IL-17在鼻息肉形成中的作用機制

董慶喆，李慎玲，連媛媛，徐禛，張念凱，姜曉丹

摘要：目的 ?檢測白介素-17（IL-17）及其受體（IL-17R）在鼻息肉和正常鼻黏膜中的表達及IL-17在鼻息肉患者血清中的表達，觀察IL-17 在鼻息肉發(fā)病過程中可能的作用機制和意義。方法 ?鼻息肉組織及血清標(biāo)本來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除術(shù)的42例患者，選取10例同期行上頜竇囊腫手術(shù)切除的正常中鼻道黏膜組織作為正常鼻粘膜對照，10例健康成年人血清作為正常對照。HE 染色用于常規(guī)組織病理學(xué)檢查，免疫組織化學(xué)染色觀察IL-17及其受體表達水平及部位，雙重免疫組織化學(xué)染色觀察表達IL-17的細胞，ELISA法檢測血清中IL-17蛋白表達水平。結(jié)果 ?①42例鼻息肉組織中IL-17和IL-17R陽性細胞數(shù)較正常鼻黏膜組織中多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;巨噬細胞表面標(biāo)志（CD68）在鼻息肉組織中的表達比正常鼻黏膜組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。②IL-17及CD68雙重免疫組化染色顯示IL-17主要表達于鼻息肉巨噬細胞上，IL-17R主要表達于上皮層基底細胞、腺管基底細胞及血管內(nèi)皮細胞。③42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平和健康成年人比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ?IL-17對鼻息肉的形成作用可能是通過影響巨噬細胞的功能及相關(guān)細胞因子實現(xiàn)的，IL-17與IL-17受體的相互作用可能參與鼻息肉的病理改變，如上皮細胞基底膜增厚及腺體增生等。

關(guān)鍵詞：鼻息肉;白介素-17受體;巨噬細胞

中圖分類號：R765.25 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.019

文章編號：1006-1959（2019）22-0059-04

The Mechanism of Action of IL-17 in the Formation of Nasal Polyps

DONG Qing-zhe1，LI Shen-ling2，LIAN Yuan-yuan2，XU Zhen2，ZHANG Nian-kai2，JIANG Xiao-dan2

（Department of Biological Specimen1，Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2，

Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective ?To detect the expression of interleukin-17 （IL-17） and its receptor （IL-17R） in nasal polyps and normal nasal mucosa and the expression of IL-17 in serum of patients with nasal polyps， and to observe the incidence of IL-17 in nasal polyps. Possible mechanisms and implications of the process. Methods ?Nasal polyps and serum samples were obtained from 42 patients with ENT， from November 2016 to November 2017 in the Department of Otorhinolaryngology， Affiliated Hospital of Qingdao University. Ten normal nasal mucosa were removed from the maxillary sinus cyst. Tissue was used as a normal nasal mucosa control and 10 healthy adult sera were used as normal controls. HE staining was used for routine histopathological examination. The expression level and location of IL-17 and its receptor were observed by immunohistochemical staining. The cells expressing IL-17 were observed by double immunohistochemical staining. The serum IL-17 protein expression was detected by ELISA level.Results ?①The number of IL-17 and IL-17R positive cells in 42 cases of nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of macrophage surface marker （CD68） in nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）.②IL-17 and CD68 double immunohistochemical staining showed that IL-17 was mainly expressed on nasal polyp macrophages， and IL-17R was mainly expressed in epithelial basal cells， glandular basal cells and vascular endothelial cells.③There was no significant difference in serum IL-17 protein levels between 42 patients with nasal polyps and healthy adults （P>0.05）. Conclusion ?The formation of IL-17 on nasal polyps may be achieved by affecting the function of macrophages and related cytokines. The interaction of IL-17 with IL-17 receptor may be involved in the pathological changes of nasal polyps membrane thickening and glandular hyperplasia.

Key words：Nasal polyps;Interleukin-17 receptor;Macrophage

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一種常見病，發(fā)病率及復(fù)發(fā)率均較高，其致病機制至今尚未明確，目前普遍認為是多因素共同作用的結(jié)果，如感染性因素、嗜酸性粒細胞浸潤及鼻變態(tài)反應(yīng)等。近年來，Th17細胞被認為是一個獨立的輔助T細胞亞群，以分泌IL-17A（亦稱IL-17）為主要特征[1]。IL-17A是IL-17家族（IL-17A-F）的基礎(chǔ)成員，是一種致炎細胞因子，可以促進T細胞的激活和刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產(chǎn)生多種致炎因素，包括IL-1β、IL-6、IL-8、誘導(dǎo)性NO合酶、環(huán)氧化酶2、前列腺素E2[2]，而這些因子與鼻息肉的發(fā)病均有著密切的關(guān)系。IL-17在腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNAF6）參與下與IL-17受體結(jié)合，激活核因子κB（NFκB）和活化蛋白-1，進而調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的活性[3]。基于此，本研究通過對鼻息肉組織中及鼻息肉患者血清中的IL-17進行檢測，旨在探討其在鼻息肉發(fā)病中的作用。

1材料與方法

1.1材料來源 ?鼻息肉組織標(biāo)本來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除術(shù)的42例患者。其中男25 例，女17 例，年齡17～68歲，平均年齡（38.27±14.38）歲，均無過敏、支氣管哮喘及阿司匹林耐受不良病史，術(shù)前2周無應(yīng)用類固醇激素史。10例鼻黏膜對照組織來自同期因上頜竇囊腫行手術(shù)切除的正常中鼻道黏膜組織，其中男8例，女2例，年齡31～49歲，平均年齡（38.20±8.06）歲。鼻息肉患者血清標(biāo)本來自上述42例鼻息肉患者，10例正常對照組血清來自同期我院體檢中心的健康體檢人員，其中男性6例，女性4例，年齡20～50歲，平均年齡（37.26±7.14）歲。本研究所有操作均取得研究對象同意，簽署同意書，并經(jīng)過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2試劑 ?兔抗人IL-17多克隆抗體來自Santa Cruz Biotech公司，羊抗人IL-17受體多克隆抗體來自R&D Systems Inc公司;鼠抗人CD68單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)公司;人IL-17 ELISA 試劑盒（96孔板）購自Biosource 公司;雙重免疫組化試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3檢測方法

1.3.1 SP免疫組化染色 ?所有組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做4 μm 厚的連續(xù)切片。按照產(chǎn)品說明書采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶（SP）技術(shù)對標(biāo)本進行常規(guī)免疫組化染色，一抗分別滴加IL-17多克隆抗體、IL-17受體多克隆抗體及CD68單克隆抗體。二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色，Mayer 蘇木素復(fù)染，封片。以胞漿或胞膜有棕黃色染色者為陽性細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.3.2雙重免疫標(biāo)記 ?選擇10例 IL-17高表達的病例，用雙重免疫標(biāo)記方法確認 IL-17陽性表達的細胞類型。免疫組化步驟同前，但分2次滴加一抗，先滴CD68單克隆抗體，行堿性磷酸酶染色，陽性細胞胞質(zhì)為藍色。再滴加 IL-17多克隆抗體，行過氧化物酶染色，陽性細胞胞質(zhì)為猩紅色，同時表達CD68和IL-17的陽性細胞胞質(zhì)為暗紫色。Mayer蘇木素復(fù)染，封片。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗 ?所有外周血靜置30～60 min，3000 r/min，離心15 min，分離得血清，-80℃凍存。嚴格按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書操作流程行血清中IL-17 蛋白水平檢測，用ELISE檢測儀測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出檢測血清中IL-17蛋白濃度。

1.4結(jié)果判定 ?所有切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，IL-17、IL-17受體及CD68 陽性染色呈褐色，觀察其在鼻息肉組織和對照組織中表達水平及部位。每個切片中隨機選取10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù)，取各視野陽性細胞表達的平均數(shù)作為陽性細胞表達率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 ?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，使用（x±s）表示，比較行t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 IL-17表達比較 ?IL-17陽性反應(yīng)呈棕褐色，主要存在于細胞漿。在鼻息肉組織中，IL-17 主要表達于較大的單個核細胞的細胞漿，少量表達于多形核細胞及漿細胞的細胞漿、棘細胞層上皮細胞，見圖1。鼻息肉中IL-17陽性細胞數(shù)（6.33±1.98）個，較正常鼻黏膜組織中的（2.06±1.02）個多，見圖2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.286，P<0.05）。

2.2 CD68 表達比較 ?CD68陽性反應(yīng)呈褐色，主要存在于細胞漿，均為較大的單個核細胞，少數(shù)為多形核細胞，呈散在分布，見圖3。鼻息肉組織中巨噬細胞（CD68）陽性細胞數(shù)為（5.36±1.34）個，較正常鼻黏膜組織中的（1.49±0.52）個多，見圖4，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.641，P<0.05）。雙重免疫標(biāo)記結(jié)果：CD68 及IL-17 同時標(biāo)記于一種較大細胞的胞質(zhì)中，呈暗紫色，此細胞為巨噬細胞，見圖5。

2.3 IL-17R表達比較 ?IL-17R 陽性反應(yīng)呈棕褐色，主要存在于細胞膜及細胞漿。在鼻息肉組織中，IL-17R主要表達于上皮層基底細胞膜、腺管基底細胞及小血管內(nèi)皮細胞，見圖6、圖7。鼻息肉中IL-17R陽性細胞數(shù)為（11.34±2.33）個，較下鼻甲中的（2.52±0.77）個多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.352，P<0.05）。

2.4血清中IL-17 表達比較 ?42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白濃度為（84.74±11.47）pg/ml，與正常對照組的（87.27±9.65）pg/ml比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.646，P>0.05）。

3討論

鼻息肉是由復(fù)雜的多因素、多基因共同作用的結(jié)果，其本質(zhì)是鼻黏膜的慢性炎性病變。嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞及上皮細胞均可參與激活、釋放、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種細胞因子、生長因子等，通過多種方式調(diào)節(jié)炎性過程，導(dǎo)致鼻息肉形成[4]。

IL-17主要由活化的Th17細胞產(chǎn)生，Th17細胞近來被認為是一個獨立的輔助T細胞亞群，以分泌IL-17為主要特征。Th17細胞在防御胞外微生物感染、介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[1]。研究認為鼻息肉多數(shù)表達為Th2反應(yīng)細胞因子（高水平IL-5）和嗜酸細胞標(biāo)志物（嗜酸細胞陽離子蛋白-ECP、嗜酸細胞活化趨化因子-eotaxin）以及IgE的增高。隨著對Th17細胞的深入研究[5]，Th1/Th2/Th17的免疫平衡機制在鼻息肉形成機制中的作用還有待深入研究。

鼻息肉是鼻黏膜的慢性炎癥性疾病，組織學(xué)特征是大量的炎性細胞浸潤，包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞等。上皮層和固有層的改變，例如杯狀細胞增生、細胞外基質(zhì)蛋白沉積、水腫、腺體增生和基底膜增厚[6]。IL-17是一種致炎細胞因子，可以促進T 細胞的激活和刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產(chǎn)生多種致炎因素[2，3]，這些因子與鼻息肉的發(fā)病均有著密切的關(guān)系。IL-17在TNAF6參與下與IL-17受體結(jié)合，激活NFκB和活化蛋白-1，進而調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的活性[3]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17主要表達于巨噬細胞，而巨噬細胞作為粘膜固有層內(nèi)重要的免疫效應(yīng)細胞，具有非特異性殺傷作用及抗原遞呈作用，還可以合成和分泌多種細胞因子如白細胞介素1及6、腫瘤壞死因子（TNF）等[7]。本研究證實IL-17 主要表達于鼻息肉組織的巨噬細胞，且表達量較正常鼻黏膜組織明顯增多，提示IL-17可能通過影響巨噬細胞的功能及相關(guān)細胞因子的作用，影響鼻息肉的免疫及炎癥狀態(tài)。此外，本研究結(jié)果顯示，鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平與健康對照組基本一致，進一步說明IL-17 在鼻息肉的形成過程中發(fā)揮一種局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)。而這種局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)可能通過巨噬細胞及相關(guān)細胞因子實現(xiàn)的。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)IL-17受體特異性強表達于上皮層基底細胞及腺管基底細胞，提示IL-17與IL-17R 的相互作用可能參與鼻息肉腺體增生和基底膜增厚等病理改變，從而促進鼻息肉的生長，亦提示Th17細胞可能參與鼻息肉的病理改變。

綜上所述，IL-17及其受體與鼻息肉的發(fā)病有一定關(guān)系，IL-17可能通過影響巨噬細胞的功能及相關(guān)細胞因子的作用，影響鼻息肉的免疫及炎癥狀態(tài)。此外，IL-17與IL-17R 的相互作用可能參與鼻息肉的病理改變，如腺體增生及基底膜增厚，可能促進鼻息肉的發(fā)生發(fā)展。

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收稿日期：2019-8-27;修回日期：2019-9-7

編輯/成森