昆仙膠囊對(duì)IgA腎病大鼠的腎保護(hù)作用及系膜細(xì)胞增殖的影響

曾佳麗 姜雪 余瑾

[摘要] 目的 本實(shí)驗(yàn)通過建立IgA腎病大鼠模型及大鼠腎小球系膜細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行藥物干預(yù)，探討昆仙膠囊的腎保護(hù)作用和對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響。 方法 48只雌性SD大鼠隨機(jī)均分為正常組、IgAN模型組、纈沙坦組、昆仙膠囊組，每組12只，造模第5周開始灌胃給藥，分別于第10周、16周每組每次隨機(jī)挑選6只大鼠，檢測(cè)24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮，觀察大鼠腎臟IgA免疫熒光和病理學(xué)改變。同時(shí)，選擇IgA1刺激大鼠系膜細(xì)胞，將系膜細(xì)胞分為正常組、模型組、纈沙坦高低劑量組和昆仙膠囊高中低劑量組，CCK8檢測(cè)藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖及抑制情況。 結(jié)果 第10周、16周昆仙膠囊組IgAN大鼠24 h尿蛋白定量、腎功能指標(biāo)較模型組有顯著性差異（P<0.05），與纈沙坦組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。同時(shí)腎組織病理均提示昆仙膠囊組病變程度較模型組輕。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)IgA1刺激后可引起系膜細(xì)胞增殖，藥物干預(yù)后昆仙膠囊能夠明顯抑制IgA1誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞增殖。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)說明昆仙膠囊能減少IgAN大鼠尿蛋白，延緩腎功能進(jìn)展，減緩腎組織病理改變，其機(jī)制可能是通過抑制系膜細(xì)胞增殖而達(dá)到的。

[關(guān)鍵詞] 昆仙膠囊;IgA腎病;腎功能;腎小球系膜細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R691.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）31-0038-05

Renal protection effect of kunxian capsule on rat with IgA nephropathy and its influence on mesangial cell proliferation

ZENG Jiali ? JIANG Xue ? YU Jin ? TANG Xuanli ? LIN Xing ? GE Shanshan ? CHEN Hongyu

Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Mechicine， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou ? 310007， China

[Abstract] Objective To investigate the renal protection effect of kunxian capsule on rats with IgA nephropathy and its influence on mesangial cell proliferation through establishing a rat model of IgA nephropathy and rat mesangial cells in vitro experiment for drug intervention. Methods Forty-eight female SD rats were randomLy divided into the normal group， IgAN model group， valsartan group and kunxian capsule group， with 12 rats in each group. The drugs were intragastrically administered from week 5 of modeling. Six rats were selected from each group and each time in week 10 and week 16 to detect the 24 hour urine protein quantitation， serum creatinine and urea nitrogen and observe the IgA immunofluorescence and pathological changes of rat kidney. Meanwhile， IgA1 was selected to stimulate rat mesangial cells， and the mesangial cells were divided into the normal group， model group， valsartan high-low dose group and Kunxian capsule high-medium-low dose group. CCK8 was used to detect the cell proliferation and inhibition after drug intervention. Results In week 10 and week 16， there were significant differences in the 24 hour urine protein quantitation and renal function indicators between the kunxian capsule group and the model group（P<0.05）， but there was no statistically significant difference between the kunxxia capsule group and the valsartan group（P>0.05）. At the same time， it was suggested by renal tissue pathology that the degree of lesions in the kunxian capsule group was lower than that in the model group. It was suggested by cellular experiment that mesangial cell proliferation could be induced by IgA1 stimulation and kunxian capsule could significantly inhibit IgA1-induced proliferation of rat mesangial cells. Conclusion This experiment demonstrates that kunxian capsule can reduce the urine protein of IgAN rats， delay the progression of renal function and slow down the pathological changes of renal tissues. The mechanism may be achieved by inhibiting the proliferation of mesangial cells.

[Key words] Kunxian capsule; IgA nephropathy; Renal function; Mesangial cells

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是免疫復(fù)合物性腎炎，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、血尿和腎功能惡化等，其主要病理機(jī)制是多聚IgA1分子（pIgA1）及其免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積，引起腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cells，GMCs）增生、擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增加[1-3]。GMCs是腎小球中最活躍的固有細(xì)胞成分，是多種細(xì)胞因子作用的靶點(diǎn)[4]，持續(xù)的免疫復(fù)合物沉積、GMCs活化及過多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，引起GMCs增殖過度，健存腎單位進(jìn)行性減少，導(dǎo)致漸進(jìn)性的腎小球硬化和不可逆的腎功能受損。因此，抑制GMCs增殖對(duì)于減輕IgAN腎小球硬化、延緩疾病進(jìn)展具有十分重要的意義。昆仙膠囊具有祛風(fēng)濕益腎的功效，本研究擬通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對(duì)IgA腎病有腎保護(hù)作用，機(jī)制可能是通過抑制系膜細(xì)胞增生達(dá)到。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

清潔級(jí)SD雌性大鼠48只，體重180～220 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016;飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件合格證：SYXK（浙）2013-0184;大鼠腎小球系膜細(xì)胞（以下簡稱GMCs）細(xì)胞株由北京協(xié)和醫(yī)院提供。

1.2 藥物與試劑

昆仙膠囊，規(guī)格0.3 g/膠囊（廣州陳李濟(jì)藥廠，國藥準(zhǔn)字Z20060267）。雷公藤甲素（HPLC≥98%），淫羊藿苷（HPLC≥98%），購自中國藥品生物制品檢定所。纈沙坦膠囊（代文，北京諾華制藥，國藥準(zhǔn)字H2004 0217，規(guī)格80 mg/片）。纈沙坦原藥由北京諾華制藥有限公司提供。牛血清白蛋白（BSA）（Amresco公司）;脂多糖（LPS，Sigma公司）;異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗鼠IgA抗體（LSBio公司）;IgA1（Sigma公司）;Cell Counting Kit-8試劑（Dojindo Laboratorie公司）。

1.3 動(dòng)物造模及給藥

48只雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組，即正常組、IgAN模型組、纈沙坦組、昆仙膠囊組。采用免疫誘導(dǎo)聯(lián)合繼發(fā)病變?cè)炷5-6]：牛血清白蛋白（BSA）600 mg/kg隔日灌胃共10周+每周1次皮下注射四氯化碳（CCl4）0.1 mL混合蓖麻油0.3 mL共10周+第6周尾靜脈注射脂多糖（LPS）0.05 mg/只1次。正常組均以等體積生理鹽水替代進(jìn)行灌胃、尾靜脈注射及皮下注射。造模第5周開始灌胃給藥，藥物劑量按照體表面積公式推算，昆仙膠囊用量為450 mg/（kg·d），纈沙坦組用量為16.8 mg/（kg·d），模型組和正常組按等體積蒸餾水灌胃。飼養(yǎng)期間提供標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，自由攝食攝水。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)指標(biāo)

分別于第10周、第16周，每組每次隨機(jī)選取6只大鼠收集24 h尿液，測(cè)定24 h尿蛋白定量;腹主動(dòng)脈采血，測(cè)定血肌酐、血尿素氮。取約1 mm×1 mm×1 mm大鼠腎皮質(zhì)組織進(jìn)行冰凍切片，2%牛血清白蛋白封閉，稀釋（1∶75）熒光標(biāo)記IgA抗體滴于組織表面，孵育，沖洗，熒光顯微鏡下觀察大鼠腎小球系膜區(qū)IgA抗體熒光顯色情況，采用國際通用5級(jí)半定量法評(píng)價(jià)IgA沉積強(qiáng)度：低倍鏡下不能顯示、高倍鏡下似乎可見為（-）;低倍鏡下似乎可見、高倍鏡下可見為（+）;低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見為（++）;高倍鏡下耀眼為（+++）;高倍鏡下刺眼為（++++）。取3 mm×3 mm×2 mm腎皮質(zhì)置于10%福爾馬林固定液中固定;依次脫水、浸蠟、冷卻、切片、烘片、脫蠟、蘇木素染色、1%鹽酸酒精、1%碳酸鋰、1%伊紅液染色、脫水、烘干、中性樹膠封片，光鏡下觀察腎臟HE染色病理變化。取約1 mm×1 mm×1 mm的腎皮質(zhì)組織，經(jīng)2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定、脫水、環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察腎組織微觀結(jié)構(gòu)改變。

1.5 大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

大鼠GMCs用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的MEM/EBSS培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37℃、5% CO2及飽和濕度的條件下生長傳代。將IgA1解凍并稀釋濃度為100 μL/mL最佳。采用高效液相進(jìn)行昆仙膠囊中雷公藤甲素及淫羊藿苷含量測(cè)定，制成濃度為（10 μg雷公藤甲素+4.6 mg淫羊藿苷）/mL的昆仙膠囊含藥培養(yǎng)液，以雷公藤甲素濃度為標(biāo)準(zhǔn)，稀釋不同濃度的昆仙膠囊含藥培養(yǎng)液。配制纈沙坦?jié)舛葹? mg/mL的液體，稀釋相應(yīng)濃度用于細(xì)胞給藥。取對(duì)數(shù)生長期的大鼠GMCs，接種到96孔培養(yǎng)板上（共4個(gè)，作3 h、6 h、12 h和24 h檢測(cè)）培養(yǎng)。后換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步生長，棄上清，分為五組（正常組為完全培養(yǎng)液，余4組分別為IgA濃度25、50、75、100 μL/mL的培養(yǎng)液）。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，各組分別給藥處理3 h、6 h、12 h和24 h后，棄上清，加入培養(yǎng)液和CCK-8試劑（1：10稀釋），37℃避光孵育1.5 h，450 nm檢測(cè)吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，得出最佳增殖時(shí)間點(diǎn)為24 h。

1.6 大鼠系膜細(xì)胞增殖的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期的大鼠GMCs，接種到96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步生長。實(shí)驗(yàn)分組：①正常組：完全培養(yǎng)液;②模型組：正常組+mIgA1（濃度100 μL/mL）;③纈沙坦低劑量組：模型組+10-7 mg/mL的纈沙坦培養(yǎng)液;④纈沙坦高劑量組：模型組+10-5 mg/mL的纈沙坦培養(yǎng)液;⑤昆仙膠囊低劑量組：模型組+雷公藤甲素濃度為0.04 μg/mL的昆仙膠囊培養(yǎng)液;⑥昆仙膠囊中劑量組：模型組+雷公藤甲素濃度為0.06 μg/mL的昆仙膠囊培養(yǎng)液;⑦昆仙膠囊高劑量組：模型組+雷公藤甲素濃度為0.08 μg/mL的昆仙膠囊培養(yǎng)液。按不同分組加入受試品進(jìn)行藥物干預(yù)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，各組分別藥物干預(yù)12 h、24 h、36 h后，根據(jù)CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組計(jì)量資料以（x±s）表示，同組檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠第10周、第16周24 h尿蛋白定量水平比較

第10周，模型組24 h尿蛋白定量高于其余三組（P<0.05）;纈沙坦組和昆仙膠囊組無明顯差異（P>0.05），但均高于正常組（P<0.05）。第16周，模型組高于其余三組（P<0.05）;纈沙坦組與昆仙膠囊組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。纈沙坦組和昆仙膠囊組第16周尿蛋白定量均較第10周降低（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠第10周、第16周血肌酐水平比較

第10周和16周，模型組血肌酐高于其余三組（P<0.05）;纈沙坦組和昆仙膠囊組無明顯差異（P>0.05），但均高于正常組（P<0.05）。模型組第16周與第10周血肌酐比較有所上升（P<0.05），纈沙坦組和昆仙膠囊組第16周與第10周血肌酐比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠第10周、第16周血尿素氮水平比較

第10周和16周，模型組血尿素氮高于其余三組（P<0.05）;纈沙坦組和昆仙膠囊組血尿素氮第16周與第10周比較雖無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但有略微下降趨勢(shì)，兩組間血尿素氮水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表3。

2.4 大鼠腎臟病理改變

2.4.1 免疫熒光IgA沉積情況 ?第10周正常組大鼠腎小球系膜區(qū)無明顯IgA免疫復(fù)合物沉積;其余各組大鼠均可見到綠色I(xiàn)gA熒光免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)呈團(tuán)塊狀或顆粒狀沉積，模型組熒光強(qiáng)度為++～++++，藥物干預(yù)組熒光強(qiáng)度為++～+++。見封三圖1。

2.4.2 HE染色病理形態(tài)學(xué)改變 ?觀察第16周各組大鼠腎皮質(zhì)組織標(biāo)本，可見正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，系膜細(xì)胞及基質(zhì)未見明顯增生，未見腎小球細(xì)胞性或纖維性新月體形成，未見硬化腎小球;模型組均可見腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕重不等的彌漫性增生，局灶性系膜細(xì)胞增生、硬化，伴腎小管灶狀萎縮，腎間質(zhì)灶狀淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，伴或不伴有纖維化。纈沙坦組和昆仙膠囊組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)彌漫性增生情況較模型組輕，纈沙坦組與昆仙膠囊組之間病變情況未見明顯差異。見封三圖2。

2.4.3 電鏡下病理形態(tài)學(xué)改變 ?觀察第16周電鏡下各組大鼠腎臟病變情況，正常組無腎小球系膜細(xì)胞、基質(zhì)增生及電子致密物沉積，足突細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊有序。模型組可見腎小球系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)明顯增多，伴有大量電子致密物沉積及部分足突融合。纈沙坦組和昆仙膠囊組系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多及電子致密物沉積較模型組相對(duì)較少，纈沙坦組與昆仙膠囊組之間未見明顯差異。見封三圖3。

2.5 大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖抑制情況

經(jīng)IgA1誘導(dǎo)增生后大鼠GMCs增殖明顯，24 h時(shí)模型組增殖水平與其他各組存在顯著性差異（P<0.05）。昆仙膠囊及纈沙坦對(duì)IgA1誘導(dǎo)的GMCs增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，其中昆仙膠囊中高劑量組優(yōu)于纈沙坦高、低劑量組（P<0.05）。36 h時(shí)昆仙膠囊各濃度組及纈沙坦高劑量組細(xì)胞增殖水平明顯低于模型組（P<0.05），昆仙各劑量組細(xì)胞增殖水平均明顯低于正常組（P<0.01），說明給藥36 h時(shí)間過長，對(duì)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用太過。見表4、5。

3 討論

IgA腎病是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病，約占原發(fā)性腎小球腎炎的43.5%～54.3%，是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因之一。目前認(rèn)為[10-12]，遺傳、環(huán)境和免疫因素共同決定了IgA腎病的發(fā)病，發(fā)病的始動(dòng)因素可能是IgA1分子糖基化異常，造成IgA1易自身聚集或被IgG或IgA識(shí)別形成免疫復(fù)合物，與系膜細(xì)胞結(jié)合沉積，進(jìn)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，使腎小球細(xì)胞增生，腎小球硬化、小管萎縮和間質(zhì)纖維化。目前，IgA腎病常見治療方案有激素、免疫抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）等[13]。本實(shí)驗(yàn)采用臨床運(yùn)用廣泛的ARB類藥物纈沙坦膠囊作為藥物陽性對(duì)照用藥。中成藥昆仙膠囊由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子和菟絲子四藥配伍制成，祛風(fēng)除濕、補(bǔ)腎通絡(luò)。其中君藥昆明山海棠是衛(wèi)矛科雷公藤屬，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、清熱解毒功效，主要成分雷公藤甲素具有免疫抑制與抗炎作用;臣藥淫羊藿祛風(fēng)濕、補(bǔ)腎強(qiáng)精，所含的淫羊藿苷具保護(hù)生殖和骨骼系統(tǒng)及類激素樣作用;菟絲子、枸杞子為佐使，菟絲子的主要成分黃酮具調(diào)節(jié)免疫、保肝及類激素樣作用，枸杞子所含的甜菜堿能調(diào)節(jié)免疫、保肝、提高生殖能力，二者與淫羊藿共同發(fā)揮補(bǔ)腎養(yǎng)血，強(qiáng)精健骨功效，并能減少昆明山海棠的對(duì)肝腎及性腺的毒副作用，達(dá)到增效減毒的效果[14]。臨床上昆仙膠囊主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等免疫相關(guān)性疾病[15-16]。亦有研究表明[17-19]，昆仙膠囊能降低狼瘡性腎炎、腎病綜合征、慢性腎臟病患者的24 h尿蛋白定量，且無明顯肝腎功能損害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示[20]，昆仙膠囊可降低陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的大鼠原位免疫復(fù)合物模型的24 h尿蛋白定量，改善腎小球病理損害，其機(jī)制可能與昆仙膠囊降低免疫復(fù)合物在基底膜沉積有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)IgA腎病大鼠造模模型采用免疫誘導(dǎo)聯(lián)合繼發(fā)病變型，應(yīng)用大分子物質(zhì)BSA作為免疫原，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，CCL4皮下注射減低肝臟清除能力，使血液中的IgA聚集形成免疫復(fù)合物，在腎小球系膜區(qū)沉積，并注射免疫佐劑LPS增強(qiáng)免疫原性[5-6]。此造模方法安全性高，實(shí)驗(yàn)過程中無實(shí)驗(yàn)大鼠死亡，免疫熒光可見腎小球系膜區(qū)較強(qiáng)的IgA免疫復(fù)合物沉積，實(shí)驗(yàn)第10周檢測(cè)24 h尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮方面，模型組均較正常組有顯著性差異，提示IgA腎病大鼠造模成功。第16周病理HE染色和電鏡均提示昆仙膠囊組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)彌漫性增生及免疫復(fù)合物沉積情況較模型組輕。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示大鼠GMCs經(jīng)血清IgA1刺激24 h后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞增殖，而昆仙膠囊組及纈沙坦組對(duì)IgA1誘導(dǎo)的大鼠GMCs增殖具有明顯的抑制作用，與模型組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈一定的劑量依賴關(guān)系，其中昆仙中高劑量組抑制作用優(yōu)于纈沙坦組。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示昆仙膠囊在保護(hù)IgA腎病模型大鼠腎功能、減少24 h蛋白尿、減緩腎臟病理病變速度方面具有一定作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖而達(dá)到的。

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（收稿日期：2019-06-05）