卵巢上皮性惡性腫瘤患者T淋巴細胞相關(guān)細胞因子與順鉑耐藥的相關(guān)性

韓欽維 吳智玉 吳金萍 劉瑾華 白 丹 楊麗娜

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，以上皮性卵巢癌最為常見[1]。早期卵巢癌無特異性癥狀，多數(shù)在晚期才被發(fā)現(xiàn)，>70%的患者在確診時已處于國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期Ⅲ或Ⅳ期，發(fā)生腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移[2]。卵巢癌的治療包括手術(shù)、化學治療(簡稱化療)和放射治療(簡稱放療)，目前新的治療方法包括基因治療、血管生成抑制治療和免疫治療，但療效均不確切[3-5]?；熓锹殉舶┲委煹闹匾侄?，多數(shù)患者術(shù)后需輔助化療。鉑類藥物和紫杉醇是治療卵巢癌的標準化療方案[6-7]。在化療初期，患者的治療敏感率約為80%，但隨著化療時間的延長，多數(shù)患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥，導致預后不良[8]。

在對抗腫瘤的過程中，細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要形式。T淋巴細胞亞群可產(chǎn)生眾多細胞因子，在免疫細胞對抗腫瘤和免疫應答過程中發(fā)揮作用[9-10]，其中有4種細胞因子在激活細胞免疫和誘導機體對抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。如IL-2可刺激細胞毒T細胞(CTL)的殺瘤活性，IFN-γ是較強的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤因子，TNF-α可誘導腫瘤細胞的凋亡等[11-12]。近期研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，免疫微環(huán)境中的IFN-γ等細胞因子是機體對抗腫瘤的重要因素，在腫瘤耐藥性的形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析卵巢癌患者的順鉑耐藥與血清T淋巴細胞相關(guān)細胞因子水平的相關(guān)性，旨在探討順鉑刺激對機體淋巴細胞，尤其是CD8+T淋巴細胞功能的影響，以及T淋巴細胞相關(guān)細胞因子在順鉑耐藥過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本采集 選擇2010年5月—2018年1月西安市兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所婦產(chǎn)科收治的37例卵巢上皮性惡性腫瘤患者，年齡38～69歲，平均年齡為(54.00±13.11)歲。患者入院后均接受腫瘤細胞減滅手術(shù)聯(lián)合順鉑的化療，手術(shù)當日留取腫瘤標本進行化療藥物的耐藥性檢測和T淋巴細胞相關(guān)細胞因子的檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 檢測順鉑耐藥性 采用ATP生物熒光腫瘤體外藥物敏感檢測(ATP-TCA)法檢測腫瘤組織的順鉑耐藥性，ATP-TCA試劑盒(購自上海海創(chuàng)生物科技公司)包括完全培養(yǎng)液、腫瘤組織消化酶、ATP抽提劑、熒光素-熒光素酶、稀釋緩沖液、ATP標準液等。選用100%血漿峰值濃度(100%PPC)的順鉑(山東齊魯制藥有限公司)6.3 mg/L。主要操作步驟：取手術(shù)當日留取的腫瘤標本清洗剪碎，經(jīng)酶解液酶解后于檢測培養(yǎng)基中孵育約6 h，制成腫瘤細胞懸液，檢測細胞存活率。將順鉑分別按藥物使用濃度(6.3 mg/L)的200%、100%、50%、25%、12.5%和6.25%的濃度進行配制。將腫瘤細胞加入含化療藥的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，以ATP提取液抽提腫瘤細胞ATP，應用熒光素酶試劑檢測其熒光值。

1.3 ELISA法檢測血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平 根據(jù)患者對順鉑的敏感和耐藥情況將其分為兩組，即耐藥組(11例)和敏感組(26例)，抽取兩組患者靜脈血，采用ELISA法檢測血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。ELISA試劑盒購自美國eBioscences公司。將標準品按產(chǎn)品說明書稀釋，加入相應的反應孔中。收集樣本各50 μL加入相應的反應孔中，在各反應孔中加入50 μL生物素標記的抗體反應液。移去各孔內(nèi)液體，加入200 μL洗滌液清洗反應孔3次，每次5 min，移去洗滌液。隨后向各孔中加入100 μL的HRP偶聯(lián)抗體，置于室溫孵育30 min。移去各孔內(nèi)液體，加入洗滌液清洗反應孔4次，每次5 min，移去洗滌液。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液100 μL，避光37 ℃孵育15 min。取出反應板，加入50 μL終止液終止顯色反應，立即檢測樣本在波長為450 nm處的吸光度(A450)值。

1.4 實時定量PCR檢測外周血單個核細胞(PBMC)和腫瘤組織中IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平 分別在耐藥組和敏感組隨機(對角線取樣法)選取6例患者，取其靜脈血樣本和腫瘤組織。采用Ficoll密度梯度離心法提取血液樣本PBMC，應用QiagenRNA提取試劑盒(購自美國Qiagen公司)提取PBMC總mRNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。提取的細胞總mRNA經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國ThermoFisher公司)進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，采用實時定量PCR檢測IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平。應用熒光定量PCR試劑盒(購自日本TaKaRa公司)進行熒光PCR反應，應用iQ5實時定量PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)進行PCR擴增反應。熒光定量實驗以GAPDH為內(nèi)參照，計算Ct值，采用2-ΔΔCt法相對定量各因子mRNA的表達水平。各引物序列：IL-10正向引物5’-CCC TGG GTG AGA AGC TGA AG-3’，IL-10反向引物5’-CAC TGC CTT GCT CTT ATT TTC ACA-3’；IL-2正向引物5’-ACT CAC CAG GAT GCT CAC AT-3’，IL-2反向引物5’-AGG TAA TCC ATC TGT TCA GA-3’；IL-4正向引物5’-ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG C-3’，IL-4反向引物5’-TTC CTG TCG AGC CGT TTC AG-3’；IFN-γ正向引物5’-AGT TAT ATC TTG GCT TTT CA-3’，IFN-γ反向引物5’-ACC GAA TAA TTA GTC AGC TT-3’；TNF-α正向引物5’-GCG TGT TCA TCC GTT CTC TAC-3’，TNF-α反向引物5’-TTC TGA GCA TCG TAG TTG TTG G-3’；GAPDH正向引物5’-AGG TGA AGG TCG GAG TCA ACG-3’，GAPDH反向引物5’-AGG GGT CAT TGA TGG CAA CA-3’。

1.5 流式細胞儀檢測PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達水平 收集敏感組和耐藥組患者的靜脈血樣本，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，將新鮮分離的PBMC以流式洗液洗滌2次后垂懸調(diào)整細胞密度為1×106/mL。分別以抗人CD3的FITC熒光染料抗體(anti-hCD3-FITC抗體)和抗人CD8的多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復合物(PerCP)熒光染料抗體(anti-hCD8-PerCP抗體)標記PBMC表面的CD3和CD8分子，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗滌3次。用細胞透膜液處理細胞后，以抗人IFN-γ的藻紅蛋白(PE)熒光染料抗體(anti-hIFN-γ-PE抗體)標記細胞產(chǎn)生的IFN-γ，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗滌3次。用500 μL流式洗液將各組細胞垂懸后，應用流式細胞儀檢測PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平 耐藥組血清IL-2和IFN-γ水平均顯著低于敏感組(P值均<0.05)，兩組間血清TNF-α水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別NIL-2TNF-αIFN-γ耐藥112.934±0.82510.590±0.6475.231±0.905敏感26 3.551±0.745①10.800±1.059 6.685±1.380①

與耐藥組比較：①P<0.05

2.2 兩組患者腫瘤組織和PBMC中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平 敏感組腫瘤組織中TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平均顯著高于耐藥組(P值均<0.05)，兩組間IL-2、IL-4、IL-10的mRNA表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)；敏感組PBMC中IFN-γ的mRNA表達水平顯著高于耐藥組(P<0.05)，IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的mRNA表達水平較耐藥組有升高的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表2。

2.4 兩組患者PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達水平 兩組PBMC中IFN-γ蛋白質(zhì)表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，敏感組CD4+和CD8+T淋巴細胞中的IFN-γ蛋白質(zhì)表達水平均顯著高于耐藥組(P值分別<0.01、0.05)。見表3。

組別腫瘤組織IL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γPBMCIL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γ耐藥3.082±2.5882.188±0.8522.211±0.1310.580±0.2580.419±0.1561.463±0.8983.301±1.7480.576±0.2332.801±2.6241.266±1.239敏感2.730±1.0632.927±1.4431.569±0.4273.701±1.427①1.220±0.220①2.016±1.5145.050±4.6040.813±0.6043.632±3.6392.998±1.331①

與耐藥組比較：①P<0.05

組別NPBMCCD4+T淋巴細胞CD8+T淋巴細胞耐藥1122.535±2.89027.643±5.67210.813±0.953敏感2626.878±3.87434.867±4.629②13.787±0.925①

與耐藥組比較：①P<0.01，②P<0.05

3 討 論

目前，腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類藥物化療是公認的卵巢上皮性惡性腫瘤標準化治療方案。順鉑作為一線化療藥物被廣泛應用于臨床，對各種實體腫瘤均有明顯的治療效果[15]。Tomao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可抑制包括DNA復制和RNA轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的眾多細胞代謝過程，進而誘導細胞凋亡。此外，順鉑還能誘導細胞凋亡受體5(DR5)等細胞凋亡信號，促進腫瘤細胞的死亡[16-17]。然而，腫瘤細胞可對鉑類藥物產(chǎn)生耐受，嚴重影響化療效果，導致腫瘤復發(fā)[15,18]。因此，明確鉑類藥物的耐藥機制對提高卵巢癌的化療效果具有重要意義。本研究對卵巢癌患者順鉑耐藥與免疫細胞因子水平的相關(guān)性進行分析，檢測順鉑對機體淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞功能的影響。

本研究結(jié)果顯示，順鉑敏感組的腫瘤組織、血清和PBMC中IFN-γ水平均顯著高于順鉑耐藥組，表明順鉑耐藥組患者T淋巴細胞IFN-γ分泌功能顯著低于順鉑敏感組，提示患者對順鉑藥物的敏感性可能與T淋巴細胞免疫應答狀態(tài)相關(guān)。IFN-γ是重要的抗腫瘤細胞因子。近期研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織成纖維細胞分泌的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸可通過協(xié)同運輸?shù)姆绞浇閷ы樸K從腫瘤細胞內(nèi)向細胞外運輸，從而減少順鉑在腫瘤細胞中的積累，降低其敏感性；但另一方面，腫瘤間質(zhì)CD8+T淋巴細胞可通過分泌IFN-γ減少成纖維細胞半胱氨酸和GSH代謝，對順鉑向細胞外轉(zhuǎn)運產(chǎn)生抑制作用。本研究結(jié)果顯示，敏感組CD4+和CD8+T淋巴細胞中的IFN-γ水平均顯著高于耐藥組，提示IFN-γ水平升高可能在順鉑耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，順鉑藥物耐藥性可能與CD4+和CD8+T淋巴細胞的免疫應答狀態(tài)相關(guān)，血清、PBMC和腫瘤組織中IFN-γ水平升高可能對維持卵巢上皮性惡性腫瘤患者順鉑藥物敏感性具有重要意義。