同時檢測降脂紅曲中酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀的TLC方法的建立

鄭文偉 林軍 吳麗云 林風(fēng)

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術(shù)開發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福州 350007)

薄層色譜法(TLC)法作為一種快速、簡單、專屬性強的鑒別方法，已被廣泛用于中藥材及中成藥的鑒別[1-2]。天然發(fā)酵的降脂紅曲中通常同時含有酸式和內(nèi)酯式兩種結(jié)構(gòu)洛伐他汀成分，前者降脂活性約為后者的2倍[3]。由于酸式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且易轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)，所以2015版中國藥典中成藥血脂康原料標(biāo)準(zhǔn)只把內(nèi)酯式洛伐他汀的含量作為質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)[4]，導(dǎo)致功能紅曲中的酸式結(jié)構(gòu)成分被廣泛忽視。功能紅曲中洛伐他汀檢測幾乎都采用HPLC方法。HPLC方法雖能同時檢測出酸式和內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)成分，但因其成本高、耗時長、效率低，無法滿足于大量樣品檢測分析的需要。目前應(yīng)用于降脂紅曲的TLC方法研究甚少[5-6]。因此，建立一種能同時檢測降脂紅曲中酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀成分的TLC方法，對今后降脂紅曲的質(zhì)量控制有著重要意義。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

降脂紅曲(6批均由福建省微生物研究所收藏的不同優(yōu)良紅曲霉菌接種于大米發(fā)酵而成)；洛伐他汀對照品(批號：100600-201805，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(HPLC級別，德國Merck公司)；硅膠G薄層板(批號：20190102，青島海洋化工)；二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、丙酮、酒精、磷酸、磷鉬酸、甲醇、氨水、碘均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、DAD二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；超聲清洗儀(昆明市超聲儀器有限公司)；高速離心機(美國Sigma公司)；電子分析天平(上海力辰有限公司)；粉碎機(九陽公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 內(nèi)酯式洛伐他汀溶液配制

精密稱取洛伐他汀對照品適量，置于10mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.150mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 酸式洛伐他汀溶液制備[7]

精密量取“2.1.1”項的對照品溶液適量，加入0.2mol/L NaOH溶液，50℃下超聲處理1h，冷卻至室溫后加入鹽酸調(diào)節(jié)中性，混勻，0.45μm濾膜過濾，濾液4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 提取劑的選擇及供試品溶液制備

本課題組前期考察了不同濃度(50%、75%和100%)的甲醇、乙醇和乙腈為提取劑時紅曲中洛伐他汀的提取效率。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%乙腈、75%乙醇的提取率均較高，且兩者提取效果接近，故本實驗最終選擇以更為環(huán)保的75%乙醇作為提取劑。

取降脂紅曲粉末1g，置于具塞錐形瓶中，加入75%乙醇4mL，混勻，超聲處理1h，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.1.4 展開劑選擇

吸取適量的內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、6批降脂紅曲供試品溶液，點于同一塊硅膠G薄層板(平行試驗3次)，分別以氯仿-甲醇-氨水(25:75:1)[5]、二氯甲烷-丙酮(4:1)[4]為展開劑，展開，取出并晾干，用碘蒸氣熏至斑點清晰。結(jié)果以氯仿-甲醇-氨水(25:75:1)為展開劑時，內(nèi)酯式洛伐他汀斑點清晰且展距合適，但酸式洛伐他汀的展距卻很小(圖1A)；以二氯甲烷-丙酮(4:1)為展開劑時未見酸式洛伐他汀斑點(圖1B)。

針對上述薄層色譜結(jié)果，本研究對展開劑進行改進，換成二氯甲烷-丙酮-甲酸(75:25:1)、二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)。結(jié)果以二氯甲烷-丙酮-甲酸(75:25:1)為展開劑時酸式、內(nèi)酯式洛伐他汀均能顯示斑點，但酸式洛伐他汀有其他成分干擾(圖1C)；以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)為展開劑時，酸式、內(nèi)酯式洛伐他汀斑點清晰且分離良好，Rf值適中(圖1D)。故最終選擇二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)為展開劑。

2.1.5 上樣量選擇

分別吸取1、2、3、4、5、6、7、8、9和10μL供試品溶液點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)為展開劑，展開，取出并晾干，并分別置于碘蒸氣下熏至斑點清晰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上樣量8μL時，斑點清晰，拖尾現(xiàn)象較小，故以8μL為上樣體積。

2.1.6 顯色方法選擇

圖1 不同展開劑下的薄層色譜圖Fig.1 TLC of different developing solvents

吸取內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀、6批降脂紅曲供試品溶液各8μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)為展開劑，展開，取出并晾干后并分別置于碘蒸氣、5%磷鉬酸、10%硫酸乙醇溶液、紫外燈(254nm波長下)4種顯色方法下顯色。結(jié)果如圖2所示，4種顯色方法下，均能觀察到6批功能紅曲樣品在與內(nèi)酯式洛伐他汀、酸式洛伐他汀相對應(yīng)位置上出現(xiàn)相同顏色斑點(碘蒸氣作用下斑點呈黃色，詳見圖2A；5%磷鉬酸乙醇溶液作用下斑點呈藍綠色，詳見圖2B；10%硫酸乙醇溶液作用下斑點呈藍紫色，詳見圖2C；254nm紫外燈下斑點呈藍色熒光，但顏色較淡，詳見圖2D)。以上4種顯色方法斑點清晰程度順序為：碘蒸氣＞5%磷鉬酸乙醇溶液＞10%硫酸乙醇溶液＞紫外燈(254nm)，故將碘蒸氣優(yōu)先作為顯色劑。

圖2 不同顯色條件下的薄層色譜圖Fig.2 TLC of different chromogenic agents

2.1.7 檢出限考察

將“2.1.1”和“2.1.2”項下的對照品溶液稀釋成不同濃度，分別吸取8μL(相當(dāng)于0.115、0.230、0.575、1.150、2.300、3.450、4.600和5.750μg的內(nèi)酯式洛伐他?。幌喈?dāng)于0.092、0.184、0.460、0.920、1.840、2.760、3.680和4.600μg酸式洛伐他汀)點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-乙酸(75:25:1)為展開劑，展開，取出并晾干后置于碘蒸氣顯色。本實驗以薄層板上能顯色斑點的最小濃度作為該方法的檢出限。2015年版中國藥典血脂康膠囊/片的原料紅曲標(biāo)準(zhǔn)、2015年版《四川省中藥炮制規(guī)范》、2007年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》分別規(guī)定降脂紅曲所含內(nèi)酯式洛伐他汀含量分別不得低于2.2、4和4mg/g[4,8-9]。如圖3所示，內(nèi)酯式洛伐他汀在B位置處斑點開始顯色，檢出限為0.230μg(相當(dāng)于含0.12mg/g內(nèi)酯式洛伐他汀的降脂紅曲)；酸式洛伐他汀在K位置處斑點開始顯色，檢出限為0.460μg(相當(dāng)于含0.23mg/g酸式洛伐他汀的降脂紅曲)，說明所建立的TLC法靈敏度較高，能滿足市面大部分降脂紅曲的鑒別。

圖3 薄層色譜檢出限Fig.3 The detection limit of TLC

2.2 HPLC測定降脂紅曲中洛伐他汀含量

2.2.1 色譜條件[10-11]

反相色譜柱為Kromasil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；柱溫為28℃；流動相為乙腈-0.1%磷酸水(65:35)；檢測波長為238nm；上樣量為10μL。

2.2.2 樣品處理[10]

將紅曲粉末粉碎(過40目篩)，粉末充分混合均勻，準(zhǔn)確稱取約500.0mg樣品于50mL容量瓶中，加入30mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，搖勻，室溫下超聲50min。加入75乙醇至刻度，超聲10min,冷卻至室溫后75%乙醇定容至刻度，離心，取上清液備用。

2.2.3 樣品中洛伐他汀含量檢測

將6批紅曲按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下的色譜條件進樣分析，求算出樣品中洛伐他汀平均含量。結(jié)果表明，6批降脂紅曲中均檢測到酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀，且酸式結(jié)構(gòu)所占比例在40.15%～49.40%(表1)，與TLC檢測結(jié)果相似。

3 討論

降脂紅曲的質(zhì)量控制直接關(guān)系到降脂紅曲及其相關(guān)制劑的臨床用藥安全性、有效性。洛伐他汀不僅是降脂紅曲主要降血脂功效成分[12]，也是區(qū)別降脂紅曲與普通紅曲的重要依據(jù)。酸式洛伐他汀能直接競爭性地抑制膽固醇合成途徑中的限速酶—HMGCoA還原酶，從而有效減少或阻斷膽固醇合成[13]。而內(nèi)酯式洛伐他汀(市售洛伐他汀化藥也為內(nèi)酯式)須經(jīng)過肝臟分泌的羥基酯酶水解成酸式結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮功效，長期服用具有一定肝損傷和肌肉損害[14]，且功效約酸式的一半[3]。因此，酸式洛伐他汀是衡量降脂紅曲安全性、有效性的核心指標(biāo)[15]。2015版中國藥典中成藥血脂康項下的紅曲原料標(biāo)準(zhǔn)中雖有TLC方法，但只能對紅曲中內(nèi)酯式洛伐他汀檢測[4]。而像福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)、湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)、湖北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)等省市地方標(biāo)準(zhǔn)大多尚無紅曲鑒別、檢測的TLC方法，依舊是以水分、灰分控制及顯微鑒別來衡量紅曲質(zhì)量[16-18]，這難以真正地控制紅曲質(zhì)量。而本研究所建立的TLC方法具有簡單、快速等特點，可用于降脂紅曲的質(zhì)量控制中。

表1 降脂紅曲中洛伐他汀含量測定(n=3)Tab.1 The content of lovastatin in lipid-lowering Hongqu(n=3)