DNA組裝技術(shù)

常漢臣，王琛，王培霞，周見庭，李炳志

生物工程與大健康

李炳志 天津大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目、國(guó)家基金委優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目、天津市杰青基金等。已在、、、、等國(guó)際期刊發(fā)表SCI論文70余篇；申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專利40余項(xiàng)，授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利20項(xiàng)，國(guó)際PCT專利1項(xiàng)。2017年入選教育部長(zhǎng)江青年學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃，2015年獲得第二屆“閔恩澤能源化工獎(jiǎng)”青年進(jìn)步獎(jiǎng)，2017年獲得世界華人化工大會(huì)杰出青年獎(jiǎng)，2018年獲得侯德榜化工科技青年獎(jiǎng)。擔(dān)任SCI期刊客座編輯、編委、生物技術(shù)綜合類新期刊的編委。

DNA組裝技術(shù)

常漢臣1,2，王琛1,2，王培霞1,2，周見庭1,2，李炳志1,2

1 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津 300072 2 天津大學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)科學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072

DNA組裝是合成生物學(xué)研究的核心技術(shù)。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，研究者開發(fā)了依賴于DNA聚合酶或DNA連接酶的不同DNA組裝技術(shù)；為了降低組裝成本和便于實(shí)現(xiàn)DNA組裝的自動(dòng)化，也發(fā)展了一些非酶依賴的DNA組裝技術(shù)；而幾百kb到Mb的大片段DNA的組裝則多數(shù)依賴于微生物體內(nèi)重組。文中主要綜述了酶依賴、非酶依賴和體內(nèi)同源重組三類DNA組裝技術(shù)及其發(fā)展情況。

合成生物學(xué)，DNA組裝，酶依賴，同源重組，合成

合成生物學(xué)旨在應(yīng)用工程學(xué)的研究思路及手段去設(shè)計(jì)改造基因元件、生物途徑，甚至合成基因組[1]，是一個(gè)綜合了科學(xué)與工程的新興研究領(lǐng)域，在生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源及環(huán)保等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。DNA組裝方法是整個(gè)合成生物學(xué)的基礎(chǔ)[2]。合成生物學(xué)依賴于將組裝的特定DNA片段導(dǎo)入底盤內(nèi)發(fā)揮功能來(lái)實(shí)現(xiàn)意圖，因此，高效的DNA組裝是合成生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)之一。隨著生物科學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)需要調(diào)控的基因功能需求越來(lái)越大，DNA長(zhǎng)度一般情況下與其功能多少是正相關(guān)的，這就對(duì)DNA組裝技術(shù)提出了越來(lái)越高的要求。尤其是近年來(lái)快速發(fā)展的基因組設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域，更是需要超大DNA片段的組裝技術(shù)的支撐。文中將主要從幾種常用和近期發(fā)展的DNA組裝技術(shù)展開闡述。

1 酶依賴的DNA組裝

1.1 基于DNA聚合酶的DNA組裝

19世紀(jì)80年代中期，PCR的發(fā)明為依賴于DNA聚合酶的DNA組裝技術(shù)的興起與發(fā)展創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)[3-4]。依賴于DNA聚合酶的DNA組裝方法主要是利用DNA聚合酶的外切活性和聚合作用可以高效地將幾個(gè)DNA片段組裝在一起，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出幾種比較常用的技術(shù)，如聚合酶循環(huán)組裝技術(shù)、重疊延伸PCR技術(shù)等。

聚合酶循環(huán)組裝 (Polymerase cycling assembly，PCA) 是基于PCR技術(shù)，可將10?20條長(zhǎng)度為40?70 bp的寡核苷酸片段組裝成長(zhǎng)片段。PCA組裝的基本思路是將可化學(xué)合成的寡核苷酸通過無(wú)模板PCR組裝成短的DNA片段。1989年，Pease等[5]提出重疊延伸PCR技術(shù) (Overlap extension polymerase chain reaction，OE-PCR)，這種方法可以用于組裝更長(zhǎng)片段的DNA。OE-PCR示意圖如圖1所示，將末端具有重疊序列的DNA片段通過變性、退火，然后互為引物，經(jīng)聚合酶延伸得到融合的DNA，一般可以將2?6 個(gè)DNA片段按比例混合作為模板，以最外側(cè)兩端的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行重疊延伸，同時(shí)要保證相鄰的兩個(gè)DNA片段之間有20?40bp的同源重疊區(qū)。由于OE-PCR方法操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[6]。2003年，Smith等[7]將連接酶拼接法 (Ligase chain reaction，LCR) 與重疊延伸 PCR法相結(jié)合，合成了噬菌體φX174基因組全長(zhǎng)序列 (5386 bp)。

圖1 OE-PCR方法示意圖(將待組裝的兩個(gè)DNA片段分別用一對(duì)引物通過PCR擴(kuò)增，使PCR產(chǎn)物之間有同源區(qū)段。接著，用F1和R2引物通過PCR擴(kuò)增得到完整雙鏈目的片段)

1.2 基于核酸內(nèi)切酶的組裝

1.2.1 BioBrick技術(shù)

BioBrick最初是由美國(guó)麻省理工學(xué)院的Knight研究組于2003年提出，BioBrick方法示意圖如圖2所示。該方法是利用一對(duì)同尾酶和兩個(gè)非同尾酶來(lái)將載體和DNA元件標(biāo)準(zhǔn)化，形成元件庫(kù)；標(biāo)準(zhǔn)化的元件可以通過DNA連接酶作用根據(jù)順序依次組裝起來(lái)[8]。同尾酶是一類基因工程重要的工具酶，在發(fā)揮作用時(shí)識(shí)別的位點(diǎn)不相同，但是酶切之后形成的粘性末端是相同的。常用的同尾酶有：Ⅰ/Ⅰ/Ⅰ、HⅠ/Ⅱ、Ⅰ/Ⅰ等。

基于同尾酶酶切的連接組裝方法根據(jù)所使用的同尾酶和非同尾酶的數(shù)量又可以分為BioBrick、BglBrick和ePathBrick。此類方法興起以后產(chǎn)生了一大批合成生物學(xué)領(lǐng)域非常有價(jià)值的生物組件和途徑，推動(dòng)了合成生物學(xué)的發(fā)展[9-11]。這種方法的優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)現(xiàn)元件的標(biāo)準(zhǔn)化和即插即用。但是兩個(gè)DNA元件之間有6 bp的殘痕，元件組裝通量較低[12]。針對(duì)這種方法存在的問題，科學(xué)家們想出了兩種方案，即BglBrick和ePathBrick，其主旨都是將殘痕轉(zhuǎn)化為融合蛋白的連接肽[13-14]。其中BglBrick采取多基因共表達(dá)的策略，要求每個(gè)基因都帶有自身的表達(dá)元件，最后利用限制性同尾酶將各個(gè)元件串聯(lián)起來(lái)，獨(dú)立進(jìn)行表達(dá)。Anderson等使用一對(duì)同尾酶(Ⅱ和HⅠ)、非同尾酶(RⅠ和Ⅰ) 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化組裝載體，巧妙地將這6 bp殘痕設(shè)計(jì)為兩個(gè)氨基酸，既解決了DNA殘痕問題，又實(shí)現(xiàn)了融合蛋白構(gòu)建，可謂一舉兩得[15]。

1.2.2 Golden Gate技術(shù)

Golden Gate 組裝是利用ⅡS類限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不同的特性，靈活設(shè)計(jì)不同的粘性末端，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)組裝多個(gè)DNA片段，如圖3所示。這一方法通過一步酶切連接，可以高效地構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，從而實(shí)現(xiàn)多片段一步法無(wú)縫連接[16-18]。Engler等[19]利用上述原理結(jié)合基因改組技術(shù)(Gene shuffling)，創(chuàng)造性地一次性完成了3個(gè)片段與載體的拼接，構(gòu)建了理論上可達(dá)19 683種不同的重組胰蛋白酶原基因，以篩選高效表達(dá)的胰蛋白酶突變體。中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院在此技術(shù)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了YeastFab和EcoExpress兩個(gè)組裝系統(tǒng)，拼接效率可達(dá)90%以上，主要用于工程細(xì)胞的代謝通路優(yōu)化和蛋白表達(dá)[20-21]。

圖2 BioBrick方法示意圖(SpeⅠ和XbaⅠ是一對(duì)同尾酶，用SpeⅠ和XbaⅠ分別酶切DNA片段后得到的粘性末端相同，堿基互補(bǔ)之后原酶切位點(diǎn)也消失，片段成功組裝)

圖3 Golden Gate方法示意圖(RFP全稱是Red Fluorescent Protein. 帶有RFP基因的載體在組裝過程有助于初步篩選陽(yáng)性克隆子. BsaⅠ是ⅡS類限制性核酸內(nèi)切酶.用其分別切割帶有基因1、基因2、RFP的載體，得到帶有粘性末端的片段和載體. 最后，通過連接酶成功將基因1和基因2組裝到原帶有RFP的載體上)

除此之外，近幾年一些新發(fā)展的基于核酸內(nèi)切酶的組裝方法，如MASTER技術(shù)[22]、不完全依賴于重疊序列的拼接方法USER[23]、PSA技術(shù)[24]，提升了科研人員操作DNA的能力，部分方法已經(jīng)應(yīng)用到合成生物學(xué)的各個(gè)方面[25]。

1.3 基于核酸外切酶的組裝

1.3.1 Gibson組裝技術(shù)

Gibson組裝是2009年由Gibson開發(fā)，進(jìn)行DNA多片段體外一步拼接的技術(shù)[26]。Gibson組裝方法示意見圖4，在反應(yīng)體系中加入核酸外切酶、Pusion DNA聚合酶和DNA連接酶，50 ℃下反應(yīng)60 min即可完成組裝。Gibson組裝可以實(shí)現(xiàn)無(wú)縫拼接，而且組裝尺度可以達(dá)到百kb大小。Gibson等[27]通過調(diào)節(jié)酶比例成功組裝成163 kb的小鼠線粒體基因。

1.3.2 SLIC組裝技術(shù)

SLIC組裝方法是利用T4 DNA聚合酶的外切活性，產(chǎn)生不同單鏈DNA末端，然后采用單鏈退火或RecA介導(dǎo)的體外重組，一次反應(yīng)可以拼接5?10個(gè)DNA片段，SLIC組裝方法示意圖如 圖5所示。SLIC一次性的組裝較多片段時(shí)，需要片段之間有比較長(zhǎng)的重疊區(qū)。SLIC法可進(jìn)行多片段的平行組裝，是構(gòu)建生物途徑的重要技術(shù)[28]。

圖4 Gibson組裝方法示意圖(利用T5核酸外切酶的5’外切酶活性酶切片段A和片段B，然后Phusion DNA聚合酶催化填補(bǔ)空缺，Taq連接酶修補(bǔ)切口)

2009年，Elledge研究組[29]就是利用該方法成功實(shí)現(xiàn)了9個(gè)275?980 bp長(zhǎng)度的DNA片段的一步拼接。后來(lái)，科學(xué)家又提出了SLIC組裝方法的改進(jìn)版SLiCE組裝方法。SLICE與SLIC的不同在于它不需要額外的聚合酶和DNA連接酶，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力[30]。

2 非酶依賴的DNA組裝

雖然酶依賴的DNA組裝方法有高效、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，但也有其缺陷。比如，商業(yè)化限制性內(nèi)切核酸酶的數(shù)量有限，大的基因片段有時(shí)很難找到合適的限制性酶切位點(diǎn)等。而非酶依賴的DNA組裝方法在沒有酶的情況下也能實(shí)現(xiàn)DNA組裝且成本較低，在高通量組裝實(shí)驗(yàn)條件下，非酶組裝優(yōu)勢(shì)明顯。非酶依賴的DNA組裝技術(shù)主要有TPA技術(shù)和EFC技術(shù)等。

2.1 EFC技術(shù)

EFC (Enzyme-free cloning) 組裝技術(shù)，是一種非酶依賴的DNA組裝方法[31]。該技術(shù)不受限于限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，具有快速可靠、簡(jiǎn)便高效的優(yōu)點(diǎn)。該方法利用帶尾引物使插入的片段與載體在PCR變性反應(yīng)之后交錯(cuò)互補(bǔ)。具體來(lái)說(shuō)就是對(duì)載體和片段分別進(jìn)行兩次PCR。雖然都是PCR，但是所用的引物是有區(qū)別的。一次PCR所用引物是用5?短和3?長(zhǎng)(尾) 引物，另一次PCR則使用5?長(zhǎng)和3?短引物；長(zhǎng)引物與短引物之間的區(qū)別在于長(zhǎng)引物多了12?15 bp的尾巴。4次PCR過后兩個(gè)非同源的待插入片段分別與兩個(gè)載體中的一個(gè)互補(bǔ)，從而確保所需片段的定向克隆。將4種PCR產(chǎn)物的等摩爾體積混合，熱變性和重新退火；從得到的產(chǎn)物中選擇所需要的低溫退火，最后得到目的片段。EFC方法示意圖見圖6。

圖5 SLIC組裝方法示意圖(用一對(duì)帶有重疊序列的特異性引物擴(kuò)增目的基因，用限制性內(nèi)切酶或PCR擴(kuò)增得到線性化質(zhì)粒；接著，T4 DNA聚合酶分別處理PCR擴(kuò)增得到的目的基因和線性化質(zhì)粒，產(chǎn)生5?突出端的粘性末端；最后，目的基因和線性化質(zhì)粒經(jīng)過重疊序列間的退火，得到帶有“缺口”的環(huán)狀質(zhì)粒)

Fig. 5 Schematic diagram of the SLIC assembly method. The target gene is amplified by a pair of specific primers with overlapping sequences, and the linearized plasmid is amplified by restriction endonuclease or PCR; then, the target gene and linearized plasmid obtained by PCR amplification are respectively treated by T4 DNA polymerase. The sticky end of the 5? overhang is generated; finally, the target gene and the linearized plasmid are annealed between the overlapping sequences to obtain a circular plasmid with a “nick”.

2.2 TPA技術(shù)

2017年，趙惠民教授的科研團(tuán)隊(duì)[32]提出一種高效準(zhǔn)確的多片段DNA組裝方法(具體組裝流程見圖7)，即Twin-primer non-enzymatic DNA assembly (TPA)。該組裝方法在不使用酶的情況下能夠?qū)⒕酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的片段組裝成質(zhì)粒，并且不留下疤痕。盡管在整個(gè)過程中都沒有酶的參與，但是該方法的效果卻可以和最佳的體外組裝方法相當(dāng)。具體操作分為兩步：在第一步中，設(shè)計(jì)長(zhǎng)上引物和短下引物以及短上引物和長(zhǎng)下引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別對(duì)片段進(jìn)行擴(kuò)增，長(zhǎng)引物的設(shè)計(jì)為片段擴(kuò)增出片段之間的同源區(qū)段。值得注意的是第一步中產(chǎn)生了不需要的擴(kuò)增片段，需剔除。第二步中，將第一步中得到的正確的擴(kuò)增片段通過退火組裝成一個(gè)質(zhì)粒，驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)化到菌內(nèi)。

3 依賴于體內(nèi)同源重組的DNA組裝

盡管體外拼裝的片段大小已經(jīng)可達(dá)幾百kb，但是所得的量依然不足以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[33]。微生物體內(nèi)的同源重組使高效組裝更大的DNA片段成為可能。同源重組是借由重組酶的催化作用，通過兩個(gè)具有同源序列DNA分子間的交換，從而使序列發(fā)生重組。這種生物學(xué)現(xiàn)象在自然界正常細(xì)胞體內(nèi)普遍存在。而基于同源重組的DNA組裝是人工控制同源重組酶的酶切和交換功能，在體內(nèi)把同源片段重組的組裝方法。該方法是非常重要的遺傳操作技術(shù)，廣泛應(yīng)用于DNA元件的組裝、克隆、置換、敲除、突變等。常用的同源重組工具菌株包括釀酒酵母和枯草芽孢桿菌。

3.1 TAR技術(shù)

釀酒酵母具有高效同源重組的能力，已經(jīng)發(fā)展了TAR (Transformation-associated recombination) 技術(shù)。TAR組裝方法示意見圖8。酵母的同源重組可以組裝寡核苷酸，也能組裝很長(zhǎng)的DNA片段，乃至細(xì)菌的基因組。

圖6 EFC組裝方法示意圖

圖7 TPA組裝方法示意圖

2008年，Venter研究組[34]利用該方法在釀酒酵母體內(nèi)完成了對(duì)生殖道支原體基因組(582 970 bp) 的最后一步組裝。2010年，他們又成功完成了大小為1 080 Mb 的絲狀支原體基因組在釀酒酵母體內(nèi)的同源組裝[35]。Shao等[36]采用類似的“DNA Assembler”法將兩個(gè)生物合成途徑共8個(gè)基因構(gòu)建到一個(gè)載體上，并成功地檢測(cè)到了代謝產(chǎn)物。2017年，由酵母基因組合成計(jì)劃SC2.0聯(lián)盟成員完成了釀酒酵母5 條染色體的人工設(shè)計(jì)與合成，主要是利用了釀酒酵母同源重組能力實(shí)現(xiàn)了合成染色體片段對(duì)野生染色體片段的替換[37-43]。酵母細(xì)胞內(nèi)組裝可廣泛應(yīng)用于基因元件、代謝途徑和基因組的組裝，為后續(xù)的科學(xué)研究提供良好的材料。

3.2 CasHRA技術(shù)

CasHRA技術(shù)是由中國(guó)科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所覃重軍研究員團(tuán)隊(duì)開發(fā)的。這種方法能夠在體內(nèi)有效組裝多個(gè)大DNA片段。主要是利用RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶切割早先引入釀酒酵母中的大的環(huán)狀DNA，從而使環(huán)狀DNA變成線性，最終利用內(nèi)源性同源重組系統(tǒng)進(jìn)行組裝。該課題組將此方法與上游裝配方法相結(jié)合，成功構(gòu)建了一個(gè)包含449個(gè)必需基因和267個(gè)重要生長(zhǎng)基因的1.03 Mb MGE-syn1.0 (Minimal genome of)[44]。該方法將對(duì)兆堿基大小的基因組的構(gòu)建產(chǎn)生深刻的影響。

圖8 TAR技術(shù)合成基因示意圖

3.3 枯草芽孢桿菌體內(nèi)的同源重組

枯草芽孢桿菌中也有強(qiáng)大的重組系統(tǒng)。利用枯草體內(nèi)的重組系統(tǒng)同樣可將兩端帶同源序列的片段通過重組的方法連接起來(lái)。2005年，Itaya等[45]將3.5 Mb的集胞藻PCC6803的基因組成功克隆到4.2 Mb的枯草芽孢桿菌基因組中，所用方法被稱為“蠕動(dòng)延伸法”。在此方法的基礎(chǔ)上，Itaya等[46]進(jìn)一步開發(fā)了一種新的“多米諾法”，利用這種方法成功合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因組以及134.5 kb的水稻葉綠體基因組。這種方法所用的底盤細(xì)胞是整合了pBR322序列的枯草芽孢桿菌。所用策略是將待合成的基因拆分成帶有同源區(qū)段的5 kb片段，然后分別將其構(gòu)建到不同的載體上，通過逐步替換，將所有的片段和抗性整合到枯草芽孢桿菌的BGM載體位點(diǎn)。這種組裝方法由于需較長(zhǎng)的同源臂以及耗費(fèi)時(shí)間，目前未得到普遍使用。

除酵母和枯草芽孢桿菌可以利用自身的同源重組酶組裝大片段的DNA之外，部分細(xì)菌通過超表達(dá)T4連接酶或整合λ Red重組系統(tǒng)也能夠介導(dǎo)大片段DNA的胞內(nèi)組裝。將待組裝的DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)即可進(jìn)行組裝，通過篩選可得到目的片段。

3.4 Cre/loxP介導(dǎo)的DNA體內(nèi)組裝

Cre/loxP重組酶系統(tǒng)是由Sternberg和Hamilton提出。Cre是一種來(lái)源于P1噬菌體的重組酶，Cre 重組酶在沒有輔助因子的情況下催化2個(gè)loxP 位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)[47]。loxp是一段長(zhǎng)度為34 bp的DNA序列，由2個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和1個(gè)8 bp的不對(duì)稱間隔區(qū)所分隔的回文結(jié)構(gòu)組成，其是重組酶介導(dǎo)重組反應(yīng)所必需的條件[48]。Cre重組酶根據(jù)2個(gè)loxP位點(diǎn)的排列方向介導(dǎo)4種不同的重組方式：1) 刪除。當(dāng)同一條DNA分子上的2個(gè)loxP位點(diǎn)的排列方向相同時(shí)，則可能出現(xiàn)2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的基因被刪除的情況，最終只剩下一個(gè)loxP位點(diǎn)，這種方式是Cre/loxP重組酶系統(tǒng)最主要的作用方式。2) 交叉。如果基因組中的不同DNA分子上各有l(wèi)oxP位點(diǎn)時(shí)，可能出現(xiàn)loxP位點(diǎn)前后基因發(fā)生交叉換位。3) 移位。當(dāng)基因兩端的loxP位點(diǎn)方向相同時(shí)，則可能發(fā)生移位，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置上單獨(dú)的loxP位點(diǎn)上。4) 顛倒。同一條DNA分子上2個(gè)loxP位點(diǎn)方向相反時(shí)，則2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的基因可能會(huì)發(fā)生顛倒。Cre/loxP重組酶系統(tǒng)不受制于位置以及片段長(zhǎng)度，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)組裝、體外應(yīng)用中。體外應(yīng)用聚焦于高通量DNA克隆和腺病毒載體構(gòu)建[49-50]，體內(nèi)的應(yīng)用則主要集中于基因的替換和敲除以及染色體畸變[51-52]，擁有廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

合成生物學(xué)近幾年得到了飛躍式的發(fā)展，不同尺度的DNA 組裝方法相繼誕生，為我們不斷探索更長(zhǎng)的片段組裝提供了可能，特別是超大DNA的組裝也越來(lái)越成為可能。不同的組裝技術(shù)具有不同的適用性，通常的策略都是幾項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)合使用。學(xué)科交叉也一定程度上推動(dòng)了DNA組裝技術(shù)的發(fā)展。但還是存在一些問題需要我們?nèi)ソ鉀Q。一方面是雖然目前我們組裝的片段長(zhǎng)度越來(lái)越長(zhǎng)，但還是有一定的限制，需要開發(fā)更加高效的組裝方法。近些年不斷發(fā)展的DNA酶法合成技術(shù)為實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)DNA片段的直接合成提供了良好的思路，其是一種高效、低耗的DNA合成方案，值得不斷地去研究與拓展。另一方面DNA片段在連接過后可能會(huì)有疤痕存在，可能會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響，同時(shí)，組裝的準(zhǔn)確度和可調(diào)性也需要我們不斷去探索更好的方法去解決。這就需要在深入揭示相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)上，不斷開 發(fā)新的分子生物學(xué)技術(shù)，各類組裝技術(shù)的特點(diǎn) 見圖9。

圖9 組裝技術(shù)的總結(jié)

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DNA assembly technologies: a review

Hanchen Chang1,2, Chen Wang1,2, Peixia Wang1,2, Jianting Zhou1,2, and Bingzhi Li1,2

1 Frontier Science Center for Synthetic Biology, Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

DNA assembly is the core technology of synthetic biology. With the development of synthetic biology, researchers have developed different DNA assembly technologies that rely on DNA polymerase or DNA ligase, and also have developed some non-enzyme-dependent DNA assembly techniques to facilitate the automation of DNA assembly. The assembly of large fragments of DNA from a few hundred kb to Mb is mostly dependent on microbial recombination. In this paper, the three types of DNA assembly technologies, including enzyme-dependent, non-enzymatic andhomologous recombination, are reviewed.

synthetic biology, DNA assembly, enzyme-dependent, homologous recombination, synthesis

June 24, 2019;

August 30, 2019

National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0900100).

s:Bingzhi Li. Tel: +86-22-27402503; E-mail: bzli@tju.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 2018YFA0900100)資助。

2019-10-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191010.0937.002.html

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(本文責(zé)編 陳宏宇)