無細胞合成生物學：革新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新策略

劉瑩瑩，卜寧，盧元

生物工程與大健康

盧元 清華大學化學工程系助理教授、博士生導師。課題組研究的焦點在于發(fā)展和應用前沿合成生物學技術，結合多學科交叉手段，突破天然生命體系的限制，高效合成和精準改造復雜蛋白質(zhì)、非天然蛋白質(zhì)等生物大分子，以解決生物制造、人類健康等領域最具挑戰(zhàn)性的科學與工程難題。目前已在等雜志上發(fā)表50多篇高影響學術論文，擁有5項國際授權專利、12項國內(nèi)授權專利。研究成果得到了相關領域國內(nèi)國際同行專家的廣泛關注和高度評價。更多信息請瀏覽課題組網(wǎng)站：http://LuLab.org。

無細胞合成生物學：革新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新策略

劉瑩瑩1,2，卜寧1，盧元2

1 沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034 2 清華大學 化學工程系，北京 100084

無細胞合成生物系統(tǒng)，能夠在體外完成生命轉(zhuǎn)錄翻譯過程，因體系靈活開放、便于控制、表達周期短、高耐受性等特點，可表達細胞系統(tǒng)難以表達的蛋白質(zhì)。隨著無細胞生物傳感和體系凍干技術的不斷發(fā)展，其在醫(yī)藥健康領域的應用不斷拓展。本文綜述了無細胞合成生物學在按需生物醫(yī)藥合成和便攜式醫(yī)療檢測等醫(yī)藥健康領域的研究進展，該體系的進一步發(fā)展有潛力實現(xiàn)更復雜后修飾蛋白質(zhì)藥物的合成、可豐富無細胞生物傳感器類型并提高其靈敏性。無細胞合成生物學作為新興工程策略，未來必將更好地應用于高通量醫(yī)藥蛋白質(zhì)篩選、新型病原體的檢測等醫(yī)藥健康領域。

無細胞合成生物學，醫(yī)藥蛋白質(zhì)，便攜式檢測，無細胞生物傳感器

疾病嚴重威脅人類的健康和生存，也是阻礙社會經(jīng)濟發(fā)展的重要原因之一，因此能夠快速準確地診斷和治療疾病，對人類健康尤為重要。威脅人類生存的幾種重大疾病比如癌癥和腫瘤發(fā)病率逐年遞增并且向著年輕化發(fā)展[1]，其診斷和治療是研究人員一直未能攻克的難題。以手術和放化療為主的傳統(tǒng)療法雖然正隨著生物技術的發(fā)展而進步，但依然有很大的副作用，迫切需要研究者們在治療手段方面有所創(chuàng)新和突破。另外近年來，全球生態(tài)環(huán)境不斷變化，全球蚊媒病毒病呈上升趨勢[2]，許多病毒性、細菌性和寄生蟲感染疾病在臨床上難以區(qū)別，對其早期的確診在醫(yī)療上具有重大的防控意義。飛速發(fā)展的現(xiàn)代醫(yī)學雖能夠控制某些傳染病的傳播，但是大多數(shù)情況下，很多傳染病依然潛伏在人們身邊，特別是貧窮地區(qū)和體弱人群易受感染[3]。這就迫切需要人們將疾病治療推廣到貧困地區(qū)并且研究更快速有效的檢測和治療方法來幫助人類克服這些重大疾病。

為了更好地克服這些疾病帶來的危害，近幾年來，蛋白質(zhì)、多肽類藥物[4]憑借極高的靶向特異性、高活性和低毒性的特點，在臨床上的應用越來越廣泛。有許多銷售額排名靠前的藥物都是蛋白質(zhì)藥物，如曲妥珠單抗[5]、阿達木單抗[6]、甘精胰島 素[7]和肺炎球菌13價結合疫苗[8]等。目前，研究者們利用哺乳動物細胞制備蛋白質(zhì)藥物取得了很大進展，并且隨著生物技術與合成生物學的快速發(fā)展，許多基因工程藥物和重組藥物被合成，許多新藥被發(fā)現(xiàn)，豐富了蛋白質(zhì)藥物的種類并提高了疾病治愈的幾率。但是目前蛋白質(zhì)藥物70%都是由中國倉鼠卵巢細胞CHO生產(chǎn)[9]，細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)藥物生長周期長導致篩選過程慢，甚至有些蛋白質(zhì)藥物由于對宿主細胞有毒性作用[10]，無法在細胞內(nèi)產(chǎn)生，還有一些蛋白質(zhì)藥物在偏遠地區(qū)和環(huán)境惡劣缺少資源的地區(qū)無法合成，在運輸過程中也存在失活現(xiàn)象。因此，解決細胞毒性、快速生產(chǎn)并且穩(wěn)定運輸是蛋白質(zhì)藥物研究的重點。

早期傳染病病原體診斷方法正在不斷進步，隨著生物技術的不斷發(fā)展，基于生物傳感器的檢測手段成為主流趨勢，特別是即時檢驗 (Point of care testing，POCT)[11]診斷技術，因特異性強、靈敏度高等特點得到快速發(fā)展。其生物敏感元件通常包括生物分子酶、抗原、抗體等，細胞、細胞器或組織等。主要的生物傳感器類型有酶催化法、酶聯(lián)免疫法、全細胞傳感器、金屬納米顆粒傳感器和微流控生物芯片傳感器等?，F(xiàn)有這些傳感器雖然反應快速，靈敏度高，但是仍然存在一些缺點，如酶的穩(wěn)定性低、全細胞生物傳感器的生物安全問題、納米材料和微流控傳感器制作成本高且相對復雜 等[12-13]。這就需要探索出穩(wěn)定性高、相對簡單并且能夠解決生物安全問題的新型檢測生物傳感器。

為了解決上述目前疾病檢測和治療手段存在的問題，在蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)和體外檢測領域需要突破活細胞的限制，以便更靈活便捷地生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物和進行體外檢測。因此，有研究者開始使用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (Cell-free protein synthesis，CFPS)[14]進行蛋白質(zhì)藥物合成和基于無細胞體系的生物傳感器的研究。CFPS是以mRNA或DNA為模板，利用細胞提取物中的底物和能源物質(zhì)，在體外完成蛋白質(zhì)合成翻譯及后修飾過程。CFPS體系開放、便于控制表達過程、較短的表達周期，并且可耐受細胞毒性和表達細胞難表達蛋白質(zhì)[14]。近年來，隨著凍干技術的發(fā)展，凍干無細胞體系可以維持其活性長達一年之久，而且儲存的無細胞試劑可以在不到兩周的時間內(nèi)生產(chǎn)出高滴度的疫苗。另外，基于無細胞體系的生物傳感器[15]也憑借體系的靈活開放，可以實現(xiàn)低成本、高靈敏度、低消耗的快速體外診斷。本文綜述了無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)近幾年來在醫(yī)藥蛋白質(zhì)、醫(yī)藥健康方面的研究進展與應用。并進一步展望了該技術存在的重大挑戰(zhàn)和未來的重要發(fā)展方向。

1 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)

1.1 無細胞體系概述

CFPS通過利用微生物、動物、植物細胞的提取物并補充底物和能量，以外源mRNA或者DNA為模板，在體外完成轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、后修飾和能量代謝過程，如圖1所示。隨著CFPS體系的發(fā)展，CFPS已經(jīng)解決了膜蛋白、非天然蛋白質(zhì)、抗體片段、類病毒顆粒的表達問題和紙上檢測的問題。無細胞技術發(fā)展始于1907年，德國化學家Eduard Buchner使用破碎后的酵母細胞進行酒精發(fā)酵，從而發(fā)現(xiàn)了酒精發(fā)酵中底物酶系作用，證實了無需活細胞仍然可以發(fā)生生物反應[16]。1961年美國生物學家Heinrich Matthaei和Marshall Warren Nirenberg利用大腸桿菌無細胞體系，將只含有尿嘧啶的mRNA成功翻譯出一條只有苯丙氨酸的多肽，并首次發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)翻譯時三聯(lián)密碼子UUU對應苯丙氨酸。自此，CFPS技術得到快速發(fā)展。

目前，在直接控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的基礎上，研究者們構建和發(fā)展了兩種主要類型的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。一種是基于提取物的系統(tǒng)；另一種是純化后的體系。理論上，任何生物體都可以作為無細胞體系中細胞提取物的來源, 但最常見的細胞提取物來源是大腸桿菌、小麥胚芽、酵母細胞[17]、兔網(wǎng)織紅細胞和昆蟲細胞等。隨著研究者的不斷探索，近年來一些其他來源的提取物也開始被研究，包括鏈霉菌屬物種[18]、弧菌[19]、枯草芽孢桿菌[20]、醋酸桿菌[21]、中國倉鼠卵巢細胞CHO[22]和哺乳動物細胞[23-24]等。常用原核生物提取物來自大腸桿菌，因為大腸桿菌易培養(yǎng)、成本低、蛋白質(zhì)表達量高[25]。但是由于原核體系的折疊和翻譯機制，大腸桿菌無細胞系統(tǒng)仍然有其固有的局限性。而真核無細胞體系，對真核蛋白的翻譯后修飾和正確折疊等方面占據(jù)優(yōu)勢。如酵母細胞提取物在創(chuàng)建功能性糖基化蛋白質(zhì)方面取得了進展[26]。此外，小麥胚芽無細胞體系還能夠構建在生物科學和醫(yī)學領域具有巨大的潛力的蛋白質(zhì)微陣列[27-28]。另一種純化后的體系包括從大腸桿菌中純化的一系列翻譯組分，包括起始因子、延伸因子(Elongation factors，EFs)、釋放因子(Release factors，RFs)、核糖體回收因子、20個氨酰-tRNA合成酶(Aminoacyl tRNA synthetase，aaRS)、蛋氨酸-tRNA轉(zhuǎn)化酶、核糖體等。如Shimizu等開發(fā)了一個由36種參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的酶組成，以及高度純化的核糖體的完全重組的無細胞系統(tǒng)，稱為PURE體系[29]。因此，PURE體系的蛋白質(zhì)合成反應完全缺乏蛋白酶和核酸酶，減少了表達模板等DNA元件的損失，是研究生物學的一個非常強大和基礎的研究工具。然而，由于PURE體系的成本高，因此以粗提物為基礎的CFPS仍然是研究的首選。

圖1 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)

為了進行DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，除了細胞粗提物外，系統(tǒng)還需要補充其他基本成分，包括DNA模板、RNA聚合酶、提供能量的底物、氨基酸、核苷三磷酸鹽(Nucleoside triphosphate，NTPs)、tRNAs、輔因子和鹽等。能夠激活細胞提取物中促進蛋白質(zhì)合成的通路是CFPS研究的關鍵。目前，許多研究都集中在刺激中樞代謝以促進高水平CFPS，而不是由磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP) 或類似化合物驅(qū)動的昂貴的一步磷酸化反應。Calhoun等證明葡萄糖可以促進蛋白質(zhì)合成[30-31]，并且他們還利用單磷酸核苷(Nucleoside monophosphate，NMPs) 取代核苷三磷酸(NTPs)，在保持高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的同時，進一步降低了能源成本[30,32]。還有研究人員利用聚合碳水化合物，如麥芽糊精[33]和可溶性淀粉或糖原[34]作為能量底物以降低能源成本。

另外，體系中的基因模板是影響無細胞系統(tǒng)中的穩(wěn)定性和限制表達效率的關鍵因素。傳統(tǒng)無細胞體系使用質(zhì)粒作為基因表達模板，系統(tǒng)較穩(wěn)定，但是存在制作質(zhì)粒耗時較長，不能用于高通量蛋白表達等問題。所以近年來，以線性PCR產(chǎn)物直接作為表達模板得到了研究者的青睞，有研究者以單克隆抗體的線性PCR產(chǎn)物通過無細胞體系合成單克隆抗體[35]。但由于線性表達模板較質(zhì)粒相比更加脆弱，易被細胞提取物中的核酸酶降解，于是Wu等利用特殊引物將線性片段制作成了類似于質(zhì)粒的環(huán)狀DNA分子，從而提高目的基因模板抵御核酸外切酶的能力[36]。還有研究者以細胞提取物為研究對象提高體系穩(wěn)定性，Ahn等對體系中mRNA結構進行改造，使之更穩(wěn)定，并且利用敲除了編碼核酸內(nèi)切酶E基因的菌株制備細胞提取物，提高了基于PCR產(chǎn)物的CFPS的生產(chǎn)力，為高通量蛋白質(zhì)生產(chǎn)提供更便捷的可能[37]。

除了CFPS體系內(nèi)物質(zhì)對它的限制，在反應過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的積累，也可能對CFPS產(chǎn)生限制。Spirin等在大腸桿菌和真核無細胞系統(tǒng)中引入了連續(xù)無細胞蛋白質(zhì)合成的概念[38]，使用連續(xù)交換或雙層系統(tǒng)，因為被動擴散可以補充底物和去除副產(chǎn)物。連續(xù)補加大大延長了CFPS反應時間并提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量[39]。

1.2 無細胞體系的優(yōu)勢

近幾年來，無細胞合成體系經(jīng)過優(yōu)化得到了快速發(fā)展。CFPS在以下幾個方面具有重要優(yōu)勢。1) 體系開放，可以耐受細胞毒性蛋白質(zhì)；可產(chǎn)生難表達蛋白質(zhì)，如具有細胞毒性的硒代蛋氨酸[40]和膜蛋白[41]等。2) 反應迅速，且真核CFPS體系有豐富的蛋白質(zhì)翻譯后修飾能力；有研究組可以在24 h內(nèi)就可以分別利用真核和原核的CFPS系統(tǒng)產(chǎn)生重組人紅細胞生成素 (Recombinant human erythropoietin rhEPO) 和重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (Recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor，rhGMCSF)[42]。3) 便于調(diào)控反應過程[14]，利于非天然氨基酸與蛋白質(zhì)的位點特異性結合，實現(xiàn)非天然蛋白質(zhì)的合成[43]。4) 基于CFPS的生物傳感器操作簡便，能夠解決生物安全性問題，產(chǎn)生豐富類型的傳感器。5) 結合凍干技術的紙上CFPS可以實現(xiàn)反應的便攜式，打破冷鏈運輸問題；儲存的無細胞試劑可以快速生產(chǎn)出高滴度的疫苗，例如，用于癌癥治療的活性核糖核酸酶onconase也可以通過凍干CFPS系統(tǒng)生產(chǎn)[44]。因為這些優(yōu)勢，CFPS在表達重組蛋白質(zhì)藥物、后修飾藥物、非天然蛋白質(zhì)藥物、便攜式生物傳感器以及體外診斷等表現(xiàn)出巨大應用潛力。

2 無細胞體系在醫(yī)藥健康領域的應用

2.1 無細胞體系合成醫(yī)藥蛋白

2.1.1 疫苗

接種疫苗被認為是預防傳染性疾病最有效的的手段。通過接種有效的疫苗，已經(jīng)消滅了天花、牛瘟等重要人和動物傳染病。目前用于人類疾病防治的疫苗根據(jù)技術特點可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗[45]。傳統(tǒng)疫苗具有安全高效和免疫譜廣的特點，主要包括減毒活疫苗和滅活疫苗；新型疫苗相比于傳統(tǒng)疫苗來說，具有更好的安全性和穩(wěn)定性，主要類型是基因工程疫苗[46]。目前疫苗大多由不同種類的細胞產(chǎn)生，如真核細胞體系可以產(chǎn)生糖基化疫苗[47]，但是一些疫苗的生長制作周期長，無法與抗原變異速度匹配，對宿主細胞有毒性作用并且也存在運輸導致失活現(xiàn)象[48]。因此，在疫苗的生產(chǎn)領域需要一個具有突破性的體系，而CFPS體系可以滿足疫苗合成的靈活、快速、低成本并且耐受細胞毒性的需求，甚至凍干后的體系也可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生高滴度的疫苗[49]，能夠打破傳統(tǒng)冷鏈的運輸方式。

無細胞原核系統(tǒng)大腸桿菌體系為快速生產(chǎn)疫苗提供了一個快速設計合成平臺。Kanter等開發(fā)了一種可產(chǎn)生高產(chǎn)量的生物活性粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 的無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以作為小鼠B細胞淋巴瘤的疫苗，并進一步提高蛋白質(zhì)的溶解度和生物活性[49]。Lu等描述了一種基于大腸桿菌的CFPS方法，用于從2009年H1N1大流行毒株中提取HA莖域三聚體，他們的方法為廣泛的保護性疫苗提供了廣闊的前景，同時也展示了一種獨特的方法來生產(chǎn)復雜多聚體蛋白質(zhì)的單個結構域[50]。另外，真核無細胞系統(tǒng)能夠表達出更復雜的疫苗，如一直存在重組蛋白質(zhì)難以表達問題的瘧疾蛋白已經(jīng)可以在CFPS體系內(nèi)成功表達。Tsuboi等利用小麥胚芽無細胞系統(tǒng)成功表達了3種瘧疾蛋白，并成功在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的免疫原性，表明無細胞體系有發(fā)現(xiàn)瘧疾候選疫苗方面的潛力[51]。另外，有一類疫苗需要按照患者的需求而制備出適合患者的個性化疫苗，通常需要從患者受影響的細胞中分離出核酸，繼而表達出蛋白質(zhì)用作抗原引起免疫反應。尤其是在晚期癌癥的診斷中，受有效治療時間的限制，快速和隨需應變的蛋白質(zhì)生成至關重要，無細胞體系有望成為這種快速隨需應變的生產(chǎn)平臺。

2.1.2 抗體

抗體是指抗原刺激機體的免疫系統(tǒng)后免疫細胞產(chǎn)生的、可與相應抗原發(fā)生特異性結合的具有保護作用的免疫球蛋白，是生物目標的關鍵檢測元件，也是疾病治療、診斷、研究應用的重要工具[52]。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，抗體解決了免疫原性問題，并且能夠作為靶向載體輸送藥物以及作為免疫療法激活免疫應答[53]。目前重組抗體已經(jīng)成為重要的治療性蛋白，主要通過哺乳動物細胞系進行生產(chǎn)，但是體內(nèi)表達的生長周期限制了下一步篩選的速率，后續(xù)的純化過程也有一定難度，并且一些復雜抗體仍很難合成[54]。因此，抗體的合成需要一個更快速簡便的生產(chǎn)體系。而CFPS憑借其反應迅速、純化簡單并且真核無細胞體系能夠滿足復雜抗體的后修飾需要，成為合成抗體的新興體系[55]。

目前，CFPS已經(jīng)成功地用于抗體和抗體片段的合成。如Patel等利用大腸桿菌無細胞體系創(chuàng)造了含有炔丙基甘氨酸的螢光素酶變體以及攜帶pAzF的scFv與IM9蛋白的融合構建體，而且證明了用其檢測有獨特表面標記的細胞的可行性[56]。原核無細胞體系仍是重組抗體乃至全長抗體的主要來源。1997年，Ryabova等首次在基于大腸桿菌的無細胞體系中合成scFv抗體片段[57]。不久，Merk等使用類似的無細胞體系，通過添加還原性和氧化性谷胱甘肽、蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶 (PDI) 和伴侶蛋白，成功合成了兩個抗溶菌酶scFv抗體片段[58]。并且已經(jīng)證明，在合成scFv抗體片段時，添加還原性和氧化性谷胱甘肽、PDI和分子伴侶蛋白可以提高目標蛋白的溶解度和抗原結合活性[59]。此外，為了對復雜分子的折疊提供一個更合適的環(huán)境，真核細胞無翻譯系統(tǒng)也已被用于合成功能二硫鍵蛋白，包括scFv和Fab抗體片段。雖然真核生物的無細胞翻譯系統(tǒng)與大腸桿菌相比效率較低，但它們?yōu)楹铣煽扇苄匀L蛋白[60]、復雜蛋白和需要翻譯后修飾的蛋白提供了更好的基礎[61]。Stech等利用中國倉鼠卵巢(CHO) 無細胞體系展示了復雜抗體的合成，特別是免疫球蛋白G (IgG) 和單鏈可變片段Fc融合(scFv-Fc)[62]。Takeda等利用小麥無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)和脂質(zhì)體技術，利用雙層透析法和生物素化脂質(zhì)體相互作用試驗(BiLIA) 兩種方法制備抗G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR) 單克隆抗體[63]。小麥胚芽細胞無蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)也被用于制備可溶性高、免疫完整的中東呼吸綜合征冠狀病毒核衣殼蛋白 (Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV) 單克隆抗體。

此外，雙特異性抗體是近年來在腫瘤學、炎癥性疾病和感染性疾病治療領域中出現(xiàn)的一個有前景的研究領域。雙特異性抗體的雙重目標識別能力使新的治療假設得以驗證，Xu等使用無細胞表達系統(tǒng)(Xpress CF) 在多個支架中產(chǎn)生 (Knobs- into-holes，KIH) 雙特異性抗體的方法，實現(xiàn)高效的KIH生產(chǎn)[64]。

2.1.3 抗菌肽

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs) 是多細胞生物先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[65]。與抗生素的藥效和作用方式的不同，抗菌肽沒有藥物屏蔽作用，熱穩(wěn)定性好，AMPs可作為傳統(tǒng)抗生素的替代品備受關注[66]。然而天然抗菌肽來源有限、化學合成成本高、純化困難、難以保證活性穩(wěn)定性，基因重組成為合成AMPs的新方法，其中主要以大腸桿菌細胞體系最為常見[67]。但是大部分抗菌肽在基因工程生產(chǎn)中對宿主都有害，而且對于許多抗菌肽的作用機制還需要進一步研究，這就需要一個能夠相對迅速且耐受毒性的體系來大量合成抗菌肽，為進一步改造抗菌肽打下基礎。不同提取物來源的CFPS可以耐受毒性并滿足多種抗菌肽的快速生產(chǎn)，利于對抗菌肽作用機制的研究及改造抗菌肽[68]。

雖然許多抗菌肽通過破壞細胞膜來裂解細胞，但有一類特殊的非裂解肽，稱為富含脯氨酸抗菌肽(PrAMPs)，作用于細胞內(nèi)的目標核糖體，分布于所有生物體內(nèi)。其中吡咯霉素是一種富含脯氨酸的抗菌肽(PrAMP)，通過與伴侶蛋白DnaK (Chaperone protein DnaK) 特異性結合，以劑量依賴的方式殺死敏感物種。Taniguchi等為了闡明吡咯霉素的作用機制，使用大腸桿菌無細胞體系，比較了吡咯霉素的添加量對總基因表達過程的影響，與常規(guī)抗生素相比較，吡咯霉素對GFP合成的這種抑制作用不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄階段，而是發(fā)生在翻譯階段，這與鏈霉素對GFP合成的抑制作用類似[69]。

2.1.4 類病毒顆粒

類病毒顆粒(Virus like particles，VLPs) 是具有自組裝能力的多亞基蛋白質(zhì)復合物，由于缺乏病毒遺傳物質(zhì)，因此不具傳染性，也無法復制，是一種相比減毒或滅活病毒的傳統(tǒng)疫苗更安全的新興疫苗[70]。VLP在疫苗、藥物傳遞、基因治療和材料科學等方面的應用受到廣泛關注[71]。大多數(shù)VLP通過細胞體系產(chǎn)生，相比于細菌和酵母體系，昆蟲細胞表達系統(tǒng)因其生長速度快、可大規(guī)模培養(yǎng)并且具有與哺乳動物細胞相似的翻譯后修飾能力等優(yōu)點而得到廣泛應用[72-73]；但是昆蟲體系的最大問題就是去活、清除和提純的下游工藝中的操作難點以及在宿主細胞的特定環(huán)境中運輸穩(wěn)定性問題。而且在細胞內(nèi)產(chǎn)生VLP會受到難以控制的環(huán)境和VLP毒性的影響，細胞無法正常生長。由于自組裝效率低，特別是對于復雜的VLPs，它們應用往往受到設計和生產(chǎn)上的阻礙[74]。因此，還需要建立新的能夠耐受毒性、純化簡便的操作系統(tǒng)方法，用于篩選VLP的自組裝和穩(wěn)定因素。CFPS系統(tǒng)可以方便地用于高通量篩選，加快VLP的開發(fā)，是一個有吸引力的能夠靈活表達VLP蛋白并進行體外組裝的平臺[75]。

有研究者已經(jīng)成功在大腸桿菌和酵母無細胞體系中成功生產(chǎn)VLP。同樣，含有有毒中間體A2蛋白和非天然氨基酸的VLP也已在無細胞體系中成功制備[76]。Cerqueira等已經(jīng)建立了一個無細胞系統(tǒng)來研究人類乳頭瘤病毒16型(HPV16) 的組裝[77]。其中，原核無細胞體系可以在數(shù)小時之內(nèi)組裝起VLP，2007年Bundy等第一次使用基于原核細胞的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生病毒樣顆粒，并且以高產(chǎn)量形式生產(chǎn)MS2噬菌體表面蛋白VLP和C末端截短的乙肝核心蛋白VLP，而且這些VLP與體內(nèi)產(chǎn)生的VLP具有相似的特性[78]。Sheng等利用大腸桿菌的CFPS系統(tǒng)可以在4 h內(nèi)合成并組裝人諾如病毒 (Human noroviruses，HuNoVs)[79]。Chien等將在大腸桿菌中產(chǎn)生的神經(jīng)壞死病毒 (Nervous necrosis virus，NNV) 重組衣殼蛋白，后經(jīng)過無細胞系統(tǒng)自組裝形成點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒 (Orange-spotted grouper NNV，OSGNNV) VLP，保留了原病毒的結構特征且具有較強的免疫原性和較高的疫苗應用潛力，與細胞內(nèi)組裝的VLPs相比更安全[80]。

另外，有些VLP還具有藥物傳遞載體作用，如豇豆綠斑病毒 (Cowpea chlorotic mottle virus，CCMV) 在外表面附有標簽以促進它的藥物傳遞載體作用和構建產(chǎn)分子結構，還需要控制衣殼內(nèi)的RNA含量，Garmann等通過一種高效的無細胞體系合成CCMV顆粒，可以用于封裝任何來源的異種RNA[81]。

2.1.5 后修飾藥物

翻譯后修飾 (Post-translational modification，PTM) 指蛋白質(zhì)在翻譯后的化學修飾，其在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性、結構和功能等方面發(fā)揮著重要的作用[82]，能夠使蛋白質(zhì)的結構變得復雜，功能更加完善，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型。很多醫(yī)藥蛋白都具有不同形式的后修飾，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾中的研究中，獲得大量位點專一性蛋白質(zhì)是關鍵問題[83]。目前常見的翻譯后修飾蛋白質(zhì)的生物學合成方法主要利用真核表達體系、酶學催化和非天然氨基酸法。生物學方法在早期產(chǎn)生了很多后修飾蛋白，但是由于蛋白質(zhì)后修飾在整個細胞生命活動周期中存在著時空的調(diào)控，所以，對于同一種蛋白質(zhì)來說，不同時期存在不同的后修飾類型。而對于位點的精準性，研究者會采用將非天然氨基酸以特定位點結合到蛋白質(zhì)上[84]。另外酶催化法的效率低并且種類少[85]。因此，為了更精確地合成翻譯后修飾，就需要利用一個能提高位點精準度、效率高的體系。而近幾年隨著CFPS體系的發(fā)展，已經(jīng)能夠?qū)⒎翘烊话被嵛稽c特異性地與蛋白質(zhì)結合，并且CFPS的真核體系能夠?qū)崿F(xiàn)許多種類的后修飾[86]。

糖基化是主要的PTM類型之一，是藥物蛋白開發(fā)中非常重要的領域，對重組蛋白質(zhì)治療藥物的生產(chǎn)尤為重要，因為糖基化不當，會對治療藥物的治療活性或循環(huán)半衰期產(chǎn)生不利影響[87]。2012年，Guarino等首次在原核無細胞體系合成N-鏈糖蛋白[88]。關于另一種糖基化蛋白瘧疾蛋白，之前使用原核和真核細胞表達的瘧疾蛋白均糖基化不佳，通?？扇苄圆?，折疊不當，導致免疫原性降低。而基于HeLa細胞的CFPS卻可以體外表達糖基化的瘧疾蛋白[23]。此外利用優(yōu)化大腸桿菌菌株，獲得具有選擇性糖基化成分的細胞提取物，其中包括寡糖轉(zhuǎn)移酶(OSTs) 和脂聯(lián)寡糖(LLOs)[89]，也可以實現(xiàn)糖基化。另一種方式，在CFPS中添加微粒體CHO也可以促進蛋白質(zhì)糖基化，如Gurramkonda等利用CHO無細胞系統(tǒng)生產(chǎn)重組促紅細胞生成素(EPO)，使EPO的表達純化率提高了一倍[90]。

磷酸化是磷酸基團與蛋白質(zhì)的可逆結合，也是自然界中最重要的PTMs之一。近年來無細胞體系為測量和研究位點特異性磷酸化作出了巨大貢獻，Oza等通過原核CFPS體外合成高活性的雙磷酸化人MEK1激酶，這也是首次證明了由原核CFPS合成活性的MEK1，而不需要融合蛋白來實現(xiàn)可溶性蛋白的表達[91]。

無細胞系統(tǒng)憑借其開放性還能促進蛋白質(zhì)折疊，使其非常適合合成含二硫鍵的蛋白質(zhì)，以及進行結構和功能分析。Matsuda等開發(fā)了基于大腸桿菌細胞裂解液的CFPS，成功合成了毫克數(shù)量級的功能性具有二硫鍵的高等真核蛋白牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI) 和人溶菌酶C (LYZ)[92]。

此外，無細胞體系還能產(chǎn)生N端生物素化蛋白質(zhì)庫(BPL)，與患者血清抗體反應作為檢測自體抗原的快速篩選方法[93]。

2.1.6 非天然蛋白質(zhì)藥物

非天然氨基酸(Unnatural amino acids, UNAAs)[94]在蛋白質(zhì)合成中的嵌入是強大的生物合成工具，利用含有特殊側(cè)鏈的非天然氨基酸取代天然氨基酸可以提供多種具有新的理化性質(zhì)和生物學功能的蛋白質(zhì)。非天然氨基酸大多數(shù)是在細胞內(nèi)通過抑制終止密碼子，利用氨酰tRNA合成酶/tRNA對來實現(xiàn)將非天然氨基酸的嵌入[95]。這就需要維持細胞的生長狀態(tài)，但是過程繁瑣導致產(chǎn)量低，且一些UNAA不易穿過細胞膜，還會對細胞產(chǎn)生毒性，抑制細胞生長，后續(xù)的純化步驟也較繁瑣，這些都限制了UNAA的嵌入效率。UNAA嵌入蛋白質(zhì)中需要打破活細胞體系的限制，因此，越來越多的研究使用CFPS體系進行非天然蛋白質(zhì)的合成，因為CFPS沒有細胞膜的屏障，能夠提高UNAA的利用率，在配體蛋白相互作用、生物治療等方面具有廣闊的應用前景[96-97]。

目前，已經(jīng)有很多研究成功利用CFPS實現(xiàn)了UNAA的嵌入和標記。Ugwumba等將熒光非天然氨基酸7-(羥基香豆素-4-?；? 乙基甘氨酸 (Hco) 標記西尼羅河病毒非結構蛋白酶，可以鑒定新的蛋白質(zhì)抑制劑從而發(fā)現(xiàn)新藥物[55]。在開發(fā)抗體-藥物偶聯(lián)物(Antibody-drug conjugate，ADC) 的過程中，抗癌藥物與針對特定腫瘤標記物的抗體偶聯(lián)，通過無細胞系統(tǒng)將UNAA位點特異性地結合到抗體中，為藥物的控制和穩(wěn)定附著提供了一個位 點[98]。在最近的一項研究中，Cho等將非天然氨基酸對乙酰苯丙氨酸(pAcF) 加入到人類生長因子(hGH) 基因序列的不同位置，從而允許其位點特異性地與聚乙二醇(PEG) 結合。將另外一類非天然D型氨基酸加入蛋白質(zhì)或多肽中也有一些研究，Katoh等使用工程tRNAs和優(yōu)化的翻譯因子能夠?qū)⑹畟€連續(xù)的D-Ser引入一個肽段中，還表達了由4、5個連續(xù)的D型氨基酸組成的大環(huán)肽[99]，這些研究為鏡像藥物研制奠定了基礎。

圖2 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在醫(yī)藥健康領域的應用

2.2 無細胞體系與診斷

2.2.1 無細胞生物傳感器

生物傳感器是發(fā)展生物醫(yī)藥健康技術必不可少的一種高效靈敏的檢測與監(jiān)控方法，同時也是分子水平的微量、快速分析方法。目前生物傳感器的類型主要包括酶催化法、酶聯(lián)免疫法、全細胞傳感器、金屬納米顆粒傳感器和微流控生物芯片傳感器等[100-102]，反應快速，靈敏度高。但是以酶作為識別元件的傳感器，由于酶的價格較昂貴且穩(wěn)定性不夠，其應用受到一定限制；納米顆粒及微流控傳感體系制作復雜且成本高；全細胞生物傳感器會造成生物安全問題。而無細胞體系能夠行使生物傳感器的功能，而且沒有生物安全問題。在無細胞體系下的生物傳感器能像全細胞傳感器一樣接收外界樣品中輸入信號，經(jīng)過一系列蛋白合成的生化反應后，輸出可被檢測的光信號、電信號等。

有些研究人員在轉(zhuǎn)錄水平上開發(fā)了無細胞生物傳感器，這些基于轉(zhuǎn)錄的生物傳感器在不存在目標分析物時，用來抑制指示蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄[103]。Pellinen等提出了一種以螢火蟲熒光素酶為報告基因的四環(huán)素和汞誘導啟動子為模型的、用于檢測特定小分子配體誘導轉(zhuǎn)錄的無細胞生物傳感器[15]。除了在轉(zhuǎn)錄水平上使用CFPS系統(tǒng)作為生物傳感器外，在翻譯階段進行傳感也是一種很有前途的方法。主要包括用于檢測蛋白質(zhì)翻譯所需化學成分的傳感器和利用翻譯激活控制的傳感器，其最直接的方法是檢測轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的分子，如氨基酸、核糖核苷酸以及Mg離子等。到目前為止，這種方法僅在翻譯水平上用于氨基酸檢測。Jang等利用缺乏氨基酸的CFPS，對外源氨基酸產(chǎn)生熒光信號，以檢測某種氨基酸，其熒光強度與氨基酸濃度呈線性正比。該方法的檢測限低至100 nmol/L，已成功應用于生物樣品中與疾病相關氨基酸的定量檢測中[104]。除了上述轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的CFPS生物傳感器外，CFPS系統(tǒng)還可以利用翻譯后的蛋白質(zhì)折疊過程作為生物傳感機制。Salehi等提出一個通過無細胞體系表達變構融合蛋白并通過比色反應直接檢測化學物質(zhì)與人體雌激素受體β (hERβ) 的快速適應便攜式體外檢測生物傳感器平臺[94]。這種傳感器的傳感步驟是由蛋白質(zhì)折疊調(diào)控觸發(fā)的。

有些蛋白質(zhì)則是通過CFPS來生產(chǎn)而用作生物傳感，Kaiser利用CFPS合成了3種嗅覺受體蛋白hOR17-4、mOR23和mS51，是獲得大量嗅覺受體設計仿生傳感器的一個里程碑變化[105]。此外，為避免一些有毒無機離子和毒蛋白的毒性作用，Zhang等構建了5種不同的無細胞生物傳感器來檢測體系中的有毒無機離子砷和汞、以及有機分子3OC12-HSL、pC-HSL和苯甲酸。3OC12-HSL和pC-HSL都屬于酰化高絲氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine lactone，AHL)，是一種群體感應信號分子存在于許多囊性纖維化患者的痰、尿和血液中。因此，無細胞生物傳感器是有效的疾病標志物的檢測方 法[106]。Davies等構建了包含多種病毒抗原的無細胞蛋白質(zhì)微陣列，用于檢測病毒免疫后的人或動物血清，從而發(fā)現(xiàn)強免疫原性的蛋白質(zhì)用于預防接種的候選或者作為診斷指標[107]。

此外，雖然CFPS生物傳感器主要使用廉價的大腸桿菌為基礎的系統(tǒng)[104,108]，但隨著開發(fā)出更復雜的生物傳感器，其他非大腸桿菌為基礎的CFPS生物傳感器，包括農(nóng)桿菌[109]、酵母[17]、小麥[110]和哺乳動物系統(tǒng)可能成為必要的系統(tǒng)。隨著凍干技術的升級，凍干無細胞生物傳感器更便攜，而且滿足了偏遠環(huán)境惡劣地區(qū)應用凍干體系進行生物傳感的需求。挑戰(zhàn)仍然存在，并且需要更多的工程來實現(xiàn)許多應用所需的敏感性。

2.2.2 便攜式檢測

現(xiàn)代醫(yī)療越來越依賴于生物療法，偏遠地區(qū)和惡劣環(huán)境中資源稀缺，病原體的診斷以及合成個性化的醫(yī)療蛋白較困難，因此在偏遠和惡劣環(huán)境中檢測和治療的能力將是非常重要的。商業(yè)上可用的無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng) (細菌或哺乳動物) 被凍干在紙上或其他多孔基質(zhì)上，以創(chuàng)建穩(wěn)定的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡可在室溫下長期保存，并通過水合作用激活，Smith等提出了制備大腸桿菌無細胞凍干體系的方法，通過直接提取凍干和粉末能源系統(tǒng)的方法使無細胞粉末體系更加穩(wěn)定和高密度存儲和運輸[111]。

基于紙上和其他多孔材料的凍干CFPS不僅克服冷庫的限制、偏遠地區(qū)的生物療法和疫苗生產(chǎn)，還可以實現(xiàn)便攜的體外診斷功能。Pardee等已經(jīng)應用了基于紙上的凍干CFPS來快速檢測埃博拉病毒和寨卡病毒[112-113]。Ma等通過基于紙張的CFPS、等溫擴增和同源體的病毒富集來檢測臨床樣本中的諾如病毒[114]。Jang等在利用個人血糖儀分析氨基酸的過程中利用無細胞合成轉(zhuǎn)化酶生成葡萄糖，再利用個人血糖儀對氨基酸進行定量，其結果的準確性可與標準的高效液相色譜法相媲美[115]。

凍干CFPS還可以作為環(huán)境檢測的便攜工具，Gr?we等構建一個基于紙上的無細胞生物傳感器用于水質(zhì)評估，分別采用MerR和BlcR作為無細胞反應的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑進行檢測離子Hg(Ⅱ)和小分子羥丁酸 (GHB)，輸出基于綠色熒光蛋白 (sfGFP) 的表達信號，并且通過使用簡單的濾光器和智能手機就能解決野外熒光檢測的問題[116]。無細胞生物傳感器有很大的應用潛力，還有待進一步開拓。

3 結論與展望

醫(yī)藥健康與人類息息相關，在開發(fā)過程中往往需要進行工程設計以獲得最佳的功能和理化性質(zhì)。CFPS的開放、靈活、便攜、可控等特點使之在蛋白質(zhì)藥物開發(fā)方面具有重大優(yōu)勢，實現(xiàn)了難表達醫(yī)藥蛋白、非天然藥物蛋白、復雜后修飾蛋白等醫(yī)藥蛋白的快速高效合成。并且凍干CFPS體系可以解決疫苗運輸和偏遠地區(qū)對蛋白質(zhì)合成需求等問題。雖然CFPS系統(tǒng)在各方面的快速發(fā)展，已解決了合成效率、合成成本、難表達蛋白質(zhì)合成、高通量蛋白篩選、蛋白質(zhì)后修飾等主要問題，但仍然存在一些挑戰(zhàn)，比如缺乏低成本且高效的真核生物CFPS系統(tǒng)，以更好合成更復雜的真核蛋白質(zhì)。CFPS系統(tǒng)雖然可以對蛋白質(zhì)進行簡單的翻譯后修飾，但如何實現(xiàn)一些成熟藥物蛋白質(zhì)所需的極其復雜的修飾，還需要不斷地探索。未來無細胞合成生物學的發(fā)展需要進一步發(fā)揮其靈活性和高通量潛力，應用于大規(guī)模高通量功能性醫(yī)藥蛋白篩選和不斷發(fā)展以應對新型病原體的檢測與治療；并進一步利用其開放性特點，融合先進生物學、材料學、化學、物理學、計算機學等學科優(yōu)勢，以發(fā)揮其在醫(yī)學領域巨大潛力，繼續(xù)推動其在醫(yī)藥健康領域的發(fā)展和廣泛應用。

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Cell-free synthetic biology: an emerging strategy torevolutionize the biomedical industry

Yingying Liu1,2, Ning Bu1, and Yuan Lu2

1,,110034,,2,,100084,

Cell-free synthetic biology system can perform biological transcription and translation process. Because of its advanced features, such as flexible openness, easy control, short expression time and high tolerance to cytotoxicity, this systemhas been successfully used to synthesize proteins that are difficult to express in cells. With the continuous development of cell-free biosensing technology and the lyophilization technology, its applications have widely expanded into many biomedical fields. This review discusses the current research progress of cell-free synthetic biology system in on-demand biopharmaceutical synthesis, portable diagnostics, and others. Further development of the system can lead to even more complicated synthesis of therapeutic proteins with post-translational modifications and evolution of different cell-free biosensors with high sensitivity. Cell-free synthetic biology as an emerging engineering strategy can be a better means applied to high-throughput screening of pharmaceutical proteins, detection of new pathogens, and other important health-care fields in the future.

cell-free synthetic biology, pharmaceutical protein, portable detection, cell-free biosensors

June 22, 2019;

August7, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 21706144, 21878173), Beijing Natural Science Foundation (No. 2192023).

s: Yuan Lu. Tel/ Fax: +86-10-62780127; E-mail: yuanlu@tsinghua.edu.cn Ning Bu. E-mail: buning@sohu.com

劉瑩瑩, 卜寧, 盧元. 無細胞合成生物學：革新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的新策略. 生物工程學報, 2019, 35(12): 2269–2283.

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國家自然科學基金(Nos. 21706144, 21878173)，北京市自然科學基金(No. 2192023)資助。

(本文責編 陳宏宇)