響應(yīng)面法優(yōu)化暴馬丁香枝條中紫丁香苷提取工藝

邢 躍,李 雯,呂世存,李春娥,秦佳梅

(1.通化師范學(xué)院,通化134002；2.通化長(zhǎng)白山藥谷集團(tuán)股份有限公司,通化134001）

暴馬丁香是木犀科落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于中國(guó)，廣泛分布于東北、西北、華北等地,朝鮮、日本、俄羅斯等國(guó)家也有分布[1]。以干皮入藥稱暴馬子皮，含多種化學(xué)成分，其中紫丁香苷為暴馬子皮的指標(biāo)性成分[2]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[3]、保肝[4]、抗炎[5]、降血壓[6]、提高耐受能力[7]等藥理活性，廣泛用于藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。隨著其市場(chǎng)的需求量逐年增大，樹皮的大量剝?nèi)?，?dǎo)致暴馬丁香樹大量死亡，暴馬丁香野生資源遭到嚴(yán)重破壞。為充分開發(fā)利用暴馬丁香資源，本實(shí)驗(yàn)以暴馬丁香枝條為供試材料，采用響應(yīng)面法[8]優(yōu)化暴馬丁香枝條中紫丁香苷的超聲提取條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018年春采自吉林省白山市臨江區(qū)、經(jīng)通化師范學(xué)院植物教研室秦佳梅教授鑒定的暴馬丁香[Syringa reticulata(Bl.)Hara var.amurensis(Maxim.)Hara]的枝條。剪成1～3cm小段，裝入尼龍紗袋中晾曬，用FZ102型植物粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱量5mg紫丁香苷的標(biāo)準(zhǔn)品（江蘇永健醫(yī)藥公司96.9%，純度HPLC≥98）放置于50mL容量瓶中，加水定容得到濃度為100μg/mL的紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放置于5個(gè)50mL容量瓶中[9]，以純凈水定容并搖勻，稀釋100倍，使用UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)，在265nm[9]波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值，繪制紫丁香苷濃度與吸光度值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分析得到回歸方程。

1.2.2 紫丁香苷含量測(cè)定

精確稱取供試材料1g，以純化水為溶劑配制成不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，量取一定體積并浸泡1h,在不同功率下超聲（KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器）提取一定時(shí)間，將提取液在轉(zhuǎn)速為12000r/min的TGL-20bR高速冷凍離心機(jī)中離心25min，精密移取1mL上清液稀釋100倍后，用紫外分光光度計(jì)在265nm波長(zhǎng)下測(cè)定提取物的吸光度，并按下列方式計(jì)算含量：

含量（mg/g）=c×100×L/m×1000

式中：c為稀釋后提取液中紫丁香苷的質(zhì)量濃度，單位為μg/mL；

100為溶液稀釋的倍數(shù)；

L為溶液定容的體積，單位為mL；

m為暴馬丁香粗粉的質(zhì)量，單位為g。

1.3 超聲波提取暴馬丁香中紫丁香苷單因素實(shí)驗(yàn)

通過參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[10],選取超聲波提取法中對(duì)于紫丁香苷提取量有顯著影響的4個(gè)要素因子,即料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間，研究各要素因子對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取率的影響。

1.3.1 料液比對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取的影響

按照1.2.2方法，設(shè)置乙醇濃度為45%、超聲功率為 180W，超聲時(shí)間為 45min，考察料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL）對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取率的影響。

1.3.2 乙醇濃度對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取的影響

在1.3.1考察料液比的基礎(chǔ)上，設(shè)置超聲功率180 W，超聲時(shí)間為45 min，考察乙醇濃度 （15%、30%、45%、60%、75%）對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取率的影響。

1.3.3 超聲波功率對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取的影響

在1.3.1、1.3.2考察料液比和乙醇濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)置超聲時(shí)間為 45 min，考察超聲功率（120、150、180、210、240W）對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取率的影響。

1.3.4 超聲波時(shí)間對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取的影響

在上述考察優(yōu)化料液比、乙醇濃度和超聲功率的基礎(chǔ)上，考察超聲時(shí)間（30、45、60、75、90min）對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)暴馬丁香中紫丁香苷的多因素實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Design ExpertV8.0軟件Box-Behnken響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)[11]，以乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間為自變量，紫丁香苷提取率為響應(yīng)值判定最佳工藝條件,詳見表1。

表1 紫丁香苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用Excel對(duì)紫丁香苷濃度和吸光度值進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)線性方程為Y=0.0457X+0.0133（R2=0.9993），表明紫丁香苷濃度在5μg/mL～25μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷提取的影響

圖1 紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 料液比對(duì)紫丁香苷提取率的影響折線圖

圖3乙醇濃度對(duì)紫丁香苷提取率的影響折線圖

圖2 示暴馬丁香中紫丁香苷提取率隨著料液比的增大，呈現(xiàn)先增加后下降最后趨于平緩趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，暴馬丁香中紫丁香苷提取率最高達(dá)2.08mg/g。這是因?yàn)殡S著溶劑的增多,暴馬丁香粗粉與溶劑之間能充分接觸,有利于紫丁香苷溶解于溶劑中，但當(dāng)溶劑過多時(shí)導(dǎo)致物料吸附提取物能力增大，不利于待提取物的提取[12]。因此選擇料液比 1∶20(g∶mL)作為提取暴馬丁香紫丁香苷的條件。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)紫丁香苷提取率的影響

圖3表明暴馬丁香中紫丁香苷提取率隨著乙醇濃度的增大，呈現(xiàn)先增加后緩慢下降趨勢(shì)。乙醇濃度較低時(shí)的變化當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，暴馬丁香中紫丁香苷提取率最高達(dá)2.07mg/g。這是因?yàn)檐疹愂菢O性物質(zhì),易溶于水等極性溶劑中，紫丁香苷極性較高,更易溶解于水中。因此在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高的情況下,其提取率較低;因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)45%～75%為進(jìn)一步考察優(yōu)化范圍。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)紫丁香苷提取率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)紫丁香苷提取率的影響折線圖

圖5 超聲功率對(duì)紫丁香苷提取率的影響折線圖

由圖4可知，暴馬丁香中紫丁香苷得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為60min時(shí)，暴馬丁香中紫丁香苷提取率最高達(dá)2.253mg/g。這是由于提取時(shí)間增加，提取物溶解到溶劑的總量在不斷增多，60min時(shí),紫丁香苷已基本溶出,但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致部分提取物發(fā)生氧化、結(jié)構(gòu)被破壞等物理化學(xué)現(xiàn)象[13]，使得最后的提取率減小。因此選擇提取時(shí)間45～75min為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

2.2.4 超聲功率對(duì)紫丁香苷提取率的影響

由圖5可知，暴馬丁香中紫丁香苷提取率隨著超聲功率的增大呈現(xiàn)先增加后緩慢下降趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率為180W時(shí)，暴馬丁香中紫丁香苷提取率最高達(dá)2.269mg/g。

這是由于功率較低時(shí),不足以使物料充分受到超聲波的作用。功率為180 W時(shí),紫丁香苷提取率最大,繼續(xù)增大提取功率,對(duì)紫丁香苷具有破壞作用,為了進(jìn)一步明確超聲功率對(duì)暴馬丁香中紫丁香苷的影響,選取超聲功率在120～240 W之間進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)暴馬丁香中紫丁香苷的多因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-ExpertV 8.0軟件中Box-Behnken響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)具體設(shè)置17個(gè)實(shí)驗(yàn)，中心實(shí)驗(yàn)5個(gè)，用以分析實(shí)驗(yàn)誤差。析因?qū)嶒?yàn)12個(gè)。選取乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲功率(C)作為自變量,提取率作為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析，詳見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 回歸方程及方差分析

以暴馬丁香中紫丁香苷得率(Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合，各影響因子與響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=2.32+0.017A+0.014B-0.054C-6.000E-033AB+4.000E-033AC-0.021BC-0.13A2-0.093B2-0.0948C2

為檢驗(yàn)所得方程是否有效，對(duì)擬合結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。通過分析結(jié)果可知，該擬合模型顯著性較高，失擬項(xiàng)是用來評(píng)估方程可靠性的一個(gè)重要數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示失擬項(xiàng)P=0.7790＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著,表明方程擬合的比較好，可以很好地描述各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。利用該方程可確定暴馬丁香中紫丁香苷的最佳提取條件。影響大小的順序是超聲功率＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間。回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9431，進(jìn)一步說明可以利用該模型來確定紫丁香苷超聲提取的最佳提取工藝。

表3 回歸方程的方差分析

2.3.3 響應(yīng)面法分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，提取暴馬丁香枝條中紫丁香苷最佳條件為：乙醇濃度60.93%、超聲功率為162.05 W、超聲時(shí)間為61.57 min，該條件下紫丁香苷提取率為2.3259 mg/g。

為考察不同因素之間的交互作用，固定一個(gè)變量，將其他2個(gè)變量與紫丁香苷提取率的方程模型擬合為三維空間曲面圖，結(jié)果見圖4～6。

圖4 乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)紫丁香苷提取率影響的響應(yīng)面

圖5 乙醇濃度和超聲功率對(duì)紫丁香苷提取率影響的響應(yīng)面

圖6 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)紫丁香苷提取率影響的響應(yīng)圖

3 討論

關(guān)于紫丁香苷的研究工藝大多實(shí)驗(yàn)材料為刺五加[14]，且多為正交設(shè)計(jì)法[12]，這類方法多為線性模型的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),雖然實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)據(jù)易處理,但準(zhǔn)確性不高[15]。以暴馬丁香為實(shí)驗(yàn)材料的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法，利用回歸方程將多個(gè)因子實(shí)驗(yàn)中因素之間的相互作用關(guān)系用多項(xiàng)式擬合,然后研究函數(shù)的響應(yīng)面和等高線,分析因素與響應(yīng)面之間、兩個(gè)因素之間的交互關(guān)系。較好的處理離散的水平值及因素的交互作用，可更為精確的找到各因素間的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)化，且周期短、精度高[16]。

本實(shí)驗(yàn)考察液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間等因素對(duì)紫丁香苷提取率的影響，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間三因素進(jìn)行交互優(yōu)化分析，得到最佳提取工藝為：料液比1∶20，乙醇濃度60.93%,超聲功率162.05W,超聲時(shí)間 61.57min,該條件下紫丁香苷提取率為2.3259mg/g。