鹿茸多肽對冠脈結(jié)扎心肌缺血模型大鼠心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C表達(dá)的影響

周 佳 ，徐 巖 ，律廣富 ，韓 冬 ，趙昕彤 ，王晉冀 ，王亞杰 ，王 宇 ，黃曉巍 ,2

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117；2.吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130117）

近年來，隨著生活節(jié)奏的提速，生活水平的提高，由于人們飲食結(jié)構(gòu)不合理、生活習(xí)慣不規(guī)律等因素導(dǎo)致的心腦血管疾病患病幾率連年上升[1]。冠狀動脈粥樣硬化引起的缺血性心臟病嚴(yán)重威脅了人類的身心健康。心臟依賴血液的灌注來維持正常的生理活動，當(dāng)血液的灌注減少或停止時，會導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧、心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌功能異常甚至死亡。鹿茸作為我國傳統(tǒng)滋補(bǔ)類中藥，在保護(hù)心肌損傷、促進(jìn)骨折愈合、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、改善記憶力等多方面具有良好的效果[2]?！侗静萁?jīng)疏》記載鹿茸入心包，入心經(jīng)；現(xiàn)代研究表明，鹿茸是哺乳動物中唯一可以完全再生的器官，可用于改善心臟功能；已有研究表明，鹿茸多肽可明顯緩解阿霉素所致的大鼠心肌損傷[3]。目前鹿茸多肽對冠脈結(jié)扎所致大鼠心肌缺血損傷研究較少。本實(shí)驗(yàn)從鹿茸多肽影響心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子NK型同源盒基因轉(zhuǎn)錄因子2.5(NKx2.5)、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子4（GATA4）、激活轉(zhuǎn)錄因子 2（ATF-2）、肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子-2C(MEF-2C)表達(dá)水平的角度出發(fā)，對鹿茸多肽預(yù)防和治療冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖正常的Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（270±20）g，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2016-0003。常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

鹿茸多肽：長春中醫(yī)藥大學(xué)提供；輔酶Q10膠囊：海上藥信誼藥廠有限公司 （國藥準(zhǔn)字H19999132）；Nkx 2.5Elisa kit：上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號：ml2227618）；GATA4、ATF-2、MEF-2CElisa kit：酶免生物科技有限公司 （MM-20697R1、MM-0837R1、MM-0834R1）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0105。

2 儀器

大鼠固定器、ML870PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)、Multiskan FC酶標(biāo)儀、生物組織自動脫水機(jī)、生物組織自動包埋機(jī)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動物分組及給藥

隨機(jī)將大鼠分成6組，即假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。假手術(shù)組、模型組給予等體積蒸餾水，陽性對照組給予輔酶Q10膠囊3mg·kg-1，鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠分別給予鹿茸多肽 300、200、100mg·kg-1。 實(shí)驗(yàn)動物自由飲食飲水，連續(xù)給藥28d。

3.2 模型復(fù)制

參照文獻(xiàn)[4]，大鼠稱重后，腹腔注射水合氯醛麻醉后結(jié)扎心臟左冠狀動脈前降支，對比大鼠術(shù)前術(shù)后心電圖，符合典型心梗表現(xiàn)者視為手術(shù)成功，存活者列入模型組、給藥組。假手術(shù)組僅開胸，不結(jié)扎冠狀動脈[5]。

3.3 檢測指標(biāo)

3.3.1 心電檢測[6]

末次給藥30min后，乙醚麻醉大鼠，固定于大鼠固定器上，連接八通道生物信號采集處理系統(tǒng)，記錄2min內(nèi)的大鼠心電圖和心率，心電圖基線設(shè)為PR段，比較各組心電圖ST段的變化和心率變化。

3.3.2 Elisa法檢測各組大鼠血清中 Nkx2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量

檢測心電30min后，4%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，腹主動脈取血[7]，靜置 20min，3 500r·min-1離心15 min，取血清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中Nkx2.5、GATA4、ATF-2和 MEF-2C 的含量。

3.3.3 HE染色觀察大鼠心肌組織損傷情況

將固定后的心肌組織脫水、石蠟包埋，切成5μm薄片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化[8]。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均采用表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準(zhǔn)P=0.05。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化

與假手術(shù)組比較，模型組心率明顯上升、ST段明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化（x±s）

4.2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），其中鹿茸多肽低劑量組與陽性對照組比較，血清中Nkx 2.5和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，各組大鼠血清中ATF-2含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表 2。

表2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C 含量變化（x±s）（ng/L）

4.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，紅色部分心肌組織排列整齊，細(xì)胞核大小、形態(tài)無明顯差別，清晰可見，心肌細(xì)胞間隙均勻，無炎性細(xì)胞浸潤。與假手術(shù)組比較，模型組組織壞死比例較高，心肌纖維排列紊亂并有溶解斷裂，核細(xì)胞深染，可見明顯炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生明顯。隨著鹿茸多肽給藥劑量的增加，心肌細(xì)胞溶解減輕，心肌纖維排列較為整齊，細(xì)胞間隙變小，炎性細(xì)胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色結(jié)果（×200）

5 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)[9]，我國14億人口中約有2.9億人患有心血管疾病，城鄉(xiāng)居民死亡原因中，有40%以上是由于心血管病死亡，高于腫瘤等其他疾病。防治心血管病已經(jīng)成為中國目前重大的公共衛(wèi)生問題，對心血管疾病的防治迫在眉睫[10]。

在探討藥物在治療心肌梗死的療效及作用機(jī)制中，復(fù)制相對精準(zhǔn)的心肌梗死動物模型至關(guān)重要，本研究采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法復(fù)制心肌缺血的發(fā)生發(fā)展，可以保證梗死部位相對固定，在盡量避免個體差異的同時，提高模型動物的成活率，并最大限度地模擬臨床上心肌梗死的病理過程[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對比假手術(shù)組和模型組，大鼠心率和心電圖ST段的變化符合心肌缺血造模的各項(xiàng)指標(biāo)，表明實(shí)驗(yàn)造模成功[12]。

《神農(nóng)本草經(jīng)》中將鹿茸列為中品，中醫(yī)使用鹿茸防治各類疾病已有兩千余年的歷史[13]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿茸中含有多種有效成分，其中多肽、蛋白質(zhì)在鹿茸的藥用中占有重要的地位[14]。已有研究證實(shí)，鹿茸多肽能夠有效減少心肌梗死面積，使缺血區(qū)域血管收縮程度減輕，改善血液循環(huán)，從而減少心肌梗死后缺血缺氧對心肌細(xì)胞的損傷[15～16]。 Nkx2.5，GATA4，ATF-2，MEF-2C是心臟在早期發(fā)育過程中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[17]，起到調(diào)控心臟結(jié)構(gòu)蛋白基因表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞分化方向的作用，在心臟的發(fā)育過程中起著重要作用[18]。其中，Nkx2.5在環(huán)化、分化、間隔功能成熟、維持傳導(dǎo)系統(tǒng)等過程中參與了心臟的形成[19]；GATA4在心肌存活和心臟肥大中起重要作用；ATF-2、MEF-2C可以在自身維持、損傷修復(fù)等方面調(diào)控心臟特異性調(diào)控蛋白。

本研究以鹿茸多肽為研究對象，觀察其對冠脈結(jié)扎大鼠心肌損傷的修復(fù)作用。結(jié)果表明，鹿茸多肽可明顯保護(hù)冠脈結(jié)扎大鼠的心肌損傷，恢復(fù)心率，調(diào)整ST段上調(diào)幅度，其作用機(jī)制可能與提高Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C的水平有關(guān)，而ATF-2無明顯變化。