肝癌免疫治療的研究進展

沈宗毅，李卯晨，白素杭，楊慶坤，張富涵，唐茂，郭疆瑜，楊昭

生物工程與大健康

楊昭 北京化工大學生命科學與技術(shù)學院副教授，碩士生導師。中國生物工程學會青年工作委員會委員，北京腫瘤病理精準診斷研究會常委。2010年獲吉林大學學士學位，2015年獲中國科學院生物物理研究所博士學位。致力于腫瘤干細胞和腫瘤免疫治療研究，國際上首次證明了膀胱癌干細胞起源于正常膀胱干細胞或膀胱癌非干細胞，相關(guān)研究成果發(fā)表在、、、和等國際權(quán)威學術(shù)期刊。

肝癌免疫治療的研究進展

沈宗毅，李卯晨，白素杭，楊慶坤，張富涵，唐茂，郭疆瑜，楊昭

北京化工大學 生命科學與技術(shù)學院，北京 100029

肝細胞肝癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。我國是肝癌大國，每年肝癌的死亡病例數(shù)位居全球第一。免疫治療是繼手術(shù)、化療和放療之后新興的癌癥治療手段，其通過解除腫瘤微環(huán)境對免疫細胞的抑制作用并激活機體免疫功能，實現(xiàn)控制和殺傷腫瘤細胞。常用的免疫治療的方法有免疫檢查點治療、過繼免疫治療和腫瘤疫苗治療等。與傳統(tǒng)治療手段相比，免疫治療因具有增強機體免疫功能、延緩腫瘤進展、延長患者生存時間等優(yōu)點，逐漸成為基礎和臨床研究的熱點。文中就免疫治療在肝癌領(lǐng)域的研究進展作一綜述。

肝細胞肝癌，免疫治療，免疫檢查點治療，過繼免疫治療，腫瘤疫苗

肝細胞癌(Hepatocellular carinoma，HCC) 是嚴重威脅全球人類健康的惡性腫瘤之一，占所有原發(fā)性肝癌的90%以上。世界衛(wèi)生組織2018年癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球約有84.1萬肝癌新增病例和78.1萬肝癌死亡病例。肝癌死亡率高達8.2%，僅次于肺癌位居世界第二[1]。在我國，每年約有46.6萬肝癌新增病例，約38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[2]。對我國肝癌患者病例研究發(fā)現(xiàn)，肝癌發(fā)生的主要因素有病毒性肝炎感染和長期飲酒、吸煙等不健康的生活方式[3]。

臨床上，肝癌的主要治療手段是手術(shù)切除、肝移植和局部消融，但是絕大多數(shù)肝癌患者發(fā)病隱匿，早期診斷困難，大多數(shù)患者在確診時已是晚期或者發(fā)生了轉(zhuǎn)移，失去了根治性治療的機會，并且病情發(fā)展迅速，預后極差，死亡率高，即使采取一些放療或者化療手段，療效依舊不理想，易造成耐藥和復發(fā)[4]，存活率仍然較低。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中所處的內(nèi)環(huán)境，大體上可分為免疫細胞為主的免疫微環(huán)境和成纖維細胞為主的非免疫微環(huán)境。免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中成分復雜多樣，包括T淋巴細胞(70%–80%)、B淋巴細胞(10%–20%)、巨噬細胞(5%–10%)、自然殺傷細胞(<5%) 和發(fā)揮抗原呈遞作用的樹突狀細胞[5]。腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的組成和比例的改變，對肝癌的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮關(guān)鍵作用。苗同國等[6]對40位均有乙型肝炎(HBV)病史的原發(fā)性肝癌患者和40位健康人的外周血進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T細胞亞群的數(shù)量顯著低于健康對照組，但CD8+、Treg細胞數(shù)量明顯高于健康對照組。不僅如此，肝癌患者血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α的表達量也顯著低于健康對照組。上述研究結(jié)果表明，肝癌患者的細胞免疫系統(tǒng)紊亂，免疫功能受到明顯抑制。細胞的免疫功能低下和免疫抑制正是肝癌難治愈、易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)的重要因素。另一方面，肝癌細胞能對自身表面抗原進行修飾使得腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的識別和清除，或是通過某些機制下調(diào)機體的抗腫瘤免疫應答，抑制免疫細胞的功能并誘導免疫細胞的凋亡，逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊[7]。此外，調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Tregs) 和腫瘤細胞相關(guān)的巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)通過參與免疫抑制反應，為腫瘤免疫逃逸發(fā)生和發(fā)展提供條件。Tan等[8]發(fā)現(xiàn)Tregs能有效削弱自身抗原引起的抗腫瘤免疫，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，回輸人源CD3+CD25–T細胞可阻止卵巢癌細胞生長，但同時回輸人源Tregs則會促進卵巢癌細胞的生長。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是腫瘤浸潤免疫細胞的主要成分，腫瘤微環(huán)境中多種刺激因子可招募巨噬細胞在腫瘤處聚集，巨噬細胞通過誘發(fā)炎癥反應或改變腫瘤細胞對藥物敏感性，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)低密度TAMs的原發(fā)性肝癌患者5年后的總生存率為61%，無進展生存率為61%，而高密度TAMs的HCC患者則分別為20%和15%，結(jié)果表明腫瘤周圍TAMs的密度與HCC術(shù)后預后密切相關(guān)，即肝癌患者的TAMs密度越高，預后越差。

腫瘤相關(guān)成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs) 是實體腫瘤微環(huán)境中最豐富的宿主細胞，是構(gòu)成非免疫微環(huán)境的主要細胞亞群，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。Olumi等[11]在體內(nèi)實驗中證實，前列腺癌細胞單獨或者與正常成纖維細胞共接種均不具備致瘤性，而與CAFs聯(lián)合接種則能形成巨大的實體瘤，揭示了CAFs主導的腫瘤微環(huán)境對腫瘤生長具有促進作用。此外，Liu等[12]發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的成纖維細胞相比于正常纖維細胞分泌更多的趨化因子CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16。四種趨化因子通過誘導HCC細胞hedgehog (Hh) 途徑和transforming growth factor-β (TGF-β) 途徑來促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。

肝臟中免疫微環(huán)境和非免疫微環(huán)境共同參與HCC的免疫耐受及應答，影響肝癌的發(fā)展與患者預后。傳統(tǒng)的HCC治療方案由于未對免疫耐受環(huán)境產(chǎn)生影響，免疫系統(tǒng)對藥物的敏感性不足，療效常不理想。因此，臨床醫(yī)師應充分了解HCC免疫微環(huán)境，完善治療策略提高HCC的治療效果。

腫瘤免疫治療是通過激發(fā)機體的免疫功能，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞的治療手段。與傳統(tǒng)肝癌治療手段相比，免疫治療發(fā)生嚴重毒性反應的概率更低，患者耐受性更好，可有效增強機體的免疫反應，延緩腫瘤的進展，一定程度上延長患者的生存時間。近年來，肝癌免疫治療逐漸成為目前研究的熱點，并在臨床上取得了積極的效果，部分病人在接受免疫治療后生存周期延長，復發(fā)率降低。常用的免疫治療的方法有免疫檢查點抑制劑治療(CTLA-4單抗、PD-1/PD-L1單抗等)、過繼免疫治療(細胞因子誘導的殺傷細胞、嵌合抗原受體T細胞免疫、腫瘤浸潤淋巴細胞等) 和腫瘤疫苗治療(樹突狀細胞疫苗、溶瘤病毒疫苗等) (圖1)，本文對近年來肝癌免疫治療的研究進展作一綜述。

1 免疫檢查點抑制劑治療

參與抗腫瘤免疫反應的T細胞在活化后，其表面多種抑制性受體表達上調(diào)，與腫瘤細胞表面相應配體結(jié)合產(chǎn)生免疫抑制作用，促使腫瘤相關(guān)免疫反應的強度下調(diào)。這些在免疫反應過程中具有抑制性免疫調(diào)節(jié)作用的位點，被稱為免疫檢查點。目前許多研究都致力于揭示免疫機制以及腫瘤相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)通路并取得了突破性進展。2018年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎分別授予了美國德州大學安德森癌癥中心詹姆斯·P·艾利森(James P. Allison)和日本免疫學家本庶佑(Tasuku Honjo)，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了CTLA-4和PD-1/PD-L1免疫負調(diào)控癌癥療法。

1.1 CTLA-4單抗

細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4) 是一種白細胞分化抗原，屬于T細胞上的一種跨膜受體，它的表達與T細胞活化存在密切聯(lián)系。T細胞表面分子CD28通過與抗原呈遞細胞表面配體CD80/CD86結(jié)合激活免疫細胞完成免疫反應，但由于CTLA-4與CD28分子存在相互競爭關(guān)系，而CTLA-4與CD80/CD86具有更好的親和性使得CTLA-4更易結(jié)合兩個配體，抑制T細胞的活性(圖2)[13]。

阻斷CTLA-4與其配體的結(jié)合可刺激免疫細胞的活化、增殖從而誘導或增強免疫反應。Hodi等[14]對Ⅲ/Ⅳ期黑色素瘤患者分別進行抗CTLA-4單克隆抗體Ipilimumab (IgG 1κ) 或糖蛋白100 (Glycoprotein 100，gp100) 治療。結(jié)果表明，接受gp100治療的患者中位總生存期為6.4個月，而接受Ipilimumab治療的患者中位總生存期為10.1個月，即Ipilimumab顯著提高了黑色素瘤患者的術(shù)后生存期。因此，Ipilimumab成為第一個獲得FDA批準用于臨床的免疫檢查點抑制劑[15]。腎細胞癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等利用Ipilimumab進行治療時發(fā)現(xiàn)其療效并沒有黑色素瘤明顯，還需更多試驗結(jié)果確定能否利用Ipilimumab有效治療其他癌癥類型。

圖1 肝癌免疫治療方法

Tremelimumab作為另一個阻斷CTLA-4的單克隆抗體已用于肝癌、結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療。目前已應用于肝癌臨床治療的藥物有Sorafenib[16]、Everolimus[17]和Brivanib[18]，3種藥物對肝癌的疾病控制率為44%–53%，腫瘤進展時間中位數(shù)為2.7–5.5個月。Sangro等[19]對HCC和HCV患者共17例進行Tremelimumab治療后，患者的客觀反應率和疾病控制率分別是17.6%和76.4%，腫瘤進展時間的中位數(shù)是6.48個月。Tremelimumab與Sorafenib、Everolimus和Brivanib相比，表現(xiàn)出更好的治療效果，但其安全性和抗腫瘤活性還需更多臨床試驗和數(shù)據(jù)分析來進一步評估。

圖2 CTLA-4介導的免疫抑制通路[13]

1.2 PD-1/PD-L1單抗

程序性死亡受體1 (Programmed cell death protein 1，PD-1) 屬于CD28超家族成員，其配體程序性死亡配體1 (Programmed cell death-Ligand 1，PD-L1) 和程序性死亡配體2 (Programmed cell death-Ligand 2，PD-L2) 都具有抑制T細胞活性功能。腫瘤細胞表面PD-L1分子表達上調(diào)后與T細胞和B細胞的PD-1結(jié)合，使PD-1分子位于胞質(zhì)區(qū)的ITSM (Immunoreceptor tyrosine-based switch motif) 磷酸化，細胞內(nèi)的葡萄糖代謝受到抑制，T細胞增殖能力和細胞因子分泌能力大大降低，腫瘤細胞周圍T細胞耗竭，最終導致腫瘤細胞逃過免疫監(jiān)控和清除[20]。

以PD-1/PD-L1作為靶點阻斷PD-L1蛋白與PD-1受體的結(jié)合使T細胞發(fā)揮正常功效對抗腫瘤具有重要意義。2014年FDA批準了人源IgG 4κ單克隆抗體Nivolumab作為第一個PD-1靶向黑色素瘤治療藥物。在一項三期臨床實驗中，患者分別接受Nivolumab和達卡巴嗪治療，其客觀反應率分別為40.0%和13.9%，無進展生存期分別為5.1個月和2.2個月，一年總生存率分別為72.9%和42.1%?？梢?，Nivolumab對于黑色素瘤的治療效果均優(yōu)于達卡巴嗪[21]。2016年，El-Khoueiry等[22]公布了Nivolumab治療晚期原發(fā)性肝癌Ⅰ/Ⅱ期非隨機臨床研究結(jié)果，214名患者接受Nivolumab靜脈注射，有35例患者出現(xiàn)應答(16.3%)，其中33例部分應答(94%)，2例完全應答(6%)；111例患者(52%) 在整個治療過程中病情穩(wěn)定?；颊呖陀^反應率為16%，疾病控制率達68%，6個月生存率82.5%，9個月生存率70.8%。因此，Nivolumab對晚期HCC患者表現(xiàn)出良好的安全性，具備治療晚期HCC患者的潛力。

另外一個靶向抑制PD-1通路的單克隆抗體是Pembrolizumab，并且已被FDA批準用于一線PD-1過表達的非小細胞肺癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療。一項多中心Ⅱ期臨床試驗KEYNOTE-224研究Pembrolizumab在晚期HCC患者中的安全性和有效性。該研究招募了104名患者每3周對其進行200 mg的Pembrolizumab靜脈注射，104名參與者中有84名(81%) 死亡或疾病進展，疾病進展中位時間為4.9個月，無進展生存期中位時間4.9個月。104名參與者中有60名(58%) 死亡，中位總生存期為12.9個月。研究進行到12個月時，29名患者存活且無進展，12個月無進展生存率為28%，56名患者仍然存活，12個月總生存率為54%[23]。另外兩項關(guān)鍵臨床Ⅲ期試驗KEYNOTE-240和KEYNOTE-394評估Keytruda單藥二線治療HCC的療效和安全性仍在進行中。

PD-1/PD-L1除了運用于腫瘤治療還可作為術(shù)后的預測因子。Gao等[24]通過蛋白質(zhì)印跡實驗測試125名HCC患者PD-L1表達量以研究PD-L1與病人預后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PD-L1陰性患者(低表達) 中位總生存期為59.4個月而PD-L1陽性患者(高表達) 是29.6個月，此外，PD-L1陽性患者復發(fā)率是陰性患者1.71倍，PD-L1陽性患者的預后明顯差于低表達患者。因此，PD-L1可作為HCC免疫療法的靶標和表征患者預后的潛在標志物。

1.3 PD-1/PD-L1聯(lián)合CTLA-4

單一的免疫檢查點抑制劑在HCC治療中表現(xiàn)出較好療效，但對晚期實體瘤療效有限，免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合運用有望產(chǎn)生協(xié)同作用獲得更 好療效。Stein等[25]將PD-L1單抗Atezolizumab聯(lián) 合Bevacizumab治療晚期HCC患者(NCT02715531)。在43位接受治療的患者中有14名晚期HCC患者瘤體縮小30%，5名晚期患者疾病穩(wěn)定控制率達到83%。聯(lián)合方案優(yōu)于單藥治療有效率達到65%。Hellmann等[26]針對不同非小細胞肺癌患者評估Nivolumab治療方案(CHECKMATE 227)。試驗以1︰1︰1的比例分別對患者進行Nivolumab和Ipilimumab聯(lián)合用藥治療、Nivolumab單一藥物治療和化療。Nivolumab和Ipilimumab聯(lián)合用藥的一年無進展生存率為42.6%，化療的為13.2%，中位無進展生存期分別為7.2個月和5.5個月。Nivolumab加Ipilimumab的客觀反應率為45.3%，化療的為26.9%。結(jié)果表明Nivolumab加Ipilimumab的無進展生存率、無進展生存期和客觀反應率均優(yōu)于化療。對比Nivolumab和化療發(fā)現(xiàn)Nivolumab的中位無進展生存期為4.2個月，化療為5.6個月，兩個治療組無進展存活率沒有顯著差異。這些結(jié)果表明Nivolumab加Ipilimumab聯(lián)合用藥在非小細胞肺癌患者治療中優(yōu)于化療，Nivolumab加Ipilimumab聯(lián)合用藥可以作為非小細胞肺癌的有效一線治療藥物。聯(lián)合治療方案相比單藥治療也引起相對較多的副作用。除了免疫治療出現(xiàn)的副作用發(fā)燒、咳嗽、皮疹和乏力等之外也有其他癥狀出現(xiàn)，所以還需根據(jù)病人臨床數(shù)據(jù)指標對治療策略作進一步優(yōu)化。

盡管關(guān)于免疫檢查點抑制劑報道結(jié)果表現(xiàn)出很好的療效，但免疫檢查點抑制劑仍存在潛在的嚴重不良反應。例如，PD-1抑制劑在阻斷PD-1與PD-L1相互作用的同時存在抑制T細胞與抗原呈遞細胞的作用[27]。PD-1/PD-L1單抗僅能解除位于腫瘤細胞邊緣T細胞的束縛，不能夠促使T細胞攻擊腫瘤細胞，因而僅對部分患者有效，部分患者在接受治療后病情反而惡化，因此還需要針對晚期肝細胞癌的治療策略進行優(yōu)化[28]。對新型免疫檢查點的鑒定和治療效果的探究，是未來免疫治療領(lǐng)域的研究重點。

2 過繼免疫治療

目前過繼免疫治療有兩個治療方向：一是給患者回輸能在體內(nèi)激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫反應的細胞如樹突狀細胞，屬于主動細胞免疫治療。二是通過對自身的細胞在體外進行刺激后產(chǎn)生大量的特異性細胞，再將特異性細胞回輸?shù)饺梭w內(nèi)調(diào)動和激活人體內(nèi)的細胞因子和具有細胞毒性的免疫細胞，調(diào)整免疫殺傷性反應，實現(xiàn)殺傷腫瘤效果，屬于被動細胞免疫治療。肝癌的過繼免疫治療對抑制肝癌的復發(fā)、延長生存期都具有重要的作用，特別是作為術(shù)后輔助治療手段取得了較好療效，這也推動了許多與該療法相關(guān)Ⅲ期臨床試驗的進行。

2.1 細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokines- induced killer, CIK)

細胞因子誘導的殺傷細胞是一種非MHC限制性的新型免疫活性細胞，其增殖能力強、抗腫瘤活性高、副作用小，優(yōu)于淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokine activated killer cells，LAK)，對提高患者自身抗腫瘤免疫能力有重要作用[29]。CIK是T淋巴細胞的細胞群，主要包括CD3+/CD56–細胞、CD3–/CD56+NK細胞、CD3+/CD56+T細胞等。CD3+/CD56+T細胞是主要的效應細胞，它們具有很強的增殖能力，對腫瘤細胞具有特異性，并且具備T細胞和NK細胞雙重抗腫瘤能力且對正常細胞毒性較小。早期臨床研究顯示CIK細胞對各種腫瘤均具有抗癌活性。

臨床前試驗表明，CIK細胞在體外具有較高的抗肝癌細胞活性，在荷瘤裸鼠模型中對肝癌細胞生長的抑制作用均強于LAK和PBMC[30]。Pan等[31]對肝切除后HCC患者進行CIK細胞免疫輔助治療，研究輔助治療對患者的總生存期和無復發(fā)生存期的影響。單獨肝切除患者的中位總生存率和無復發(fā)生存期分別為28個月和12個月，肝切除后接受CIK細胞免疫治療的患者中位總生存率和無復發(fā)生存期分別為41個月和16個月。因此，CIK免疫輔助治療可顯著提高總生存期和無復發(fā)生存期。

在另一項研究CIK細胞免疫治療功效和安全性的Ⅲ期臨床試驗中，17%的患者出現(xiàn)與CIK細胞因子相關(guān)的不良反應，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肌痛和疲勞，但它們的嚴重程度尚在可控范圍內(nèi)[29]。因此，CIK細胞免疫治療的安全性仍需更多臨床試驗作進一步研究。

為了達到更好的治療效果，將樹突狀細胞(Dendritic cell，DC) 與CIK細胞聯(lián)合運用作為新的治療策略。樹突狀細胞主要分布在淋巴系和髄系，是已發(fā)現(xiàn)的最強的抗原呈遞細胞，能有效激活T細胞誘導機體發(fā)生抗腫瘤免疫反應。DC-CIK細胞免疫已在多種實體瘤臨床研究中取得了令人可喜的結(jié)果。肝癌手術(shù)后配合DC-CIK輔助治療可以提高機體免疫功能，為患者提供了一種安全有效的治療策略。已有研究證實DC-CIK細胞療法能用于增強術(shù)后經(jīng)導管動脈化療栓塞(POTACE)的HCC癌患者的抗腫瘤免疫能力。Zhang等[32]研究分析DC-CIK細胞治療對接受POTACE的HBV感染的HCC患者的臨床療效。對照組(僅POTACE)與實驗組(POTACE加DC-CIK細胞療法) HCC患者的中位總生存時間分別為26.7個月和38.7個月，實驗組明顯長于對照組。除此之外，試驗還對患者的血清甲胎蛋白(AFP) 表達水平進行測試，AFP是用于診斷原發(fā)性癌癥和HCC腫瘤復發(fā)的特異性標記物，在健康人血清中AFP維持在較低水平，而在惡性腫瘤中因受到相應刺激使得AFP表達水平上升。在接受POTACE加DC-CIK細胞療法之前，對照組和實驗組AFP表達量分別為 (332.4±668.5) ng/mL和 (236.1±389) ng/mL，AFP水平無顯著性差異。治療之后對照組與實驗組分別為 (50.3±105.7) ng/mL和 (603±1161.7) ng/mL，實驗組AFP水平與對照組相比明顯降低。研究結(jié)果表明，DC-CIK細胞療法在延長患者中位總生存時間、降低HCC患者外周血中的AFP水平、改善HCC患者預后都起到了重要的作用。

盡管關(guān)于CIK療法已經(jīng)開展了很多工作，但是由于存在免疫逃逸機制和缺乏特定腫瘤抗原，只有一部分T細胞可以發(fā)揮完整的抗腫瘤功能。如何進一步提高CIK療法的有效性有待進一步研究。

2.2 嵌合抗原受體T細胞免疫(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, CAR-T)

嵌合抗原受體修飾T細胞是近年來迅速發(fā)展的腫瘤過繼免疫新療法，其原理是利用經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T細胞特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，提高效應T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性，克服抑制性腫瘤局部免疫微環(huán)境并打破宿主免疫耐受性。

CAR-T細胞到目前為止已經(jīng)開發(fā)到了第4代，基于前3代的基礎上T細胞的持續(xù)增殖、細胞因子的分泌和殺傷腫瘤的能力都得到了較大的提高。目前被廣泛應用的CAR結(jié)構(gòu)由單鏈抗體、細胞外鉸鏈區(qū)(Extracellular hinge region)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成[33]。CAR-T免疫治療在白血病[34]、淋巴瘤[35]中取得了較好的療效。2017年FDA批準Kymriah和Yescarta兩種CAR-T治療產(chǎn)品用于淋巴細胞白血病和淋巴瘤的治療。

CAR-T細胞免疫雖然在實體瘤的應用上已經(jīng)成為了研究的熱點，但是關(guān)于HCC在臨床上的研究還沒有報道，更多仍處于基礎研究階段[36]，其技術(shù)關(guān)鍵點在于腫瘤特異性抗原的選擇。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypican-3，GPC3) 是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一員，屬于一種跨膜糖蛋白，在細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用。Gao等[37]發(fā)現(xiàn)GPC3+腫瘤細胞能有效地被GPC3靶向的T細胞裂解，并且裂解的腫瘤細胞數(shù)量和腫瘤中GPC3表達量呈正比。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，GPC3-CAR-T細胞可有效殺傷肝癌細胞抑制HCC腫瘤形成。

除了對CAR-T細胞修飾抗原受體以外，還能將CAR-T定向改造表達所需的細胞因子輔助免疫治療。Adachi等[38]將IL-7和CCL19基因轉(zhuǎn)染到CAR-T細胞以表達IL-7和CCL19 (7×19 CAR-T細胞)。IL-7是一種細胞因子可促進T細胞增殖提高存活率，CCL19作為引誘因子可吸引T細胞和樹突狀細胞到達腫瘤部位。傳統(tǒng)的CAR-T細胞存活率僅有30%，而接受7×19 CAR-T細胞治療的DBA/2小鼠的存活率達到100%。利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)7×19 CAR-T細胞可以有效促進浸潤性T細胞和樹突狀細胞向腫瘤組織的轉(zhuǎn)移。IL-7和CCL19兩者的結(jié)合既增強免疫細胞增殖能力又促進免疫細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，類似上述具備兩種或多種功能的CAR-T細胞將會為今后免疫治療提供一種新的治療策略。

隨著CAR-T細胞在臨床的不斷應用，CAR-T細胞存在的安全性問題開始受到了人們的關(guān)注，在輸注大量的CAR-T細胞后機體會分泌大量的細胞因子導致細胞因子風暴引發(fā)多器官功能衰竭，同時CAR-T細胞的免疫排斥反應和脫靶效應等其他安全性問題也亟待解決，未來還需要對CAR-T細胞結(jié)構(gòu)逐漸優(yōu)化來克服上述安全性問題。

2.3 腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TIL)

腫瘤浸潤淋巴細胞本身也作為一種免疫療法。手術(shù)切除的腫瘤組織大部分是腫瘤細胞但仍有少部分淋巴細胞。TIL治療原理是從腫瘤組織中分離淋巴細胞在體外進行擴增，經(jīng)IL-2培養(yǎng)得到足夠多腫瘤浸潤淋巴細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)發(fā)揮抗癌作用。先前的研究表明在HCC中TIL數(shù)量稀少，但對腫瘤病人的復發(fā)有重要的影響[39]。經(jīng)過TIL治療的肝癌患者與對照組相比復發(fā)率減少38.6%，5年生存率提高了34.9%。在另外一項隨機臨床試驗中，76例HCC患者(HBV感染患者占20%，HCV感染患者占66%) 在肝切除后利用IL-2體外激活淋巴細胞進行過繼免疫治療后相比于對照組其復發(fā)率降低18%[40]。雖然TIL有明顯的治療效果，但是目前存在的困難是TIL難以從HCC患者中分離并進行體外擴大培養(yǎng)，并且僅有少部分TIL細胞對腫瘤抗原敏感[33]。Rosenberg等[41]發(fā)現(xiàn)在CD8+TIL細胞中只有少量對腫瘤抗原敏感，其他大量TIL對腫瘤細胞不敏感，其原因是在CD8+TIL細胞中存在CD39表達差異。CD39是一種與慢性免疫細胞刺激有關(guān)的分子，在多種惡性實體瘤中存在高表達的情況。研究發(fā)現(xiàn)CD8+CD39+的TIL具有潛在的抗腫瘤能力但其活性受到抑制，PD-1/PD-L1抑制劑可以解除該類抑制。所以能對PD-1/PD-L1與CD39之間作用機制作進一步研究，便于今后臨床上將CD39表達量作為指標確定PD-1/PD-L1治療策略。

2.4 淋巴因子激活殺傷細胞(Lymphokine- activated killer, LAK)

淋巴因子激活殺傷細胞是用高濃度IL-2激活腫瘤患者自體或正常捐贈者的外周血單核細胞，激活之后體外有廣譜抗腫瘤的活性，可直接溶解、殺傷腫瘤細胞。Takeda等[42]報道了LAK細胞治療多發(fā)HCC的有效性和實用性，但是這種方法存在腫瘤細胞自體回輸風險，所以臨床報道不多。

3 腫瘤疫苗治療

腫瘤疫苗治療具有高效性和低毒性，其目的就是啟動機體產(chǎn)生持續(xù)的抗腫瘤免疫反應，避免損傷自體組織細胞。肝癌疫苗就是利用肝癌細胞或者抗原誘導機體特異性免疫應答達到消滅腫瘤的目的。腫瘤疫苗主要包括多肽疫苗、樹突狀細胞疫苗和溶瘤病毒疫苗等。

3.1 多肽疫苗

目前報道較多的多肽疫苗是甲胎蛋白(AFP)多肽疫苗。甲胎蛋白(AFP) 是一種糖蛋白，屬于白蛋白家族。甲胎蛋白在胎兒血液中含量豐富，出生后含量逐漸降低，在健康成年人血清中維持較低水平。在肝臟、胃和胰腺等惡性腫瘤中因受到相應的刺激，重新獲得合成AFP的能力出現(xiàn)了甲胎蛋白含量升高的情況。檢查血清中的甲胎蛋白含量結(jié)合一些影像學檢查能方便快捷地對肝癌進行臨床診斷。

甲胎蛋白因在胚胎時期就已經(jīng)出現(xiàn)，機體對其已產(chǎn)生免疫耐受性，甲胎蛋白再次在肝臟中合成時難以產(chǎn)生有效的免疫應答，無法對肝癌細胞進行殺傷，所以甲胎蛋白也可作為肝癌免疫治療的潛在靶點?；诩滋サ鞍鬃鳛榘悬c的臨床試驗已經(jīng)開展。利用AFP抗原決定簇肽制備肝癌疫苗進行小鼠實驗，測定小鼠腫瘤大小和細胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ) 發(fā)現(xiàn)對照組腫瘤直徑為(12.28±3.49) mm，經(jīng)AFP肝癌疫苗治療的小鼠其腫瘤直徑為 (8.87±3.49) mm，實驗結(jié)果說明AFP肝癌疫苗能有效抑制腫瘤的生長；實驗組小鼠血清中細胞因子相比于對照組存在不同程度的上調(diào)，而淋巴細胞活化負調(diào)控因子IL-10表現(xiàn)出顯著的抑制作用[43]。

AFP特異性多肽疫苗表現(xiàn)出來的顯著抗癌活性能為今后肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)，但是AFP多肽疫苗也存在一定的局限性，它只針對AFP特異性的免疫反應，而肝癌細胞AFP抗原的表達存在一定的異質(zhì)性，臨床上存在1/3的肝癌患者的甲胎蛋白水平并未明顯升高的情況，這會影響患者的臨床診斷延誤疾病的治療。

3.2 樹突狀細胞疫苗

樹突狀細胞(DC) 是人體內(nèi)抗原遞呈能力最強的細胞，通常情況下人體內(nèi)的DC細胞數(shù)量很少，只有抗原遞呈細胞發(fā)揮正常呈遞功能時身體才能有效識別病原，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應。腫瘤疫苗通常是利用腫瘤抗原物質(zhì)誘導機體產(chǎn)生特異性免疫反應達到治療腫瘤的目的。樹突狀細胞疫苗是體外培養(yǎng)病人單核細胞誘導生成DC細胞，負載相應的腫瘤抗原制成含腫瘤抗原的樹突狀細胞，再將細胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)激活毒性T淋巴細胞增殖實現(xiàn)殺傷腫瘤的作用。2010年4月FDA批準了第一個抗腫瘤樹突狀細胞疫苗Provenge用于治療前列腺癌，但是療效并不理想。為提高抗腫瘤樹突狀細胞疫苗療效需要對其進行改進，有研究團隊將疫苗與免疫檢查點抑制劑相結(jié)合以提高藥物療效。Wilgenhof等[44]將特異性疫苗和免疫檢查點CTLA-4抑制劑兩者相結(jié)合用于晚期黑色素瘤Ⅱ期臨床研究。39名黑色素瘤病人在接受樹突狀細胞疫苗和Ipilimumab聯(lián)合治療之后，6個月疾病控制率為51%，整體腫瘤反應率為38%，其中完全反應8例，部分反應7例。1年和2年生存率分別為59%和38%。O’Day等[45]利用Ipilimumab單藥治療晚期黑色素瘤患者其1年和2年的生存率分別為47.2%和32.8%。實驗結(jié)果表明腫瘤疫苗與免疫檢查點聯(lián)用與單一藥物治療相比具有顯著優(yōu)勢。上述臨床結(jié)果為腫瘤疫苗與免疫檢查點聯(lián)合使用提供臨床數(shù)據(jù)支持，兩者相結(jié)合的治療策略具有很好的發(fā)展前景。

200項臨床試驗已經(jīng)表明DC疫苗安全可靠能高效激活病人產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應。未來DC疫苗還將運用到肝癌、肺癌等其他癌癥疾病?；贒C疫苗與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用等新的治療策略會被開發(fā)并運用到更多臨床試驗中[46]。

3.3 溶瘤病毒疫苗

溶瘤病毒通過感染癌細胞引起病毒性細胞病變并誘發(fā)宿主抗腫瘤免疫反應，從而選擇性殺死癌細胞。2015年美國FDA和歐洲藥物管理局(EMA) 批準了經(jīng)基因工程改造的單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1) 命名為lmlygic用于治療黑色素瘤。lmlygic直接注射到腫瘤組織能高效感染腫瘤細胞引起腫瘤細胞裂解，裂解的腫瘤細胞釋放出腫瘤相關(guān)的抗原，在人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) 作用下，激發(fā)機體抗腫瘤的免疫反應[47]。除了HSV-1外，尚有許多不同類型的病毒已經(jīng)進入臨床試驗以評估其生物安全性和抗腫瘤療效，主要包括腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和呼腸孤病毒等。Heo等利用JX-594痘苗病毒以確定晚期肝癌患者的最佳JX-594劑量。隨機對處在Ⅱ期的30名患者進行試驗，受試者中有16名患者(HBV感染患者占37%，HCV感染患者占19%)注射高劑量JX-594，而14名患者(HBV感染患者占43%，HCV感染患者占21%，酒精相關(guān)肝癌患者占14%) 則注射低劑量，兩種劑量中位生存期分別為14.1個月和6.7個月，高劑量組的生存期明顯高于低劑量組，結(jié)果表明受試者生存期和劑量存在一定的相關(guān)性[48]。

采用溶瘤病毒與免疫檢查點抑制劑相結(jié)合治療策略能實現(xiàn)更好的治療效果。在一項1b期臨床試驗中，Ribas等[49]將溶瘤病毒與抗PD-1抗體Pembrolizumab聯(lián)用評估其安全性。使用Pembrolizumab單藥進行PD-1阻斷治療可使轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者客觀反應率達33%[50]，病人在接受溶瘤病毒與Pembrolizumab聯(lián)合用藥后其客觀反應率達62%，完全緩解的占33%?；颊唧w內(nèi)CD8+T細胞數(shù)增加，IFN-γ基因出現(xiàn)過度表達。試驗結(jié)果表明溶瘤病毒與Pembrolizumab聯(lián)用療效優(yōu)于PD-1單一抗體，但是由于研究人數(shù)有限，還需要更多的臨床試驗進一步證明溶瘤病毒與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用優(yōu)于單藥治療。目前，治療晚期肝癌的瘤苗病毒項目(臨床試驗登記號NCT02562755) 尚在臨床Ⅲ期，預期2019年10月完成研究，但是截止至12月相關(guān)研究機構(gòu)還未公布臨床結(jié)果。

溶瘤病毒作為腫瘤免疫治療方法雖然許多仍處于臨床研究早期階段，但是因其具有殺傷腫瘤和激活腫瘤免疫的雙重功效使得它一直備受關(guān)注，其抗腫瘤活性和疫苗自身穩(wěn)定性都將會是未來研究的熱點。

4 展望

免疫治療是目前肝癌治療方法中的重要研究方向，并且在肝癌的治療中取得了令人可喜的結(jié)果，越來越多的醫(yī)療機構(gòu)將免疫治療作為一種常規(guī)的手段運用到臨床，但是仍然存在著研發(fā)難度大、臨床試驗缺乏等不足，在未來可從以下4個方向進一步挖掘。一是新的腫瘤細胞表面免疫治療標志物的發(fā)現(xiàn)。醫(yī)生可以根據(jù)患者的各項標志物指標選取最優(yōu)的治療方案，做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期根治。二是各種治療方法的聯(lián)合運用。對比不同治療方案的優(yōu)缺點取長補短，治療方案相互協(xié)調(diào)，提高免疫治療的效能和特異性。三是對肝癌免疫病理和分子病理進行更加系統(tǒng)全面的研究。由慢性病毒感染(乙肝、丙肝) 引發(fā)的肝癌和酒精肝、藥物/誘變劑引發(fā)的肝癌在分子病理、免疫應答方面均有所不同，對不同肝癌致病因素的研究有助于闡述肝癌發(fā)生病因和發(fā)病機理，為新型肝癌免疫治療方法的開發(fā)奠定理論基礎。四是新型治療策略的開發(fā)。將免疫治療藥物與高分子納米材料或者生物載體相結(jié)合以提高藥物的載藥量和靶向性。

隨著對分子生物學和分子免疫學研究的深入，腫瘤微環(huán)境中T細胞對腫瘤免疫具有重要的影響，不同T細胞亞群發(fā)揮不同的功能，對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞亞群的鑒定及其變化可作為腫瘤預后的檢測指標之一。作用于免疫檢查點PD-1/PD-L1和CTLA-4的部分藥物在多種腫瘤中均有優(yōu)異的表現(xiàn)，但是獲益人群有限，臨床上仍無法獲得滿意的結(jié)果，新型免疫檢查點的鑒定及其與免疫細胞亞群所介導的新型免疫療法將會為肝癌的免疫治療提供更多新的思路，改進目前免疫治療存在的不足，對改善肝癌患者的生存質(zhì)量、延長生存期、降低復發(fā)率都有著重要的作用。

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Progress in immunotherapy for hepatocellular carcinoma

Zongyi Shen, Maochen Li, Suhang Bai, Qingkun Yang, Fuhan Zhang, Mao Tang, Jiangyu Guo, and Zhao Yang

College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the malignant tumors with the highest morbidity and mortality in the world. The morbidity and mortality of HCC are increasing every year. Liver cancer is a serious threat to public health in China and the death rate of patients with liver cancer in China is the highest in the world. Beyond surgery, chemotherapy and radiotherapy, immunotherapy is an emerging treatment for cancer, which could control and kill tumor cells by relieving the inhibitory status of immune cells in the tumor microenvironment and activating the immune function of the body. Immune checkpoint inhibitors, adoptive immunotherapy and tumor vaccine are the major treatments of immunotherapy. Compared with traditional therapy methods, immunotherapy could enhance immune function, delay tumor progression, prolong the survival time of patients, and becomes a hotspot in the basic and clinical cancer research. This article reviews the research progress of immunotherapy for liver cancer.

hepatocellular carcinoma, immunotherapy, immune checkpoint treatment, adoptive immunotherapy, tumor vaccine

July 27, 2019;

September 9, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 81602644), Basic Scientific Research Operating Expenses for Central Universities (No. buctrc201910), National Key Research and Development Program (No. 2017YFA0105900).

s: Zhao Yang. Tel: +86-10-64438058; E-mail: yangzhao@mail.buct.edu.cn

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國家自然科學基金 (No. 81602644)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費(No. buctrc201910)，國家重點研發(fā)計劃(No. 2017YFA0105900) 資助。

(本文責編 陳宏宇)