己酮可可堿調(diào)節(jié)微RNA-122和過氧化物酶體增殖物激活受體α減輕酒精性肝炎大鼠肝損傷

白志金 田曉娟 丁瑞峰

酒精性肝病(ALD)是我國常見的慢性肝病之一[1]。臨床上將ALD分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝(AFL)、酒精性肝炎(AH)、酒精性肝纖維化(AHF)和酒精性肝硬化。目前，AH的發(fā)病機(jī)制仍然不完全明確，推測(cè)與乙醇引起的脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、肝細(xì)胞炎性反應(yīng)等相關(guān)。微RNA(miRNA)-122定位于人染色體18q21.31[2]，約占成年個(gè)體肝臟總miRNA的72%。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)為miRNA-122的靶基因，屬于過氧化物酶體增殖物激活受體家族(PPARs)中一員。本研究旨在探討己酮可可堿(PTX)對(duì)AH大鼠肝功能的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 7～8周齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠30只，體重為(190±20)g，均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心供應(yīng)，許可證號(hào)為SCXK(蒙)2015-0001。高脂飼料以普通飼料、膽固醇、豬油按質(zhì)量比87∶3∶10混合固定成型后輻照滅菌。

1.2 主要試劑和儀器 石蠟包埋組織切片miRNA-122提取試劑盒、miRNA-122及其互補(bǔ)DNA(cDNA)第一鏈合成試劑盒、miRNA-122熒光定量檢測(cè)試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR 引物購自南京博爾迪生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自美國Bio-Rad公司；GAPDH一抗(ab8245)和PPAR-α一抗(ab3484)購自美國Abcam公司；羊抗鼠二抗(ZB-2305)和羊抗兔二抗(ZB-2301)購自北京中杉金橋公司；ECL顯影液(sc-2048)購自美國Santa Cruz公司。5804R低溫高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀和Powerpac HQ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，計(jì)算機(jī)圖像分析儀為美國IPP公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)PCR儀為中國杭州朗基公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為中國上海天能公司產(chǎn)品。

1.3 大鼠的分組和處理 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分入空白對(duì)照組(對(duì)照組)、AH模型組(模型組)和PTX組，每組10只。3組大鼠均予普通飼料進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，之后模型組和PTX組改用梯度乙醇灌胃輔以高脂飲食造模，方法參照前期實(shí)驗(yàn)[3]和文獻(xiàn)[4-5]的方法并加以改進(jìn)，即以高脂飼料飼喂;1～3周予35%乙醇6.0 g/(kg·d)，4～6周予40%乙醇7.0 g/(kg·d)、7～9周予45%乙醇8.0 g/(kg·d)，10～12周予50%乙醇9.0 g/(kg·d)，均于每日上午9:00灌胃。對(duì)照組在同時(shí)段予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。PTX組從第9周開始于每日15:00加用PTX灌胃，按成人和大鼠體表面積和藥效等效劑量計(jì)算PTX劑量為9 mg/(kg·d)[6]，持續(xù)4周；對(duì)照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。造模時(shí)間共12周。造模結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h，按各組序號(hào)依次稱重，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血4 mL，按壓止血。立即切除兩側(cè)肝韌帶，完整摘取肝臟后置于無菌盒內(nèi)稱重。計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)。

1.4 血液檢測(cè) 將血液標(biāo)本放置10～20 min凝固，必要時(shí)可置37 ℃恒溫箱中促凝，以1 006.2×g離心10 min。應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白水平。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查 取大小為2.0 cm×2.0 cm的大鼠新鮮肝臟右葉組織2塊，分別置入液氮和包埋盒中，用40%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，經(jīng)H-E染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)大鼠肝組織 miRNA-122的表達(dá) 取上述大鼠肝臟石蠟標(biāo)本切片10片分別裝入1.5 mL Eppendorf(EP)管中，應(yīng)用miRNA提取試劑盒對(duì)不同樣本內(nèi)的總RNA進(jìn)行提取，再分別檢測(cè)其濃度。應(yīng)用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈試劑盒，提取RNA和完成反轉(zhuǎn)錄。條件為42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以cDNA為主，參照增強(qiáng)型miRNA熒光實(shí)時(shí)測(cè)定試劑中體系熒光強(qiáng)度。PCR過程：95 ℃總變性15 min，94 ℃重新變性20 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。完畢后，明確擴(kuò)增曲線、熔解曲線，PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，利用熒光定量檢測(cè)儀計(jì)算 2-ΔΔCt,并分析 miRNA-122 在各個(gè)樣本中的表達(dá)情況。PCR引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.7 Western印跡法檢測(cè)大鼠肝組織PPAR-α蛋白質(zhì)表達(dá) 從液氮中取出大鼠肝組織，加入預(yù)冷的PBS洗滌組織，將放射免疫沉淀裂解液(RIPA裂解液)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑按體積比100∶1∶1配制裂解液，每管加入500 μL裂解液，均化后于4 ℃ 15 min裂解。以1 006.2 ×g離心10 min后，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。倒入緩沖液混勻，沸水煮10 min變性；經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，偏聚二氟乙烯(PVDF)薄膜電轉(zhuǎn)印。以5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入一抗(PPAR-α抗體效價(jià)為1∶1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜加入相應(yīng)來源的HRP二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后經(jīng)ECL顯影，于X線下壓片、曝光；應(yīng)用IPP軟件分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 對(duì)照組大鼠精神良好，飲食佳，活動(dòng)可，反應(yīng)靈敏，毛色光澤，飼養(yǎng)期間體重逐漸增加。模型組和PTX組大鼠精神萎靡，飲食差，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，毛色無光澤，有脫毛、掉毛現(xiàn)象,造模期間體重下降明顯；在給予藥物干預(yù)后，PTX組大鼠精神、飲食較前好轉(zhuǎn)，嗜睡程度減輕，脫毛、掉毛現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，體重呈上升趨勢(shì)。

2.2 大鼠體重、肝重和肝指數(shù)比較 對(duì)照組大鼠體重顯著高于模型組和PTX組(P值均<0.01)；PTX組大鼠體重顯著高于模型組(P<0.01)。模型組和PTX組大鼠肝重、肝指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.01)，PTX組大鼠肝重、肝指數(shù)均顯著低于模型組(P值均<0.01)。見表2。

組別體重(g)肝重(g)肝指數(shù)(%)對(duì)照組348.10±8.929.57±0.582.75±0.11模型組296.20±9.13①13.05±1.05①4.40±0.31①PTX組316.10±10.18①②11.31±0.77①②3.59±0.33①②

與對(duì)照組比較：①P<0.01。與模型組比較：②P<0.01

2.3 大鼠肝功能指標(biāo)比較 模型組和PTX組血清ALT、AST、GGT水平均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，白蛋白水平均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)；PTX組血清ALT、AST、GGT水平均顯著低于模型組(P值均<0.05)，白蛋白水平顯著高于模型組 (P<0.05)。見表3。

表3 大鼠肝功能指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較：①P<0.05。與模型組比較：②P<0.05

2.4 大鼠肝組織H-E染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列緊密，肝索從中央靜脈起始，呈放射狀有序排列。模型組大鼠肝組織肝細(xì)胞變性、腫脹，有較多脂肪空泡，可見脂肪變性，有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組比較，PTX組肝細(xì)胞的損傷、脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤均有不同程度減輕。見圖1。

A 對(duì)照組 B 模型組 C PTX組

2.5 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)大鼠肝組織miRNA-122的表達(dá) 模型組和PTX組miRNA-122的相對(duì)表達(dá)量分別為13.02±3.46和3.45±1.94，均較對(duì)照組(1.00±0.00)顯著上調(diào)(P值分別<0.01、0.05)；PTX組miRNA-122相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著下調(diào)(P<0.01)。

2.6 Western印跡法檢測(cè)大鼠肝臟組織中PPAR-α蛋白質(zhì)的表達(dá) 模型組和PTX組大鼠肝組織PPAR-α蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.11和0.74±0.08，均顯著低于對(duì)照組的1.14±0.16(P值均<0.01)；PTX組大鼠肝組織PPAR-α蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.01)。見圖2。

1 對(duì)照組 2 模型組 3 PTX組

3 討 論

ALD發(fā)展進(jìn)程中，AH是非常關(guān)鍵的階段，炎性反應(yīng)被認(rèn)為是影響ALD預(yù)后的主要因素[7]，所以在AH階段進(jìn)行干預(yù)治療具有重要意義。目前，AH治療并無特效藥物，因此研究可能用于治療AH的藥物和了解相關(guān)藥物的作用靶點(diǎn)亦具有重要意義。

miRNA-122可以反映肝臟組織的病理學(xué)改變。Zhang等[8]的研究證實(shí)，miRNA-122在酒精性肝損傷時(shí)會(huì)升高，并且與肝臟的病理學(xué)變化一致。miRNA-122的靶基因PPAR-α屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族，介導(dǎo)脂質(zhì)能量代謝和炎性反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。有研究[9]結(jié)果表明，ob/ob肥胖小鼠肝臟中miRNA-122表達(dá)量的下降能夠?qū)е缕浒谢騊PAR-α的蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。

PTX有較好的抗炎和抗免疫效果，能夠?qū)ρ趸瘧?yīng)激反應(yīng)起到一定的抑制作用[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，予大鼠高脂飲食和乙醇灌胃后，模型組和PTX組大鼠均出現(xiàn)不同程度易怒、飲食減少、消瘦、精神差等癥狀，肝重、肝指數(shù)，以及血清ALT、AST、GGT水平均高于對(duì)照組，白蛋白水平均顯著低于對(duì)照組；H-E染色結(jié)果提示，模型組的肝組織呈現(xiàn)出脂肪變性、氣球樣變，炎性細(xì)胞有高度浸潤的現(xiàn)象，說明造模成功。經(jīng)過藥物干預(yù)，PTX組大鼠一般情況好轉(zhuǎn)，與模型組比較，體重有所上升，而肝重、肝指數(shù)和血清ALT、AST、GGT水平均下降，白蛋白水平上升；肝組織病理學(xué)變化也有所好轉(zhuǎn)，脂肪變性和炎性反應(yīng)均有不同程度減輕。說明PTX具有減緩大鼠AH進(jìn)展，改善病情的作用。

miRNA-122特異性表達(dá)于肝臟，廣泛參與肝臟的病理生理過程，對(duì)肝臟的生長、發(fā)育、代謝，對(duì)肝細(xì)胞異常增殖、凋亡、調(diào)控和參與肝臟疾病的形成，均有一定的作用。Laterza等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-122對(duì)肝臟的損傷較ALT、AST等傳統(tǒng)標(biāo)志物的特異度和敏感度更高，且與肝臟組織病理學(xué)變化更具相關(guān)性，提出miRNA-122可作為獨(dú)立的肝臟組織損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。動(dòng)物研究[8,11]發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝損傷時(shí)外周血和肝臟miRNA-122有明顯上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，AH大鼠肝臟 miRNA-122存在特異性高表達(dá)，在PTX干預(yù)后miRNA-122表達(dá)下調(diào)，提示PTX可能通過下調(diào)miRNA-122表達(dá)來減輕大鼠酒精性肝損傷，從而改善AH的病情。

PPAR-α是miRNA-122的靶基因之一,可以減少氧化應(yīng)激，抑制炎性反應(yīng)，從而緩解乙醇對(duì)肝臟的損傷,PPAR-α還能通過調(diào)節(jié)脂肪酸的生成、氧化和儲(chǔ)存相關(guān)基因的表達(dá)來抑制脂肪在肝臟內(nèi)的蓄積[12]。曹智麗[13]的研究結(jié)果表明,PPAR-α在ALD由AFL逐步進(jìn)展為AH、AHF的過程中均具有重要阻遏作用，隨著肝臟受損的加重，PPAR-α蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸減少。

本研究結(jié)果顯示，在AH大鼠模型中miRNA-122的表達(dá)水平顯著升高，其靶基因PPAR-α表達(dá)下降，說明miRNA-122-PPAR-α途徑可能參與介導(dǎo)了AH的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)過PTX干預(yù)，PTX組大鼠的一般情況、體重、肝重、肝指數(shù)、肝功能、肝臟病理學(xué)改變均較模型組好轉(zhuǎn)，并通過觀察miRNA-122和PPAR-α蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-122表達(dá)水平下降時(shí)，PPAR-α蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高。這說明乙醇可能通過抑制PPAR-α蛋白質(zhì)的表達(dá)使肝臟受損，而PTX可能通過上調(diào)PPAR-α的表達(dá)來抑制AH的進(jìn)展。

綜上所述，PTX對(duì)大鼠AH具有一定的治療作用，其可能的分子機(jī)制為PTX通過下調(diào)miRNA-122和上調(diào)其靶基因PPAR-α,進(jìn)一步調(diào)控PPAR-α下游靶基因的表達(dá)對(duì)大鼠AH發(fā)揮治療作用。