Yufen ? WANG Jinyu ? WANG Shaozhou ? LU Changjun

Department of Encephalopathy， Liuzhou Hospital of TCM in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou ? 545001， China

[Abstract] Exosomes are small vesicles secreted outside the cell， which is a hot spot in medical research in recent years. It is composed of a lipid bilayer， containing lipids， proteins and RNA， and can bind to certain target cell receptors as a bridge communicating between cells. It is an important means of communication between cells， involved in the composition of the neuron-glial network. It has a great potential in the diagnosis and treatment of cerebral infarction. In this paper， in terms of the exosome as a biological marker and its microRNA function， the research progress of exosomes in atherosclerotic cerebral infarction is reviewed.

[Key words] Exosomes; Atherosclerosis; Cerebral infarction; Stroke

腦卒中是一種發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、發(fā)病機制復(fù)雜、對公眾危害性較大的腦血管疾病。全球每年約有1500萬人發(fā)生腦卒中，約1/3患者出現(xiàn)死亡，是目前疾病死因中的第二大病因，同時也是導(dǎo)致患者長期致殘的主要原因，其中腦梗死約占腦卒中總數(shù)的80%[1]。動脈粥樣硬化作為腦梗死的常見病因，控制動脈粥樣硬化可有效減少腦梗死的發(fā)生，盡管腦梗死診治方面已進行了較多的臨床及基礎(chǔ)研究，但目前仍缺乏安全、高效的治療方法。因此，尋找一種動脈粥樣硬化性腦卒中可靠、高療效的治療方法，是目前神經(jīng)科領(lǐng)域的重要任務(wù)。諸多報道顯示，外泌體不僅有望成為動脈粥樣硬化性腦梗死診斷的生物標志物，同時其具備較好的治療潛能。

1 外泌體概述

1.1外泌體概念

外泌體是一種活性囊泡，在多囊泡外膜與細胞質(zhì)膜融合后分泌并釋放到細胞外。1983年首次在綿羊網(wǎng)狀紅細胞中發(fā)現(xiàn)。細胞是通過“內(nèi)陷-融合-外放”的生物學(xué)機制產(chǎn)生并主動向胞外分泌的盤狀囊泡樣小體，其組成為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)[2]，近年來研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有特異性蛋白和脂質(zhì)、核酸。外泌體可進行細胞間物質(zhì)傳遞、信息交流，這種生物學(xué)功能在修復(fù)細胞受損、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、神經(jīng)血管新生、抗原呈遞以及核酸、蛋白質(zhì)等生物遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面均具有重要作用。

1.2 外泌體來源

研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)很多細胞如淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、腫瘤細胞、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等均可分泌外泌體，而其分泌的外泌體在體液中大部分可以被檢測到[3]。有研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞分泌的外泌體可以促進T細胞的增殖分化，可能抑制腫瘤細胞的生長，同時還具有穿透血腦屏障的能力[4]、再生神經(jīng)血管、調(diào)節(jié)免疫炎癥的作用。上述對外泌體功能的重新認識，顯示其可能在動脈粥樣硬化性腦梗死的診治方面具有極大的潛能，這也使近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究外泌體成為了一大熱點。

1.3 外泌體的形成

外泌體形成需經(jīng)以下階段：細胞質(zhì)膜內(nèi)陷出現(xiàn)內(nèi)涵體并釋放進入細胞質(zhì)，多個內(nèi)涵體融合后形成早期內(nèi)體（early endosome）;再次，內(nèi)陷包裹細胞內(nèi)物質(zhì)后形成管腔內(nèi)小囊泡，此時也稱為晚期內(nèi)體（late endosome），又稱多囊泡小體，這一過程主要是由運輸（ESCT）系統(tǒng)所需的內(nèi)體分揀復(fù)合體完成的。ESCT系統(tǒng)由4個復(fù)合物組成：ESCRT-0、ESCRTⅠ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT -Ⅲ連同其他輔助原件。ESCRT-0與早期內(nèi)涵體外表面的特異性受體相結(jié)合，同時需要ESCRTⅠ、ESCRT-Ⅱ的輔助，通過識別和聚集底物，以內(nèi)出芽的方式將其包裹形成管腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles，ILVs），ESCRT-Ⅲ經(jīng)Alix蛋白識別該小泡并進行處理后釋放到內(nèi)涵體內(nèi)，形成晚期成熟的內(nèi)涵體，稱為多囊泡小體[3]。多囊泡小體的形成還可通過神經(jīng)酰胺類鞘脂信號分子[5]、四次跨膜糖蛋白[6-7]及Rab GTP酶[8]等非依賴 ESCRT的分選機制途徑。當(dāng)多囊泡小體與細胞質(zhì)膜融合時可將其內(nèi)的小囊泡經(jīng)胞吐的方式釋放到細胞外間隙，即形成外泌體。外泌體可以應(yīng)用自分泌、旁分泌或激素樣分泌的方式使其包裹的信號分子與受體細胞發(fā)生作用，調(diào)節(jié)受體細胞的功能，從而實現(xiàn)細胞與細胞之間的信息傳遞。

1.4 外泌體成分

外泌體中還含有許多有重要作用的RNA分子，既包括mRNA也包括非編碼RNA，例如microRNA（miRNA）和長非編碼RNA（lncRNA）。這些遺傳物質(zhì)可通過外泌體與靶細胞特異性的膜融合后作用于靶細胞，充分發(fā)揮其作為遺傳信息進行物質(zhì)交流的功能[9-11]。外泌體通過胞膜凹陷內(nèi)同時進行出芽、包裹及加工胞漿內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)，故外泌體不含細胞器、細胞核[12]。

2 外泌體與動脈粥樣硬化的研究

2.1 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥性疾病[13]，許多研究證據(jù)表明，外泌體在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全程中發(fā)揮著重要作用，其可參與氧化應(yīng)激、細胞凋亡、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[14]。外泌體在體內(nèi)細胞間如何進行信號交換及傳導(dǎo)，機制尚不清楚，需進一步研究[15]。對外泌體的研究，能幫助我們進一步明確動脈粥樣不同階段中細胞通訊的分子機制。動脈粥樣硬化斑塊組織中存在較多免疫細胞，可以分泌炎癥相關(guān)細胞因子，影響病理過程。AS的微環(huán)境是由免疫細胞分泌的外泌體組成，其參與了AS中的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[16]。

2.2 動脈粥樣硬化外泌體中的miRNA

動脈粥樣硬化中外泌體的miRNA發(fā)揮著非常重要的作用。細胞釋放的細胞外囊泡的RNA可增強信號的傳導(dǎo)[17]。

2.2.1 巨噬細胞外泌體miRNA ?有研究表明AS在炎癥因子的作用下，巨噬細胞通過miRNA-223誘導(dǎo)自身分化、炎癥反應(yīng)[18]。巨噬細胞的外泌體中含有大量miRNA-19、miRNA-21、miRNA-133、miRNA-155，可促進炎癥反應(yīng)[19]。巨噬細胞被激活后外泌體中的miRNA-150 水平會增加，可促進人血管內(nèi)皮細胞（HMEC-1）的遷移。研究顯示，miRNA可通過細胞外囊泡的形式，進入人血管內(nèi)皮細胞促進其遷移、凋亡并誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的發(fā)生，從而影響心、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[20]。

2.2.2 樹突狀細胞外泌體miRNA ?有研究提示，樹突狀細胞來源的外泌體可調(diào)節(jié)T 細胞基因的表達及功能的活化[21]。其外泌體MHC Ⅰ/Ⅱ類分子、CD80的高表達及激活與胞吞作用相關(guān)的分子膜聯(lián)蛋白、RabS/Rab7等，可減少低密度脂蛋白的含量、促進膽固醇的反向轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)免疫功能，減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。研究表明某些降脂藥物如阿托伐他汀可通過調(diào)節(jié)ido/treg和fasl/fas路徑[22]改善小鼠免疫功能，如免疫性肌無力等疾病，可作為治療疾病的一種選擇。另外研究發(fā)現(xiàn)，來源于樹突狀細胞的外泌體表達的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）在誘導(dǎo)細胞凋亡中有重要作用。

2.2.3 T細胞外泌體miRNA ?T細胞分泌的外泌體，含T細胞表面受體蛋白，它能夠介導(dǎo)巨噬細胞、淋巴細胞之間的聯(lián)系。激活的CD4+T細胞外泌體能促進單核細胞的脂質(zhì)聚集，其作用方式是通過磷脂絲氨酸受體實現(xiàn)的。活化后的T細胞可以增加FaSL和TRAIL的表達，促進炎癥狀態(tài)下外泌體介導(dǎo)的細胞凋亡[23]，其后通過抗氧化作用減少ROS的產(chǎn)生。T細胞外泌體中含有多種的miRNA，Treg釋放的外泌體含有miRNA，其能轉(zhuǎn)運到Thl細胞，抑制Thl細胞的增殖和IFN-7的釋放[24]。

2.2.4 血小板外泌體miRNA ?血小板分泌的外泌體含有多種調(diào)控功能且富含miRNA，其中血小板活化程度與miRNA-21、miRNA-223、miRNA-339含量水平呈正相關(guān)，血小板經(jīng)活化后分泌的外泌體，可能轉(zhuǎn)入血管平滑肌細胞中，減少PDGFRp表達，抑制其誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的增殖，故這些外泌體miRNA有望成為預(yù)測血栓的生物學(xué)標志物[25]。miR-223可通過 ILGHR作用，從而促進糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的HUVECs凋亡[26]，促進血小板的反應(yīng)性分泌、黏附聚集。miRNA-320能夠減少內(nèi)皮ICAM-1的表達，促進血管內(nèi)皮細胞（VECs）的活力，這可能是防止炎癥和血栓形成的一種方法。抗血小板治療后能降低miRNA-126、miRNA-150、miRNA-191和 miRNA-223表達，減少內(nèi)皮細胞凋亡。

2.2.5 外泌體miRNA與動脈粥樣硬化 ?外泌體的蛋白表達譜與caspase-3激活VECs釋放的凋亡小體蛋白表達譜比較發(fā)現(xiàn)血管損傷后循環(huán)外分泌小泡中蛋白酶體活性增加[27]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞外泌體中明顯升高的miRNA-143/145可抑制靶基因ELK1和CaMMKp的表達，明顯減緩主動脈斑塊形成[28]。在缺氧條件下含有高量表達的 miRNA-126、miRNA-210，可增加實驗性心肌梗死小鼠的存活率，反之，抑制這些miRNA外泌體的保護作用會被阻斷[29]。研究顯示，miRNA-126可減少斑塊區(qū)域的滲透，穩(wěn)定硬化的斑塊，逆轉(zhuǎn)斑塊抑制AS的進展。

外泌體miRNA-214誘導(dǎo)受體細胞遷移和血管生成，而沉默miRNA-214的血管內(nèi)皮細胞外泌體則沒有這種功能[30]。動脈粥樣硬化斑塊鈣化可增加TGF-β1表達，刺激p38的磷酸化和抑制Smad3的活化，此過程可逆轉(zhuǎn)鈣化纖維[31]，血管平滑肌細胞的外泌體miRNA可作為預(yù)防及治療血管鈣化的新靶標志物。體外研究也表明[32]，血管平滑肌細胞來源介導(dǎo)的miRNA-150，可調(diào)節(jié)VEGF-A/VEGFR/PI3K/Akt 通路控制血管內(nèi)皮細胞遷移，維持血管壁的穩(wěn)定性。

3 外泌體與腦梗死的研究

目前很多報道顯示，許多生物學(xué)標志物與氧化損傷、血栓形成、炎癥反應(yīng)有關(guān)，但這些標志物不能在臨床廣泛應(yīng)用，具有一定的局限[33]。對于缺血性腦卒中，如何找到更為可靠的生物學(xué)標志物仍是目前的一大難題。

3.1 外泌體源性miRNA有望成為腦梗死生物學(xué)標志物

外泌體miRNA的潛力很大。有報道指出，外泌體來源的miRNA可成為缺血性腦卒中診治的生物學(xué)標志物，因它在人體體液中分布廣，半衰期較長，且能被外泌體膜結(jié)構(gòu)保護而不被分解，并能在體液、血清中被穩(wěn)定檢測，可明顯增加疾病的早期診斷率[34]。在缺血性腦卒中多個階段中，外泌體miRNA表達水平均有明顯改變，其可能成為與腦梗死診斷、治療、判斷預(yù)后的新的生物學(xué)標志物[35]。

Mirzaei H等[36]研究報道，腦梗死發(fā)生后，血液中外泌體miRNA表達水平有差異性變化，能檢測到的就有60多個。Yang ZB等[37]通過檢測腦梗死和對照組的miRNA水平，揭示缺血性腦卒中患者體內(nèi)miRNA-107、miR-128b、miR-153的表達水平有統(tǒng)計學(xué)差異，在腦梗死早期診斷中，這些具有顯著差異的miRNA有望成為腦梗死新的生物學(xué)標志物。

有研究者對急性腦梗死患者血清中外泌體的miR-124、miR-9水平變化進行研究，與對照組比較，結(jié)果顯示其表達水平明顯升高，且其與臨床神經(jīng)功能缺失評分量表NIHSS評分、血清白細胞介素-6濃度呈線性正相關(guān)[38]。這兩種外泌體可能成為診斷缺血性腦卒中以及評估神經(jīng)損傷程度的生物學(xué)標志物。

劉辰庚等[39]用阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）模型對小鼠腦脊液進行研究，注射AD小鼠分泌的外泌體miR-135a到正常小鼠腦室，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常小鼠腦脊液、血漿內(nèi)miR-135a的表達明顯增加。該研究證明，外泌體能將miR-135a的生物信息傳遞至腦細胞內(nèi)，通過細胞信號間傳導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)作用。

3.2 外泌體源性miRNA促進腦梗死的血管生成

在急性缺血性腦梗死小鼠模型中，腦血管中下調(diào)的miR-15a含量水平，能提高FGF2、VEGF的表達，促進腦梗死后病灶周邊區(qū)域血管的生成[40];研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠腦血管內(nèi)皮細胞分泌的外泌體能將miRNA、mRNA 信息傳輸至鼠腦血管周圍細胞中，增加VEGF-β及其受體VEGFR-1的表達，促進新生血管的生成[41]，提示外泌體能促進內(nèi)皮細胞遷移及增殖、血管生成，能促進腦卒中后神經(jīng)修復(fù)[42]。

3.3 外泌體miRNA參與腦梗死的神經(jīng)再生

腦缺血損傷后，外泌體miR-17-92能夠促進神經(jīng)的重建及神經(jīng)功能的恢復(fù)[43];外泌體miR-219能促進少突膠質(zhì)細胞前體分化成髓鞘細胞，有利于髓鞘形成[44]。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達的miR-124，其水平變化與神經(jīng)元分化呈正相關(guān);腦缺血損傷后，miR-124在缺血損傷組織周邊區(qū)中的表達水平會明顯增加[45-46]，有助于促進神經(jīng)血管再生，改善受損區(qū)的神經(jīng)功能。Yang J等[47]通過外泌體將狂犬病病毒糖蛋白修飾miR-124轉(zhuǎn)運至大腦皮質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，外泌體能增加梗死部位中的神經(jīng)細胞的生長來改善腦功能障礙，這些均表明miR-124在神經(jīng)損傷中對神經(jīng)有保護和修復(fù)作用。外泌體能夠?qū)NA及其他物質(zhì)信息運輸?shù)捷S突，促進患者髓鞘及軸突再生，有利于神經(jīng)修復(fù)[48]。間充質(zhì)干細胞通過應(yīng)用外泌體將miR-133b轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，增快神經(jīng)軸突生長速度[49]?？傊?，大量研究顯示外泌體中的miRNA有多種均參與了缺血性腦卒中的神經(jīng)修復(fù)重建過程。

4 展望

動脈粥樣硬化患者的血液中存在多種miRNA水平的差異表達，其從多種途徑參與AS形成的病理過程。雖然關(guān)于外泌體與腦血管疾病之間關(guān)系的研究日益增多，但外泌體水平與腦血管疾病發(fā)生之間的確切關(guān)系仍需進一步研究。差異表達的外泌體miRNA水平可幫助我們診斷疾病、評估疾病預(yù)后，這可能成為動脈粥樣硬化診斷和治療的新靶點，其可能作為有意義的生物學(xué)標志物預(yù)測個體化腦血管事件的發(fā)生。

外泌體作為參與細胞間通訊的一種機制，參與了細胞間蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)的交換，參與動脈粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，說明外泌體有望成為在臨床診療的新靶點。其作為介導(dǎo)腦梗死后大腦功能重建的重要細胞參與者，因具有穿過血腦屏障的獨有優(yōu)勢，故在生物學(xué)標志物、神經(jīng)血管重塑、促進血管重塑等方面可能具有極大的作用。但外泌體的研究目前仍然有很多未知問題，靶向調(diào)控機制也不夠準確，進一步研究是必要的。外泌體miRNA較多，其在機體內(nèi)的作用也是多樣的，仍然面臨著很多問題，例如外泌體中生物活性分子較多，但其相關(guān)作用機制尚未得到完全闡明，故外泌體的臨床治療是一把雙刃劍，怎樣才能做到靶向定位、精準調(diào)控，是亟待解決的問題之一，故仍無法將其切實地用于臨床疾病的診療中;另外，外泌體RNA的研究目前集中在miRNA，其他特異性RNA發(fā)現(xiàn)較少;如何提取制備高濃度的外泌體很重要。故外泌體在腦梗死，尤其在動脈粥樣硬化性腦梗死患者的診治和評估預(yù)后方面，仍需要大量的深入研究。

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（收稿日期：2019-05-21）