幼年大鼠靜脈注射頭孢曲松鈉與口服鈣劑相互作用的研究

陳建華 歐小蘭 郭陽 林雪梅 周春陽 張建武

(川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，南充 637000)

頭孢曲松鈉是臨床上常用的第三代頭孢類抗生素，在兒童、老人及孕婦等特殊群體上得到廣泛應(yīng)用。其在體內(nèi)幾乎不被代謝，并以原形排出體外。其中，大部分頭孢曲松鈉經(jīng)腎臟排出體外，其余經(jīng)膽汁和腸道排泄，故在腎臟和膽汁中藥物濃度較高，根據(jù)此代謝特點(diǎn)，頭孢曲松鈉經(jīng)常用于泌尿系統(tǒng)疾病和肝膽系統(tǒng)感染性疾病的治療。與此同時，頭孢曲松鈉的不良反應(yīng)除了常見的過敏反應(yīng)，還可誘發(fā)腎臟結(jié)石[1-4]。

1986年，Schaad等[5]首次報道了注射頭孢曲松鈉能誘發(fā)可逆性泌尿系結(jié)石癥，此種結(jié)石的主要成分是頭孢曲松鈣鹽，一般直徑較小，可呈泥沙狀，形成速度快，往往呈一過性，很快從尿液中排出體外，所以被命名為“假性結(jié)石”，部分患者無明顯癥狀，臨床上容易被忽視，絕大多數(shù)患者為兒童[6-7]，大部分受結(jié)石影響的患者在保守治療后都沒有任何癥狀，有自愈傾向[7]。但如果沒有腎超聲檢查，這些無癥狀的結(jié)石將不會被發(fā)現(xiàn)。因此，頭孢曲松引起的腎結(jié)石實(shí)際發(fā)生率可能更高。由于頭孢曲松鈉是臨床上最常用的抗生素之一，因此，在某些情況下，應(yīng)注意該藥物引起的結(jié)石，以避免或預(yù)防不可避免的腎并發(fā)癥(如腎衰竭)。

靜脈注射頭孢曲松鈉與含鈣注射液不能放在同一容器里混合靜脈輸注，嚴(yán)重者會發(fā)生死亡[8]。正因如此，國家食品藥品監(jiān)督管理局(下簡稱SFDA)于2007年2月25日以國食藥監(jiān)注[2007]88號文件發(fā)出緊急通知：關(guān)于修訂頭孢曲松鈉說明書中警示語和注意事項的通知：根據(jù)頭孢曲松鈉與含鈣溶液同時使用時產(chǎn)生的安全性不良事件信息，SFDA藥品評價中心確定了配伍使用頭孢曲松鈉與含鈣溶液發(fā)生不良事件并導(dǎo)致死亡的病例，所有病例均為新生兒或嬰兒。為保證頭孢曲松鈉的安全使用，SFDA決定立即對該品說明書進(jìn)行修訂：對28d及以下的新生兒不得在使用頭孢曲松的同時靜脈給予鈣劑，不得在使用或?qū)⒁褂煤}的靜脈注射藥品時給予頭孢曲松；對大于28d的患者可以連續(xù)使用頭孢曲松和含鈣溶液，但應(yīng)在二組輸液之間使用可改性的溶液沖管。對于任何患者都不能在Y型管處同時給予頭孢曲松和含鈣注射液。因?yàn)轭^孢曲松鈉為陰離子，極易與陽離子鈣形成不溶性沉淀，屬化學(xué)配伍禁忌。

雖然頭孢曲松鈉注射液不宜與含鈣注射液直接混合已得到證實(shí)，但目前尚無靜脈注射頭孢曲松鈉與口服鈣劑相互作用的相關(guān)研究。因?yàn)閶胗變鹤陨淼纳硖攸c(diǎn)，會經(jīng)?？诜}劑，若發(fā)生感染，會使用抗生素。我們設(shè)計此課題，希望為嬰幼兒的合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)試劑

80只90～130 g左右的雄性清潔級SD大鼠，被隨機(jī)分配成8組，每組各10只。均購于川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心(許可證編號：SYXK(川)2018-076)，動物被飼養(yǎng)于動物中心，飼養(yǎng)間為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間，溫度控制為18～22℃，濕度控制在50%～60%，自由飲食水。頭孢曲松鈉用生理鹽水溶解。

CysC，β2-MG，RBP檢測試劑盒，頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)品(98%)購于上海哈靈生物科技有限公司；鈣劑為99%的CaCl2標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海邦景實(shí)業(yè)有限公司；Cr、BUN檢測由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成；HE染色由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

所有大鼠均于適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后被隨機(jī)分配成8組。分組如下：①空白對照組：尾靜脈給予生理鹽水。②鈣劑對照組：800mg/kg CaCl2灌胃。③頭孢曲松鈉+鈣劑組：分為3組大鼠，先800mg/kg CaCl2灌胃，然后尾靜脈注射分別給予600、400和200mg/kg頭孢曲松鈉，給藥1次。④頭孢曲松鈉陽性對照組：分為3組大鼠，不給鈣劑，尾靜脈分別注射600、400和200mg/kg頭孢曲松鈉。800mg/kg CaCl2的依據(jù)：有文獻(xiàn)報道給大鼠肌肉注射1000mg/kg頭孢曲松鈉，然后灌胃800mg/kg CaCl2，腎臟有明顯的結(jié)石出現(xiàn)[9]。

1.3 實(shí)驗(yàn)流程

①先給予幼年大鼠鈣劑灌胃，然后尾靜脈給予大鼠頭孢曲松鈉，模擬人使用頭孢曲松鈉與口服鈣劑聯(lián)用；②實(shí)驗(yàn)7d后，處死大鼠，檢測腎生化指標(biāo)Cr、BUN；③腎組織病理檢查腎臟的微觀形態(tài)變化；④因大鼠給藥7d后就處死，因此對腎功能影響可能只是腎功能改變的早期，因此采用ELISA檢測反映早期大鼠腎功能改變的指標(biāo)CysC、β2-MG、RBP變化。

1.4 病理切片HE染色

大鼠處死后，觀察腎臟顏色，有無腫大，取出后立即稱重，計算臟器/體重比。然后從腎盂剖開，觀察有無腎盂積水。若有積水，則對輸尿管、膀胱進(jìn)行取材，中性甲醛固定后制作快速冰凍切片及石蠟切片(HE染色)用外科顯微鏡觀察腎臟病理改變及晶體形成。重點(diǎn)觀察腎盂有無積水，腎小管有無擴(kuò)張、結(jié)晶形成，腎實(shí)質(zhì)有無炎性細(xì)胞浸潤。

1.5 ELISA檢測CysC、β2-MG、RBP

以CysC為例，其他兩個指標(biāo)類同。CysC試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中CysC水平。用純化的大鼠CysC抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入CysC，再HRP標(biāo)記的CysC抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CysC呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(A值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠CysC濃度。

1.6 統(tǒng)計方法

以上實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較用單因素方差分析，結(jié)果用(±s)表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟比重(左右腎隨機(jī)，腎臟重量與體重之比)及生化指標(biāo)方差分析。

表1～3中所有組n=10。

由表1可知，腎臟比重的單因素方差分析，F(xiàn)=1.875，P=0.138，P＞0.05，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

由表2可知，BUN 的單因素方差分析，F(xiàn)=0.979，P=0.389，P＞0.05，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。Cr的單因素方差分析，F(xiàn)=1.893，P=0.171，P＞0.05，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

由表3可知，經(jīng)單因素方差分析，與生理鹽水組相比，CysC、β2-MG、RBP指標(biāo)組間差別有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)，經(jīng)LSD法兩兩比較，CysC、β2-MG、RBP指標(biāo)在600和400mg/kg頭孢曲松鈉+鈣劑組，600mg/kg頭孢曲松鈉組間與生理鹽水組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。200mg/kg頭孢曲松鈉+鈣劑組RBP與生理鹽水組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

2.2 腎臟病理指標(biāo)分析

2.2.1 空白對照組

腎臟切面未見明顯異常，腎小球、腎小管細(xì)胞大小、形態(tài)正常，皮髓質(zhì)邊界清楚、胞漿、細(xì)胞核染色均勻、細(xì)胞核清晰，未見細(xì)胞水腫與炎性細(xì)胞。

2.2.2 鈣劑對照組

表1 所有組腎臟比重的單因素方差分析(±s)Tab.1 One-way ANOVA of renal weight ratio in all groups(±s)

表1 所有組腎臟比重的單因素方差分析(±s)Tab.1 One-way ANOVA of renal weight ratio in all groups(±s)

組別 腎臟比重 F值 顯著性高劑量頭孢曲松鈉+鈣組 0.224±0.026 1.875 0.138中劑量頭孢曲松鈉+鈣組 0.227±0.032低劑量頭孢曲松鈉+鈣組 0.228±0.033高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 0.245±0.031中劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 0.239±0.014低劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 0.233±0.035空白對照組 0.238±0.033鈣劑對照組 0.239±0.018

表2 各組腎功能生化指標(biāo)的單因素方差分析(±s)Tab.2 One-way ANOVA of renal biochemical indexes in all groups(±s)

表2 各組腎功能生化指標(biāo)的單因素方差分析(±s)Tab.2 One-way ANOVA of renal biochemical indexes in all groups(±s)

組別 BUN/(mmol/L) Cr/(μmol/L) 空白對照組 7.35±1.94 31.48±7.8鈣劑對照組 7.16±2.1 32.81±7.56高劑量頭孢曲松鈉+鈣組 7.97±1.96 34.22±6.72中劑量頭孢曲松鈉+鈣組 7.2±1.58 31.77±5.11低劑量頭孢曲松鈉+鈣組 8.3±1.57 33.03±7.76高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 8.53±2.03 35.79±5.82中劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 7.5±1.96 33.61±4.95低劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 7.83±1.79 32.58±6.67 F值 0.979 1.893 P值 0.389 0.171

表3 早期腎損傷指標(biāo)各組比較(±s)Tab.3 Comparison of early-stage renal injury indicators in different groups(±s)

表3 早期腎損傷指標(biāo)各組比較(±s)Tab.3 Comparison of early-stage renal injury indicators in different groups(±s)

"△"：表示與空白對照組相比，P＜0.05；“*"：表示與鈣劑對照組相比，P＜0.05。經(jīng)單因素方差分析的LSD法兩兩比較，高、中劑量頭孢曲松鈉+鈣劑組，高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組的CysC、β2-MG、RBP指標(biāo)分別與空白對照組、鈣劑對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05△*)。低劑量頭孢曲松鈉+鈣劑組RBP與空白對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05△)。

組別 CysC/(mg/L) β2-MG/(mg/L) RBP/(mg/L)空白對照組 0.82±0.23 1.83±0.76 37.25±8.09鈣劑對照組 0.96±0.35 1.53±0.29 45.12±9.68高劑量頭孢曲松鈉+鈣組 1.75±0.41*△ 3.25±0.76*△ 83.65±17.86*△中劑量頭孢曲松鈉+鈣組 1.39±0.60*△ 2.67±0.51*△ 76.37±22.97*△低劑量頭孢曲松鈉+鈣組 1.01±0.58 2.01±0.98 70.46±15.91△高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 1.52±0.43*△ 2.85±0.96*△ 73.57±14.53*△中劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 0.77±0.61 1.77±1.05 61.60±15.89低劑量頭孢曲松鈉陽性對照組 0.68±0.55 1.06±0.63 68.56±17.72 F值 5.786 4.951 7.352 P值 0.01 0.03 0.001

腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。

2.2.3 高劑量頭孢曲松鈉+鈣組

腎臟切面未見明顯異常，鏡下腎小球充血，腎小管多灶性凝固性壞死，遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞水腫，部分大鼠的腎小管有鈣鹽結(jié)晶，腎盂周圍有較多淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2.4 中劑量頭孢曲松鈉+鈣組

腎小球充血，腎小管呈局灶性凝固性壞死，近曲小管上皮細(xì)胞水腫，間質(zhì)有少量淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2.5 低劑量頭孢曲松鈉+鈣組

圖1 腎臟HE染色Fig.1 kidney stained with HE

腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。

2.2.6 高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組

腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯變化，腎小管上皮水腫，間質(zhì)有少量淋巴細(xì)胞浸潤。有一只大鼠的腎小管有鈣鹽結(jié)晶。

2.2.7 中劑量頭孢曲松鈉陽性對照組

有一只大鼠的遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞水腫，其余大鼠無異常。

2.2.8 低劑量頭孢曲松鈉陽性對照組

腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。

3 討論

靜脈注射頭孢曲松鈉與含鈣注射液不能放在同一容器里混合靜脈輸注，嚴(yán)重者會發(fā)生死亡[8]。因?yàn)閶胗變鹤陨淼纳硖攸c(diǎn)，會經(jīng)常口服鈣劑，若發(fā)生感染，會使用抗生素。本文希望通過此項研究，能為嬰幼兒的合理用藥提供依據(jù)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，頭孢曲松鈉與口服鈣劑聯(lián)用，可對腎臟造成一定的病理損害，但因?yàn)槟I臟有強(qiáng)大的代償能力，且只給藥7d，所以對腎功能生化指標(biāo)Cr、BUN無明顯影響，部分大鼠肉眼可看到泥沙樣結(jié)石。為探討對早期腎功能是否有損害，我們使用了反映大鼠早期腎功能的指標(biāo)CysC、β2-MG、RBP[1]，結(jié)果顯示：高、中劑量頭孢曲松鈉+鈣組，高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組與空白對照組、鈣劑對照組相比，CysC、β2-MG、RBP差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，低劑量頭孢曲松鈉+鈣組RBP與空白對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。高劑量頭孢曲松鈉+鈣劑組和高劑量頭孢曲松鈉陽性對照組相比，各指標(biāo)差別無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。說明兩者聯(lián)用對腎臟可造成輕微損害，而單用頭孢曲松鈉600mg/kg也會造成早期腎功能損害。但聯(lián)用鈣劑的頭孢曲松組造成腎臟損害的劑量要低于單用的劑量。所以藥物濃度是一個很重要的原因，而加入鈣劑更容易發(fā)生腎臟損害。故兩者聯(lián)用對腎臟具有協(xié)同作用，大劑量使用頭孢曲松鈉，是腎結(jié)石的危險因素之一，這和文獻(xiàn)報道一致[10]。從腎臟病理HE染色圖1d結(jié)果可以看出，集合管下有結(jié)晶形成。

頭孢曲松鈉與鈣產(chǎn)生相互作用的機(jī)理還不是太不清楚。有一種假說認(rèn)為頭孢曲松鈉結(jié)晶與腎小管細(xì)胞間有高的表面黏附力。原因可能是大劑量頭孢曲松鈉給藥(導(dǎo)致尿中頭孢曲松鈉含量增加)和任何原因引起的尿潴留如炎癥引起黏附分子表達(dá)(導(dǎo)致頭孢曲松晶體在尿路中滯留，允許晶體生長和聚集)，目前黏附的機(jī)理還不清楚，一種可能性是頭孢曲松/鈣晶體可通過離子作用和/或氫鍵黏附在細(xì)胞表面，類似于其他含鈣晶體(如草酸鈣、磷酸鈣)[11]。另一種可能是MDCK細(xì)胞表面可能存在一些(未知的)頭孢曲松晶體受體。但因?yàn)槭羌僬f，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，頭孢曲松鈉為陰離子，極易與陽離子鈣形成不溶性沉淀[12]，都可能促進(jìn)頭孢曲松結(jié)石的形成。

本研究因?yàn)闂l件所限，未進(jìn)行尿鈣檢測，機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)只是在動物身上證實(shí)兩者聯(lián)用能引起腎臟的早期損害，但尚未進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證實(shí)。

致謝：向川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科、形態(tài)學(xué)研究所和病理科提供的幫助給予感謝！